CN108823266A - 一种采用发酵的方法制备几丁质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，以CGMCC No.15668的赭曲霉为菌种，包括一个菌种活化的步骤，一个种子培养的步骤，一个发酵培养的步骤，一个菌体获取的步骤，一个分离提取几丁质的步骤。本发明利用赭曲霉发酵产生几丁质，所用发酵原料无动物来源原料，所以最终获得的几丁质产品无热源污染风险。本发明采用氧化剂对发酵过程进行强化，使最终几丁质产量从2.79g/L提升至6.3g/L。相比虾蟹壳提取工艺，本发明中提取几丁质的工艺，只需采用较低浓度的酸碱即可获取纯度较高的几丁质产品，有效的降低了生产成本和对环境污染的压力，具有一定的工业应用前景。

Description

一种采用发酵的方法制备几丁质的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种几丁质的制备方法，具体来说是一种采用发酵的方法制备几丁质的制备方法。
背景技术
几丁质又称甲壳素(Chitin)是一种无毒无味的白色或灰白色半透明的固体，在水、稀酸、稀碱以及一般的有机溶剂中难以溶解，因而限制了它的应用和发展。后来人们在研究探索中发现，几丁质经浓碱处理脱去其中的乙酰基就变成可溶性几丁质，又称甲壳胺或壳聚糖，它的化学名称为(1-4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，或简称聚胺基葡萄糖。这种壳聚糖由于它的大分子结构中存在大量氨基，从而大大改善了几丁质的溶解性和化学活性，因此使它在医疗、营养、保健和化妆品等领域具有广泛的应用价值。
目前生产几丁质主要有两个方法：(1)虾蟹壳提取法。(2)微生物发酵法。而目前商品化的几丁质的主要来源为虾蟹壳提取法。但利用虾蟹壳制备几丁质存在一些不容忽视的问题：(1)由于生产原料来源受到限制，从不同产地不同批次的虾蟹壳中提取到的几丁质产品，具有品质不稳定，差异较大的特点。(2)由于虾蟹壳中灰分(如钙质)及蛋白质含量较高，提取几丁质过程中需要使用大量较高浓度的酸碱来去除灰分和蛋白，这就造成了对大量酸碱废液的处理压力。
近些年，利用微生物发酵法生产几丁质受到广泛关注。大量的研究主要集中在对高产菌种的选育、发酵工艺的优化及从废旧菌丝体中提取几丁质等方面。但根据目前的资料显示，利用微生物发酵法生产几丁质能实现工业化的实例较少。原因主要还是由于发酵产量较低，生产成本高，难以实现工业化。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种采用发酵的方法制备几丁质的制备方法，所述的这种采用发酵的方法制备几丁质的制备方法要解决现有技术中制备几丁质的方法产率低、成本高，难以实现工业化的技术问题。
本发明提供了一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，包括如下步骤：
1)一个菌种活化的步骤：将保藏的菌种于无菌操作下转接于斜面培养基中，放置于恒温恒湿培养箱中28℃培养5-7天；所述的菌种为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，所述的菌种的保藏号为CGMCC No.15668；
2)一个种子培养的步骤：将步骤1)中的斜面菌种于无菌操作下，刮取黄色孢子并转移至无菌生理盐水中，调整孢子浓度为4.0-7.0×108个孢子/ml，后按照10％的接种量转接于已经灭菌的种子培养基中，于恒温摇床中进行培养，培养条件为：28℃，转速180rpm，培养时间24h；
3)一个发酵培养的步骤：先在发酵培养基中加入过氧化氢溶液，每升培养基加入0.1-1.5ml的过氧化氢溶液，并搅拌均匀，后再将步骤2)中获得的种子培养液无菌操作下按照10％的接种量转接于发酵培养基中，于恒温摇床或发酵罐中进行培养，恒温摇床培养条件为：24-30℃，转速140-200rpm，培养时间36-48h；发酵罐培养条件为：24-30℃，转速100～450rpm，通气量0.4～1.6v/v/min，培养时间24-40h；
4)一个获取菌体的步骤：将步骤3)中所获得的发酵液，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，获得湿菌体，再将湿菌体放置于烘箱中50-90℃烘干至恒重，获得干菌体，对干菌体进行粉碎，获得平均粒度小于40目的菌体粉末；
5)一个对几丁质进行分离提取的步骤：
①「一个酸处理的步骤：将步骤4)中获得的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，加入0.1-1.0mol/L的盐酸溶液进行处理，加入后的固液比1:10-1:30，处理温度4-40℃，间隔4-8h进行间歇搅拌，搅拌转速100rpm，处理12-36h，然后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；
②「一个碱处理的步骤：将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理，在上述的水溶液中，乙醇的质量百分比浓度为5％-15％，氢氧化钠的质量百分比浓度为2％-10％，加入后的固液比1:10-1:30，处理温度4-40℃，间隔4-8h进行间歇搅拌，搅拌转速100rpm,处理12-36h，然后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；
③「一个进行干燥的步骤：将上述进行酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中45-80℃烘干24-48h，得到的白色粉末即为几丁质。
进一步的，在步骤1)中所用斜面培养基中，每升培养基中含有200g的去皮马铃薯，20g的葡萄糖，20g的琼脂，pH6.4-6.6；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
进一步的，在步骤2)的种子培养基，每升培养基中含有8g的蔗糖，8g的酵母膏，2.0g的糖蜜，pH6.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
进一步的，在步骤3)中的发酵培养基中，每升培养基中含有20-40g的蔗糖，10-30g的酵母膏，3-10g的黄豆粉，0.5-2.0g的糖蜜，1.0-2.0g的K2HPO4，1.0-3.0g的MgSO4·7H2O，0.005-0.02g的FeSO4·7H2O，1.0-2.0g的NaH2PO4·12H2O，pH 5.0-6.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
进一步的，步骤3)中所述过氧化氢溶液的质量百分比浓度为20％。
测定几丁质含量的方法为HPLC法：仪器安捷伦1260，采用氨基柱(250mm×4.6mm，5um)，以乙腈-磷酸盐缓冲液(65:35，pH7.5)为流动相，流速1.0ml/min，柱温30℃,检测波长195nm，进样量10ul。标准品盐酸氨基葡萄糖及乙酰氨基葡萄糖浓度均为10ug/ml。
待测样品处理方法：准确称取待测几丁质粉末0.1g，加入20ml 6mol/盐酸溶液，于90℃水浴中水解60min。水解液稀释适当倍数，检测氨基葡萄糖及乙酰氨基葡萄糖含量，并折算原几丁质样品中几丁质含量。
本发明的一种菌种MF010，分类命名为：赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2018年4月25日，保藏号为CGMCC No.15668。
本发明采用发酵法生产几丁质，并利用外源添加氧化剂的方法促进几丁质的生成，强化几丁质产出及发酵工艺参数的优化，提供一种发酵及提取工艺相对简单，产量较高，产品品质较稳定，环境污染小，生产成本较低的发酵制备几丁质的有效方法。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。(1)本发明利用赭曲霉发酵产生几丁质，所用发酵原料无动物来源原料，所以最终获得的几丁质产品无热源污染风险。(2)采用氧化剂对发酵过程进行强化，使最终几丁质产量从2.79g/L提升至6.3g/L。(3)本发明制备几丁质的方法，具有生产原料不受地域限制，产品品质稳定可控的特点。(4)相比虾蟹壳提取工艺，本发明中提取几丁质的工艺，只需采用较低浓度的酸碱即可获取纯度较高的几丁质产品，有效的降低了生产成本和对环境污染的压力，提取废液较少，后期废液处理成本低，具有一定的工业应用前景。
附图说明
图1为本发明提取到的几丁质与市售几丁质标准品的红外光谱对比图。
图2为本发明提取到的几丁质样品实物图。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但不限制本发明。
实施例1
本发明的保藏菌种分离自上海市奉贤区农田土壤中，通过6代划线分离，得到纯种MF010。该菌株生物学特性为：菌落直径约4.5cm；菌丝体白色，成熟后菌落表面生大量淡黄色至黄色孢子；菌落丝绒状，有放射状沟纹；无渗出液；菌落反面黄褐色或淡红色。分生孢子及分生孢子梗黄色；分生孢子近球形，略粗糙；菌落表面全面可育；最适生长温度28℃；好氧；经过对该菌株18sDNA保守序列进行分子生物学分析，与GenBank中18S rDNA序列同源比较，发现与曲霉属菌株相似度最高达到99％，鉴定其为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，保藏日期为2018年4月25日，保藏号为CGMCC No.15668。
实施例2
(1)斜面培养
将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下吸取一定量菌液均匀涂布于斜面培养基中，28℃恒温培养5-7天。所用斜面培养基中，每升培养基中含有200g的去皮马铃薯，20g的葡萄糖，20g的琼脂，pH6.4-6.6；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
(2)种子培养
所用种子培养基，每升培养基中含有8g的蔗糖，8g的酵母膏，2.0g的糖蜜，pH6.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
将步骤(1)中的斜面菌种，于无菌操作下，刮取黄色孢子并转移至无菌生理盐水中，调整孢子浓度为4.0-7.0×108个孢子/ml，后按照10％接种量转接于已经灭菌的种子培养基中，并于28℃条件下，180r/min培养24h，制得种子液。
(3)发酵培养
所用的发酵培养基，每升培养基中含有20g的蔗糖，10g的酵母膏，3g的黄豆粉，0.5g的糖蜜，1.0g的K2HPO4，1.0g的MgSO4·7H2O，0.005g的FeSO4·7H2O，1.0g的NaH2PO4·12H2O，pH 5.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
准备10瓶容积为250ml的发酵摇瓶(每个发酵瓶含有90ml无菌培养基)，在每个发酵摇瓶中各添加质量百分比浓度为20％的过氧化氢溶液，每升培养基加入0.1ml的过氧化氢溶液，摇匀，吸取步骤(2)中培养好的种子液10ml无菌操作下接种于发酵摇瓶中(10％的接种量)，放置于24℃恒温摇床中，140r/min培养24h。
(4)几丁质提取
将上述步骤(3)所得的发酵液合并后，得1000ml发酵液，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，获得湿菌体。再将湿菌体放置于烘箱中50℃烘干至恒重，获得干菌体12.2g，(发酵液中菌体干重为12.2g/L)。将干菌体经过反复粉碎为小于40目的菌体粉末。
取上述菌体粉末进行如下步骤处理：①酸处理。将菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用122ml盐酸溶液(盐酸浓度0.1mol/L)浸泡，固液比1:10，处理温度4℃，间隔4h间歇搅拌5min，搅拌转速100rpm，处理12h。后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；②碱处理。将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用122ml含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理(乙醇浓度为5％，氢氧化钠浓度为2％)，固液比1:10，处理温度4℃，间隔4h间歇搅拌，搅拌转速100rpm，处理12h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；③干燥。将前述酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中45℃烘干24h，得到白色几丁质粉末3.2g，提取收率为26.25％。经HPLC检测，样品几丁质含量为94.6％。在此条件下，经发酵提取后，最终几丁质的产量为3.2g/L。
实施例3
(1)斜面培养与种子培养
如前述实施例1
(2)发酵培养
所用的发酵培养基，每升培养基中含有30g的蔗糖，20g的酵母膏，8g的黄豆粉，1.0g的糖蜜，1.5g的K2HPO4，1.4g的MgSO4·7H2O，0.01g的FeSO4·7H2O，1.5g的NaH2PO4·12H2O，pH 5.5；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
准备10瓶容积为250ml的发酵摇瓶(每个发酵瓶含有90ml无菌培养基)，在每个发酵摇瓶中各添加质量百分比浓度为20％的过氧化氢溶液，每升培养基加入0.8ml的过氧化氢溶液，，摇匀，吸取步骤(2)中培养好的种子液10ml无菌操作下接种于发酵摇瓶中(10％的接种量)，放置于28℃恒温摇床中，180r/min培养40h。
(3)几丁质提取
将上述步骤(2)所得的发酵液合并后，得1000ml发酵液，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，获得湿菌体。再将湿菌体放置于烘箱中50℃烘干至恒重，获得干菌体13.1g，(发酵液中菌体干重为13.1g/L)。将干菌体经过反复粉碎为小于40目的菌体粉末。
取上述菌体粉末进行如下步骤处理：①酸处理。将菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用268ml盐酸溶液(盐酸浓度0.6mol/L)浸泡，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇搅拌5min，搅拌转速100rpm，处理20h。后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；②碱处理。将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用268ml含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理(乙醇浓度为8％，氢氧化钠浓度为5％)，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇5min，搅拌转速100rpm,处理20h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；③干燥。将前述酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中60℃烘干24h，得到白色几丁质粉末4.14g，提取收率为31.59％。经HPLC检测，样品几丁质含量为94.9％。在此条件下，经发酵提取后，最终几丁质的产量为4.14g/L。
实施例4
(1)斜面培养与种子培养
如前述实施例1
(2)发酵培养
所用的发酵培养基，每升培养基中含有40g的蔗糖，30g的酵母膏，10g的黄豆粉，2.0g的糖蜜，2.0g的K2HPO4，3.0g的MgSO4·7H2O，0.02g的FeSO4·7H2O，2.0g的NaH2PO4·12H2O，pH 6.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
准备10瓶容积为250ml的发酵摇瓶(每个发酵瓶含有90ml无菌培养基)，在每个发酵摇瓶中各添加质量百分比浓度为20％的过氧化氢溶液，每升培养基加入1.5ml的过氧化氢溶液，，摇匀，吸取步骤(2)中培养好的种子液10ml无菌操作下接种于发酵摇瓶中(10％的接种量)，放置于30℃恒温摇床中，200r/min培养48h。
(3)几丁质提取
将上述步骤(2)所得的发酵液合并后，得1000ml发酵液，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，获得湿菌体。再将湿菌体放置于烘箱中50℃烘干至恒重，获得干菌体13.3g(发酵液中菌体干重为13.3g/L)。将干菌体经过反复粉碎为小于40目的菌体粉末。
取上述菌体粉末进行如下步骤处理：①酸处理。将菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用399ml盐酸溶液(盐酸浓度1.0mol/L)浸泡，固液比1:30，处理温度40℃，间隔8h间歇搅拌5min，搅拌转速100rpm，处理36h。后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；②碱处理。将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用399ml含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理(乙醇浓度为15％，氢氧化钠浓度为10％)，固液比1:20，处理温度40℃，间隔8h间歇5min，搅拌转速100rpm,处理36h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；③干燥。将前述酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中80℃烘干24h，得到淡黄色几丁质粉末2.79g，提取收率为21％。经HPLC检测，样品几丁质含量为95.3％。在此条件下，经发酵提取后，最终几丁质的产量为2.79g/L。
实施例对照
(1)斜面培养与种子培养
如前述实施例1
(2)发酵培养
发酵培养基同实施例2
准备10瓶容积为250ml的发酵摇瓶(每个发酵瓶含有90ml无菌培养基)，吸取步骤(2)中培养好的种子液10ml无菌操作下接种于发酵摇瓶中(10％的接种量)，放置于28℃恒温摇床中，180r/min培养40h。
(3)几丁质提取
将上述步骤(2)所得的发酵液合并后，得1000ml发酵液，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，再将湿菌体放置于烘箱中50℃烘干至恒重，获得干菌体12.8g，(发酵液中菌体干重为12.8g/L)。将干菌体经过反复粉碎为小于40目的菌体粉末。
取上述菌体粉末进行如下步骤处理：①酸处理。将菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用256ml盐酸溶液(盐酸浓度0.6mol/L)浸泡，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇搅拌5min，搅拌转速100rpm，处理20h。后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；②碱处理。将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用256ml含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理(乙醇浓度为8％，氢氧化钠浓度为5％)，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇5min，搅拌转速100rpm,处理20h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；③干燥。将前述酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中60℃烘干24h，得到白色几丁质粉末3.29g，提取收率为25.74％。经HPLC检测，样品几丁质含量为95.3％。在此条件下，经发酵提取后，最终几丁质的产量为3.29g/L。
实施例5
(1)斜面培养与种子培养
如前述实施例1
(2)发酵培养
发酵培养基同实例2
5L发酵罐：总装液量3.5L(70％)，向3150ml发酵培养基中添加质量百分比浓度为20％的过氧化氢溶液，每升培养基加入0.8ml的过氧化氢溶液，，启动搅拌并搅拌均匀后，将种子液350ml无菌操作接入到发酵培养集中(10％接种量)，控制发酵温度24℃，搅拌转速依据发酵液粘度控制在100-200rpm之间，通气量0.4～0.7v/v/min培养时间36h。
(3)几丁质提取
将上述步骤(2)所得的发酵液约3.5L，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，获得湿菌体。再将湿菌体放置于烘箱中50℃烘干至恒重，获得干菌体57.05g(发酵液中菌体干重为16.3g/L)。将干菌体经过反复粉碎为小于40目的菌体粉末。
取上述菌体粉末进行如下步骤处理：①酸处理。将菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用1141ml盐酸溶液(盐酸浓度0.6mol/L)浸泡，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇搅拌5min，搅拌转速100rpm，处理20h。后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；②碱处理。将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用1141ml含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理(乙醇浓度为8％，氢氧化钠浓度为5％)，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇5min，搅拌转速100rpm,处理20h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；③干燥。将前述酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中60℃烘干24h，得到白色几丁质粉末15.32g，提取收率为26.86％。经HPLC检测，样品几丁质含量为94.8％。在此条件下，经发酵提取后，最终几丁质的产量为4.38g/L。
实施例6
(1)斜面培养与种子培养
如前述实施例1
(2)发酵培养
发酵培养基同实例2
5L发酵罐：总装液量3.5L(70％)，向3150ml发酵培养基中添加质量百分比浓度为20％的过氧化氢溶液，每升培养基加入0.8ml的过氧化氢溶液，，启动搅拌并掉搅拌均匀后，将种子液350ml无菌操作接入到发酵培养集中(10％接种量)，控制发酵温度28℃，搅拌转速依据发酵液粘度控制在100-380rpm之间，通气量0.7～1.2v/v/min培养时间36h。
(3)几丁质提取
将上述步骤(3)所得的发酵液约3.5L，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，再将湿菌体放置于烘箱中50℃烘干至恒重，获得干菌体67.2g(发酵液中菌体干重为19.2g/L)。将干菌体经过反复粉碎为小于40目的菌体粉末。
取上述菌体粉末进行如下步骤处理：①酸处理。将菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用1344ml盐酸溶液(盐酸浓度0.6mol/L)浸泡，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇搅拌5min，搅拌转速100rpm，处理20h。后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；②碱处理。将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用1344ml含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理(乙醇浓度为8％，氢氧化钠浓度为5％)，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇5min，搅拌转速100rpm,处理20h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；③干燥。将前述酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中60℃烘干24h，得到白色几丁质粉末22.04g，提取收率为32.8％。经HPLC检测，样品几丁质含量为94.9％。在此条件下，经发酵提取后，最终几丁质的产量为6.3g/L。
实施例7
(1)斜面培养与种子培养
如前述实施例1
(2)发酵培养
发酵培养基同实例2
5L发酵罐：总装液量3.5L(70％)，向3150ml发酵培养基中添加质量百分比浓度为20％的过氧化氢溶液，每升培养基加入0.8ml的过氧化氢溶液，，启动搅拌并掉搅拌均匀后，将种子液350ml无菌操作接入到发酵培养集中(10％接种量)，控制发酵温度30℃，搅拌转速依据发酵液粘度控制在100-450rpm之间，通气量通气量0.7～1.5v/v/min培养时间36h。
(3)几丁质提取
将上述步骤(2)所得的发酵液约3.5L，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，再将湿菌体放置于烘箱中50℃烘干至恒重，获得干菌体61.25g，(发酵液中菌体干重为17.5g/L)。将干菌体经过反复粉碎为小于40目的菌体粉末。
取上述菌体粉末进行如下步骤处理：①酸处理。将菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用1225ml盐酸溶液(盐酸浓度0.6mol/L)浸泡，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇搅拌5min，搅拌转速100rpm，处理20h。后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；②碱处理。将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用1225ml含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理(乙醇浓度为8％，氢氧化钠浓度为5％)，固液比1:20，处理温度25℃，间隔6h间歇5min，搅拌转速100rpm,处理20h。后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；③干燥。将前述酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中60℃烘干24h，得到白色几丁质粉末15.29g，提取收率为24.96％。经HPLC检测，样品几丁质含量为95.1％。在此条件下，经发酵提取后，最终几丁质的产量为4.37g/L。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)一个菌种活化的步骤：将保藏的菌种于无菌操作下转接于斜面培养基中，放置于恒温恒湿培养箱中28℃培养5-7天；所述的菌种为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，所述的菌种的保藏号为CGMCC No.15668；
2)一个种子培养的步骤：将步骤1)中的斜面菌种于无菌操作下，刮取黄色孢子并转移至无菌生理盐水中，调整孢子浓度为4.0-7.0×108个孢子/ml，后按照10％的接种量转接于已经灭菌的种子培养基中，于恒温摇床中进行培养，培养条件为：28℃，转速180rpm，培养时间24h；
3)一个发酵培养的步骤：先在发酵培养基中加入过氧化氢溶液，每升培养基加入0.1-1.5ml的过氧化氢溶液，并搅拌均匀，后再将步骤2)中获得的种子培养液无菌操作下按照10％的接种量转接于发酵培养基中，于恒温摇床或发酵罐中进行培养，恒温摇床培养条件为：24-30℃，转速140-200rpm，培养时间36-48h；发酵罐培养条件为：24-30℃，转速100～450rpm，通气量0.4～1.6v/v/min，培养时间24-40h；
4)一个获取菌体的步骤：将步骤3)中所获得的发酵液，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，获得湿菌体，再将湿菌体放置于烘箱中50-90℃烘干至恒重，获得干菌体，对干菌体进行粉碎，获得平均粒度小于40目的菌体粉末；
5)一个对几丁质进行分离提取的步骤：
①「一个酸处理的步骤：将步骤4)中获得的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，加入0.1-1.0mol/L的盐酸溶液进行处理，加入后的固液比1:10-1:30，处理温度4-40℃，间隔4-8h进行间歇搅拌，搅拌转速100rpm，处理12-36h，然后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；
②「一个碱处理的步骤：将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理，在上述的水溶液中，乙醇的质量百分比浓度为5％-15％，氢氧化钠的质量百分比浓度为2％-10％，加入后的固液比1:10-1:30，处理温度4-40℃，间隔4-8h进行间歇搅拌，搅拌转速100rpm,处理12-36h，然后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；
③「一个进行干燥的步骤：将上述进行酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中45-80℃烘干24-48h，得到的白色粉末即为几丁质。
2.如权利要求1所述的一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于：在步骤1)中所用斜面培养基中，每升培养基中含有200g的去皮马铃薯，20g的葡萄糖，20g的琼脂，pH6.4-6.6；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
3.如权利要求1所述的一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于：在步骤2)的种子培养基中，每升培养基中含有8g的蔗糖，8g的酵母膏，2.0g的糖蜜，pH6.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
4.如权利要求1所述的一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于：在步骤3)中的发酵培养基中，每升培养基中含有20-40g的蔗糖，10-30g的酵母膏，3-10g的黄豆粉，0.5-2.0g的糖蜜，1.0-2.0g的K2HPO4，1.0-3.0g的MgSO4·7H2O，0.005-0.02g的FeSO4·7H2O，1.0-2.0g的NaH2PO4·12H2O，pH 5.0-6.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。
5.如权利要求1所述的一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于：步骤3)中所述过氧化氢溶液的质量百分比浓度为20％。
6.一种菌株，其特征在于，其分类命名为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，保藏号为CGMCC No.15668。
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