CN101352177B - 棉花专用复合抗重茬微生态制剂及其专用菌株与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种棉花专用复合抗重茬微生态制剂及应用。本发明的复合抗重茬微生态制剂是以枯草芽孢杆菌KTB001 CGMCC No.2564和绿色木霉KTF001 CGMCCNo.2562作为活性成分的制剂。其中,所述枯草芽孢杆菌KTB001 CGMCC No.2564的芽孢的含量为50亿cfu/克制剂;所述绿色木霉KTF001 CGMCC No.2562的厚垣孢子的含量为5亿cfu/克制剂。本发明的复合抗重茬微生态制剂,能够预防和控制棉花苗期病害和枯黄萎病,而且还有增加棉花产量、提高棉花品质和增强棉花抗逆性等功效,有利于改良土壤和减少环境污染,为生产优质棉花提供保障。

Description

棉花专用复合抗重茬微生态制剂及其专用菌株与应用
技术领域
本发明涉及棉花专用复合抗重茬微生态制剂及其专用菌株与应用。
背景技术
棉花是人民衣着、纺织工业的主要原料和出口创汇的重要产品,关系国际民生,意义重大。但是,近年来由于农业种植结构的调整,重茬种植现象十分普遍,使得棉花重茬病害普遍发生,棉花枯、黄萎病以及立枯病、猝倒病等苗期病害,尤以棉花枯萎病和黄萎病危害严重。
棉花枯萎病和黄萎病(简称“两萎病”),属植物检疫性病害之一。它是棉花病害中致病性强,危害损失较重,也是限制老棉区重病田高产稳产的重要病害。由于自从推广杂交棉或抗虫杂交棉以来,农业推广单位放松了思想警觉,忽视对棉花“两萎病”的检疫制度,频繁引调种子(特别在病疫区引调),致使带病种子迅速传播蔓延,特别是长期连作的老棉田,“两萎病”已上升为棉花高产稳定的主要障碍因素,严重影响棉花生产的持续发展。一般年份发病率40%~50%,严重年份发病率达70%以上,常年因“两萎病”造成的损失在20%~30%,严重年份可达60%以上,且棉花品质显著下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花专用复合抗重茬微生态制剂及其专用菌株与应用。
本发明所提供的复合抗重茬微生态制剂,是以枯草芽孢杆菌KTB001 CGMCCNo.2564和绿色木霉KTF001 CGMCC No.2562为活性成分的制剂。
其中,所述枯草芽孢杆菌KTB001 CGMCC No.2564和绿色木霉KTF001 CGMCCNo.2562的集落形成单位数目比为(10-30)∶(1-10)。所述枯草芽孢杆菌KTB001CGMCC No.2564的芽孢的含量具体可为50亿cfu/克制剂;所述绿色木霉KTF001CGMCC No.2562的厚垣孢子的含量具体可为5亿cfu/克制剂。
本发明的复合抗重茬微生态制剂可以是固体或者液体制剂。可加入吸附剂将所述复合抗重茬微生态制剂制成固体制剂,所述吸附剂具体可为轻质碳酸钙和/或草炭。所述固体制剂的粒度优选为0.09mm。
本发明的复合抗重茬微生态制剂所选用的菌株是从棉花重茬病重田的健康植株体内和根内筛选出的高效微生物菌株,采用现代生物工程技术加工制备而成的微生态制剂,具有防病增产的效果。经田间试验,本发明的复合抗重茬微生态制剂能够有效控制棉花立枯病、枯萎病和黄萎病的发生,防治效果分别达到44.8%、50.4%和61.9%,死亡苗数下降;且该复合抗重茬微生态制剂还有促生增产的作用效果,且增产效果显著,达到15.6%。此外,还可以改善棉花品质,绒长、衣分均有所提高。所以,在棉花上使用本发明的复合抗重茬微生态制剂是一项投资小、效益高、无污染的高产稳产的新措施,很好的缓解了棉花多年重茬难以解决的问题,可大面积推广应用。这不仅可以减少化肥和农药的使用量,而且降低化肥和农药的污染及其有害物质的残留。
因此,本发明的复合抗重茬微生态制剂,不仅有利于增加棉花产量,提高棉花品质,增强棉花抗逆性等功效,而且还可以改良土壤,减少环境污染,为今后生产优质棉花提供保障。
具体实施方式
实施例1、复合抗重茬微生态制剂的制备
1.控制棉花重茬病的菌株的获得
从棉花重茬重病田的健康植株体内和根中分离筛选获得2株控制棉花重茬病的高效菌株——绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KTB001。
绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KTB001的分离和筛选方法如下:
(1)分离
绿色木霉分离平板培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,加水1000ml,丙酸钠1g。然后分装克氏瓶或试管,置于灭菌锅内,在0.11MPa压力,121℃下灭菌30min,冷却后制成斜面备用。
枯草芽孢杆菌分离平板培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基):牛肉膏0.3g/100ml,蛋白胨0.5g/100ml,NaCl 0.5g/100ml,琼脂2g/100ml。将琼脂加热溶化后用NaOH或Hcl调pH值至7.0-7.2,然后分装克氏瓶或试管,置于灭菌锅内,在0.11MPa压力下灭菌30min,冷却后制成斜面备用。
在棉花重茬重病田选择健康植株的根、茎、叶等组织,用蒸馏水冲洗干净,用70%的酒精浸30s,然后用2g/100ml NaClO处理15min,无菌水冲洗3次,最后一次无菌水冲洗液涂营养琼脂(NA)平板,28℃培养3-5d,检测表面灭菌是否彻底,每处理3次重复。取经检验表面灭菌彻底的材料剪碎,取1g加适量无菌水研碎,将上清液稀释到10-1,振荡均匀(枯草芽孢杆菌上清液放入80℃的水中处理20分钟),梯度稀释到10-3,取0.1ml分别接种到绿色木霉分离平板培养基和枯草芽孢杆菌分离平板培养基上,涂布均匀。置于28-30℃恒温箱中培养3-5d,待单菌落长出后,纯化,转管,保存。
(2)筛选
分别接种棉花重茬病原菌(棉花枯、黄萎病以及立枯病、猝倒病的病原菌)于PDA平板中央,将待测木霉和芽孢杆菌接种于平板四周,每皿在4个方位各接种1株,重复3次,进行初筛;取拮抗性明显的菌株,再进行单株与病原菌对峙培养,采取一边接木霉或芽孢杆菌,一边接病原菌的对峙培养法进行复筛。结果得到2株对棉花重茬病原菌具有拮抗作用的菌株,命名绿色木霉KTF001和芽孢杆菌KTB001。
绿色木霉KTF001和枯草芽孢杆菌KTB001的鉴定方法如下
绿色木霉KTF001在PSA平板上,菌落初呈白色绒状,后期出现轮状的菌丝密实产孢区,颜色为绿色至深绿色,分生孢子梗呈环状排列次级分枝单个或以2-3个为一组,大角度伸出,分枝弯曲或波状,瓶颈基部缢缩,中部较宽,从中部以上变窄形成长颈,产孢细胞大小为长8.0-12.0微米,宽2.5-3.0微米,分生孢子呈球形,表面有刺,大小为2.5-4.8微米,经形态学鉴定绿色木霉KTF001为绿色木霉(Trichoderma viride)。
提取枯草芽孢杆菌KTB001的基因组DNA,分别以530F和1494R,67F和1387R为引物对进行PCR扩增,
530F:5′GTGCCAGCMGCCGCGG 3′,
1494R:5′GGYTACCTTGTTACGACTT 3′;
67F:5′CAGGCCTAACACATGCAAGTC 3′,
1387R:5′GGGCGGTGATGTACAAGGC 3′。
引物对530F/1494R扩增出约1-kb的片段,引物对67F/1387R扩增出约1.3kb的片段,将得到的DNA纯化后,连接到pMD-18T载体上,转化大肠杆菌DH5α,蓝白斑筛选,得到含有插入片段的转化子,进行EcoR I和Hind III酶切验证,测序,拼接所得到的序列,BLAST比对结果发现:KTB001与枯草芽孢杆菌的16S rDNA的序列保持很高的同源性(96%以上),分析细菌的16S rDNA的系统发生树状图也确定了此菌株的初步分类学的地位,与BLAST比对结果保持一致,在此基础上,进行属内的各种生理、生化指标的检测,KTB001菌体杆状,长2-3微米,宽0.8-0.9微米,革兰氏反应阳性,芽孢椭圆或柱状,中生或近中生,孢囊不膨大,原生质中不含有β-羟基丁酸盐颗粒;7g/100mlNal中生长,石芯牛奶不产酸,pH5.7生长,v.p阳性,水解淀粉,可产酸,与葡萄糖反应产气,NO3 -还原NO2 -,不能厌氧生长,接触酶阳性,与同种其它菌株相比菌体较宽。枯草芽孢杆菌KTB001为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001已于2008年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No.2562。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001已于2008年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No.2564。
2.复合抗重茬微生态制剂的制备
复合抗重茬微生态制剂经液体深层发酵法制成粉剂,主要步骤为原菌种活化→菌种扩大培养→种子罐培养→发酵罐培养→后处理。
A.原菌种活化和菌种扩大培养
(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564培养基制备:牛肉膏0.3g/100ml,蛋白胨0.5g/100ml,NaCl 0.5g/100ml,琼脂2g/100ml。将琼脂加热溶化后用NaOH或HCl调pH值至7.0-7.5,然后分装克氏瓶或试管,置于灭菌锅内,在121-125℃,0.11-0.14MPa压力下灭菌30min,冷却后制成斜面备用。
(2)绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562培养基制备:PDA培养基,然后分装克氏瓶或试管,置于灭菌锅内,在121-125℃,0.11-0.14MPa压力下灭菌30min,冷却后制成斜面备用。
(3)菌种活化与扩大培养:用培养基在无菌条件下从原菌种斜面上挑取少许菌苔,置放试管斜面内进行划线,然后置28-30℃温箱内培养,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564培养24h,绿色木霉(Trichodermaviride)KTF001 CGMCC No.2562培养48h,经检查无杂菌、菌体生长整齐;最后置28-30℃温箱内培养,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564培养24h,绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562培养48h,肉眼观察,菌苔丰满,涂片、染色检查无杂菌,孢子整齐,作为发酵生产的菌种。
B.种子罐培养
(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564种子罐培养基:豆饼粉0.5g/100ml、鱼粉0.3g/100ml、玉米粉0.5g/100ml、葡萄糖0.3g/100ml,豆油0.2-0.3g/100ml或泡敌0.3g/100ml,pH值7.0-7.5。
(2)绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562种子罐培养基:蔗糖21g/L,牛肉膏3g/L,磷酸二氢钾2g/L,硫酸镁1.5g/L,用NaOH或HCl调pH值至6.0-6.5。
(3)空发酵罐灭菌:发酵罐使用前清洗干净,排除污物,在121-125℃,0.11-0.14MPa下,灭菌30min。
(4)种子罐装料:分别按照(1)和(2)的培养基装料,投料量不超过罐容积70%。
(5)种子罐灭菌:装好料后,在121-125℃,0.11-0.14MPa下,灭菌30min,冷却至30℃后即接种。
(6)悬浮液制备:在无菌条件下将每个克氏瓶斜面菌种加100ml无菌水,把菌苔刮下制成孢子悬浮液。
(7)接种:将(6)制备的绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564的悬浮液,按1%的比例接种于冷却至30℃的种子罐内进行培养。
(8)种子罐培养:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564接种后在温度为28-30℃,转速220rpm搅拌条件下,培养8-10h;绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562接种后在温度为29-30℃转速160rpm,培养3-4天。
C.发酵罐发酵
(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564发酵罐培养基:玉米粉15g/L,黄豆饼粉20g/L,鱼粉5g/L,淀粉4g/L,CaCO3 10g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,(NH4)2SO4 1g/L,ZnSO4·8H2O 0.5g/L,用NaOH或HCl调PH值7.0-7.5。
(2)绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562发酵罐培养基:蔗糖21g/L,牛肉膏3g/L,磷酸二氢钾2g/L,硫酸镁1.5g/L,用NaOH或HCl调pH值至6.0-6.5。
(3)空发酵罐灭菌:发酵罐使用前清洗干净,排除污物,温度121-125℃,压力0.11-0.14Mpa,灭菌30min。
(4)发酵罐装料:分别按照(1)和(2)的培养基装料,投料量不超过罐容积70%。
(5)发酵罐灭菌:装好料后,温度121-125℃,压力0.11-0.14Mpa下灭菌30min,冷却至30℃后即接种。
(6)接种:将种子罐培养的绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCCNo.2562或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564菌液按发酵培养基量的1ml/100ml接种于冷却至30℃的发酵罐内进行培养。
(7)发酵培养
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564发酵:搅拌速度180-200转/min,罐压0.05MPa;通气量(每分钟进出体积之比):1∶1.3;发酵培养周期为12-18小时,在芽孢70%形成,个别芽孢开始脱落时,即放罐,这时杂菌污染<0.3%含菌量>1.0×1010cfu/g;
绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562发酵:搅拌速度160转/min,罐压0.1MPa;流量:50L/min,发酵培养周期为3-4天,厚垣孢子70%形成,即可放罐,这时杂菌污染<0.3%含菌(厚垣孢子)量>5.0×108cfu/ml。
D.后处理
(1)吸附剂:枯草芽孢杆菌采用粒度为0.09mm的轻质碳酸钙为吸附载体,绿色木霉采用普通草炭为吸附载体,加入量分别按下列公式计算。
Figure S2008101444911D00061
Figure S2008101444911D00062
(2)压滤:按(1)计算的量向C中步骤7得到的发酵液中加入吸附剂,机械搅拌3-6h,使芽孢或/和孢子全部被吸附,然后再用板框压滤。
(3)干燥:将板框压滤后的滤饼捣碎后,置于烘干机或烘干装置内进行烘干,烘干时的温度不超过40℃(为了防止菌体死亡),要不断翻动,使受热均匀,当含水率≤5%时,即可进行粉碎。
(4)粉碎:高细度粉碎机(0.09mm孔径筛)粉碎,制成枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KTB001 CGMCC No.2564和绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCCNo.2562固体制剂。
(5)制备复合抗重茬微生态制剂
绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564固体制剂按1∶1的质量比混合制备复合抗重茬微生态制剂,每克复合抗重茬微生态制剂含绿色木霉(Trichodermaviride)KTF001 CGMCC No.2562的厚垣孢子的含量为5亿cfu/克,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564的芽孢的含量为50亿cfu/克。
(7)成品检验
用干燥失重法测定含水率,HG2-896标准的湿筛法测定细度。成品含水率≤5%,且100%通过0.09mm筛为合格。检验结果表明步骤(6)制备的复合抗重茬微生态制剂的含水率为4%,100%能通过0.09mm筛,杂菌量≤1%。
(8)包装
用编制袋(内有塑料袋)25Kg包装,于干燥通风处贮存,保存期3年。
实施例2、复合抗重茬微生态制剂的制备
复合抗重茬微生态制剂的制备方法同实施例1,不同之处仅在于:绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562和枯草芽孢杆菌KTB001 CGMCCNo.2564固体制剂按10∶3的质量比混合,制备防治棉花枯、黄萎病以及立枯病、猝倒病等病害的复合抗重茬微生态制剂,每克复合抗重茬微生态制剂中含有绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562的厚垣孢子的含量为50亿cfu/克,枯草芽孢杆菌KTB001CGMCC No.2564的芽孢的含量为150亿cfu/克。
实施例3、实施例1的复合抗重茬微生态制剂的棉花田间试验效果
选择已有连续5年种植棉花历史的试验地,立枯病、枯萎病和黄萎病历年发病均较重,试验期间自然发生立枯病、枯萎病和黄萎病。选择地势平坦,土壤性状一致,肥力均匀中等地块种植棉花中棉所36号(新疆锦棉种业有限责任公司)设2个处理,处理1为分别在苗期和花期喷施实施例1的复合抗重茬微生态制剂各1次,每亩4千克;处理2为分别在苗期和花期喷施清水作为对照;每个处理设4次重复,共8个小区,随机区组排列。每小区面积5亩。除施用复合抗重茬微生态制剂外,各小区其他管理一致,田间管理按当地习惯进行。
每隔5亩的地块中(即一次重复)进行田间调查,采用五点取样法,每点取30株。棉花平顶后对株高、果枝层、单株结铃、单铃重等生物学性状进行调查;于5月中旬、6月中旬、7月中旬分别对立枯病、枯萎病和黄萎病进行调查。记载调查株数及病株数,计算发病率,统计防治效果。
发病率(%)=发病株数/调查总株数×100
防治效果(%)=(对照区发病率-处理区发病率)/对照区发病率×100,计算防病效果、实收籽棉,计算产量和增产效果;并对棉花的品质绒长和衣分也进行了测定。
实施例1的复合抗重茬微生态制剂对棉花病害的防治效果见表1,复合抗重茬微生态制剂能够有效的降低死苗率,对棉花立枯病、枯萎病和黄萎病均有明显的防治效果,防效分别达到44.8%、50.4%和61.9%,经SAS统计分析均达到显著水平。
表1复合抗重茬微生态制剂对棉花病害的防治效果
Figure S2008101444911D00081
实施例1的复合抗重茬微生态制剂对棉花生物学性状的作用效果如表2,复合抗重茬微生态制剂对棉花的生长具有明显的促生作用,株高、果枝层数、单株结铃数、单铃重分别增加10.0%、11.5%、14.3%和10.7%,经SAS统计分析均达到显著水平。
表2.复合抗重茬微生态制剂对棉花生物性状的作用效果
实施例1的复合抗重茬微生态制剂对棉花产量和品质的作用效果见表3所示,复合抗重茬微生态制剂对棉花有明显的增产效果,增产率达到15.6%;品质也有提高,绒长略有增加,但不显著,衣分率增加6.49%,经SAS统计分析产量和衣分均达到显著水平。
表3.复合抗重茬微生态制剂对棉花产量和品质影响
Figure S2008101444911D00092
实施例4、实施例2的复合抗重茬微生态制剂的棉花田间实验
选择已有连续6年种植棉花历史的试验地,枯萎病、黄萎病及红腐病历年发病均较重,试验期间自然发生枯萎病、黄萎病及红腐病。
选择地势平坦,土壤性状一致,肥力均匀中等地块种植中棉所36号棉花,设2个处理,处理1为分别在苗期和花期滴灌施用实施例2的复合抗重茬微生态制剂各1次,每亩4千克;处理2为分别在苗期和花期滴灌清水作为对照;每个处理设4次重复,共8个小区,随机区组排列。每小区面积5亩。除施用实施例2的复合抗重茬微生态制剂外,各小区其他管理一致,田间管理按当地习惯进行。
每隔5亩的地块中(即一次重复)进行田间调查,采用五点取样法,每点取30株。棉花平顶后对株高、果枝层、单株结铃、单铃重等生物学性状进行调查;于5月中旬、6月中旬、7月中旬分别对枯萎病、黄萎病及红腐病进行调查。记载调查株数及病株数,计算发病率,统计防治效果。
发病率(%)=发病株数/调查总株数×100
防治效果(%)=(对照区发病率-处理区发病率)/对照区发病率×100
同时计算防病效果、实收籽棉,计算产量和增产效果;并对棉花的品质绒长和衣分也进行了测定。
试验结果表明,实施例2的复合抗重茬制剂可增强棉花抗病能力,死苗率下降,对棉花枯萎病、黄萎病及红腐病造成的烂铃均有明显的防治效果;其次对棉花株高、果枝层、总果节、单株铃、单铃重、亩总铃数等均有明显的作用效果,其中果枝层较对照增加10.8%,单株铃数增加16.3%,亩总铃数增加15.2%;增加产量,改善品质,籽棉产量增加11.8%、衣分率增加8.4%。

Claims (9)

1.一种抗棉花重茬复合微生态制剂,是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KTB001 CGMCC No.2564和绿色木霉(Trichoderma viride)KTF001 CGMCC No.2562为活性成分的制剂;
所述枯草芽孢杆菌KTB001 CGMCC No.2564和绿色木霉KTF001 CGMCC No.2562的菌落形成单位数目比为(10-30)∶(1-10)。
2.根据权利要求1所述微生态制剂,其特征在于:所述枯草芽孢杆菌KTB001 CGMCC No.2564的芽孢的含量为50亿cfu/克制剂。
3.根据权利要求1所述微生态制剂,其特征在于:所述绿色木霉KTF001 CGMCC No.2562的厚垣孢子的含量为5亿cfu/克制剂。
4.根据权利要求2或3所述微生态制剂,其特征在于:所述制剂为固体。
5.根据权利要求4所述微生态制剂,其特征在于:所述制剂的粒度为0.09mm。
6.根据权利要求5所述微生态制剂,其特征在于:所述制剂还含有吸附剂。
7.根据权利要求6所述微生态制剂,其特征在于:所述吸附剂为轻质碳酸钙或草炭。
8.枯草芽孢杆菌KTB001,其保藏编号为CGMCC No.2564。
9.绿色木霉KTF001,其保藏编号为CGMCC No.2562。
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