CN105567568A - 一种防控茄果类蔬菜病毒病的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防控茄果类蔬菜病毒病的木霉、芽孢杆菌复合微生物菌剂及其制备方法。该木霉菌株为深绿木霉Tr1208（<i>Trichoderma atroviride</i>），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6828；芽孢杆菌菌株为解淀粉芽孢杆菌B1126（<i>Bacillus amyloliquefaciens</i>），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6827。深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌复合微生物菌剂是以深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌体为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体及保护剂制成；其中有效活性成分含菌量为5×10⁹cfu/g～2×10¹⁰cfu/g；菌体保护剂含量为0.1～1%（w/w）。菌剂可有效防控茄果类蔬菜病毒病（TMV、CMV、TYLCV等）的为害，并对植物有促进生长作用，具有高效、使用简单、成本低、无环境污染、改善植株微生态环境的特点。

Description

一种防控茄果类蔬菜病毒病的微生物菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种防控茄果类蔬菜病毒病的木霉、芽孢杆菌复合微生物菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

随着我国农业结构调整步伐的加快和人民生活水平的提高，蔬菜品种的多样化及周年均衡供应的需求日益增强，我国蔬菜生产的规模不断扩大，产量稳步上升，已成为我国种植业中仅次于粮食的第二大农作物。据农业部农情统计，2009年我国蔬菜种植面积占全球的43%，总产量占世界的49.6%。总产量及出口量均居世界第一，堪称世界第一蔬菜大国。

但是随着我国蔬菜生产的发展，栽培模式的多样性，蔬菜栽培种类和品种的丰富性，尤其是栽培环境的多样化，导致某些次要病害上升，病原菌寄主范围扩大，产生了许多亟待研究的新病害，一些新老病害交替为害，这些都严重制约着我国蔬菜产业的发展。其中茄果类蔬菜病毒病，均发生较为严重，造成严重减产、甚至绝收，已成为蔬菜生产的限制性障碍。目前防治该类病害仍主要采用化学药剂，常常刚用完药就采收销售，不仅造成蔬菜污染，同时还极易造成抗药性问题。因此研发安全与环境相和谐的微生物农药成为必然，其中木霉、芽孢杆菌这类有益微生物，由于其具有较强的诱导抗性、广谱抗病能力和调节微生态作用，而被研究用于植物病害生物防治和改善作物生长。

木霉、芽孢杆菌是自然界中普遍存在的真菌和细菌，在土壤、植物根围、叶围及种子、球茎表面经常可以分离到。近些年人们发现某些木霉、芽孢杆菌是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌，如哈茨木霉（T.harzianum）、钩状木霉（T.hamatum）、绿色木霉（T.viride）、枯草芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）和多粘芽孢杆菌（B.polymyxa）可以防治真菌病害。迄今为止有关木霉、芽孢杆菌在生防方面的研究已开展近70年，在国外已经出现了商品化的木霉、芽孢杆菌制剂。如以防治李属果树银叶病（Chondrostereumpurpureum）的木霉制剂在西欧已商品化生产；以色列的MakhteshimAgan公司开发的以哈茨木霉T39菌株为发酵液的生防制剂，商品名Trichodex，剂型为25%可湿粉，它可以用于防治灰霉病菌（Botrytiscinerea）、菌核病菌（Scleratinasclerotiorum）、叶霉病（Cladosporiumfulvum）等病害。21世纪被称为环保世纪，化学药剂的应用逐步受到限制，因此对蔬菜病害的生物防治研究自然称为热点问题。

本发明正是基于以上原因，以目前蔬菜为害较为严重，又缺乏生物防治手段的的茄果类蔬菜病毒病为靶标，从微生物资源中寻找具有高效诱抗、钝化病毒等活性的微生物，拟为研究开发新型生物菌剂寻找新的资源。

发明内容

本发明旨在提供一种防控茄果类蔬菜病毒病的深绿木霉、解淀粉芽孢杆菌制剂及其制备方法，可以用于防控茄果类蔬菜病毒病，解决化学农药防治带来的农药残留、抗药性和环境污染问题。本发明具有高效、性能稳定、可规模化生产的微生物菌剂，可用于防控TMV、CMV、TYLCV等茄果类蔬菜病毒病。为实现此目的，本发明公开了如下的技术内容：

一株具有体外钝化、抑制侵染和诱导抗性作用的深绿木霉菌株，其特征在于该菌株为深绿木霉Tr1208（Trichodermaatroviride），已于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6828。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

一株具有体外钝化、抑制侵染和诱导抗性作用的解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于该菌株为解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens），已于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6827。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

本发明保藏的深绿木霉菌株Tr1208（Trichodermaatroviride）的生理、生化特性如下：

木霉菌株Tr1208在PDA平板上生长迅速，菌落在3天内覆盖直径90mm的平板，呈辐射状，表面疏松平坦；在培养的第3天明显可见有孢子产生，最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹。显微观察培养的菌丝体无色、分枝繁复，由具有横隔的分枝菌丝构成；产生的分生孢子无隔膜，呈球形，聚成头状排列，单生，细胞壁存在明显而微小的粗糙突起。

本发明保藏的解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens）的生理、生化特性如下：

解淀粉芽孢杆菌B1126菌体污白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色菌体呈阳性，为革兰氏阳性菌，杆状；接触酶实验阳性；氧化酶实验阴性；葡萄糖阳性；乳糖阳性；蔗糖阳性。

本发明进一步公开了一种深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，是以深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌体为有效活性成分，一种深绿木霉菌剂，其特征在于它是由保藏号为CGMCCNo.6828的深绿木霉Tr1208（Trichodermaatroviride）和保藏号为CGMCCNo.6827的解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens）的菌体和它的次生代谢物为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体以及菌体保护剂组成；其中有效活性成分为5×10⁹cfu/g~2×10¹⁰cfu/g，菌体保护剂含量为0.1~1%（w/w）。

本发明优选的，其特征在于它是由保藏号为CGMCCNo.6828的深绿木霉Tr1208（Trichodermaatroviride）和保藏号为CGMCCNo.6827的解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens）的菌体和它的次生代谢物为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体以及菌体保护剂组成；其中有效活性成分为5×10⁹cfu/g~2×10¹⁰cfu/g，菌体保护剂含量为0.1~1%（w/w）。

本发明所述的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其菌体为深绿木霉的分生孢子、菌丝和厚垣孢子，解淀粉芽孢杆菌的菌体和芽孢，以及农业上可接受载体的混合；农业上可接受的载体为：硅藻土、碳酸钙、水、小麦粉、木屑、高岭土、不饱和烃类一种或几种的混合物；所述的菌体保护剂为黄原胶、蔗糖、腐植酸钠、黄腐酸钾、苯甲酸钠、丙酸钙、山梨酸钾一种或几种的混合物。

本发明更加优选的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：

深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126含菌量为5×10⁹cfu/g~2×10¹⁰cfu/g；

黄原胶0.02~0.1%（w/w）；

蔗糖0.05~0.5%（w/w）；

腐植酸钠或黄腐酸钾0.02~0.2%（w/w）；

苯甲酸钠或丙酸钙或山梨酸钾0.01~0.2%（w/w）。

余下量为碳酸钙和硅藻土或水载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:2~5。

本发明更进一步公开了深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）菌种活化和菌液制备：保藏号为CGMCCNo.6828的深绿木霉Tr1208（Trichodermaatroviride）的菌株，在23~28℃下，在马PDA培养基中活化72h，备用；在23~28℃下，在PD培养液中震荡培养72~96h，培养后得到深绿木霉Tr1208种子液；

保藏号为CGMCCNo.6827的解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens）的菌株，30~37℃下，在NA培养基中活化24h，备用；在30~37℃下，在NA培养液中震荡培养24~48h，培养后得到解淀粉芽孢杆菌B1126菌液；

所述的PDA培养基（或PD培养液）组成为：马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15~20克（培养液不添加）、蒸馏水1000毫升，自然pH；

所述的NA培养基（或NA培养液）组成为：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、15~20克（培养液不添加）、蒸馏水1000毫升，pH7±0.5；

3）固体发酵培养及菌粉的获得：在固体发酵培养基料中加入水20~45%（w/w），初始pH为6.5~7.5之间，高温灭菌，然后待温度降到30℃以下，接入步骤2）的深绿木霉Tr1208种子液，再在温度为20~30℃，间隔24~30h，定期搅拌的条件下发酵培养96~148h；测定发酵培养基料中菌体的数量，待发酵基料中孢子量达到10⁹cfu/g以上后停止发酵培养，培养物料经常温干燥，采用万能粉碎机粉碎、过筛后成深绿木霉菌粉；

所述的固体发酵培养基料（w/w）的组成为：麦粉2~4%，麦麸12~18%，食用菌废料渣或/和木屑77.1~84%，过磷酸钙0.5~1%，尿素0.2~0.5%，蔗糖0.2~0.5%，润水后灭菌备用；

解淀粉芽孢杆菌B1126菌液经过喷雾干燥，获得解淀粉芽孢杆菌菌粉。

4）制备深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂：深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌粉；黄原胶0.02~0.1%（w/w）；蔗糖0.05~0.5%（w/w）；腐植酸钠或黄腐酸钾0.02~0.2%（w/w）；苯甲酸钠或丙酸钙或山梨酸钾0.01~0.2%（w/w）。余下量为碳酸钙和硅藻土或水载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:2~5。混合制备深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂含菌量5×10⁹cfu/g~2×10¹⁰cfu/g。

本发明同时也公开了深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌株制备作为防控茄果类蔬菜病毒病菌剂中的应用。优选作为防控茄果类蔬菜病毒病（TMV、CMV、TYLCV）菌剂中的应用以及作为促进植物生长制剂中的应用。

本发明可以制成各种剂型，如可湿性粉剂、粉尘剂、颗粒剂和悬浮剂等，还可以加入其它有效活性成分进行复配以及增效剂、稳定剂，以提高制剂的药效和农业上的实用性。

本发明或/和选用碳酸钙为载体，碳酸钙颗粒的直径为0.074mm。

本发明或/和选用硅藻土为载体，硅藻土颗粒的直径为0.074mm。

本发明或/和选用水为载体。

所述的PDA培养基（或PD培养液）组成为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15~20克（培养液不添加）、蒸馏水1000毫升，自然pH。

所述的NA培养基（或NA培养液）组成为：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、15~20克（培养液不添加）、蒸馏水1000毫升，pH7±0.5。

本发明提供深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂防控茄果类蔬菜病毒病的施用方法是：将菌剂兑水500~1000倍液，于蔬菜地上部分均匀喷雾，可有效防控茄果类蔬菜病毒病（TMV、CMV、TYLCV），防效达56%~78%，并且对植物生长有明显的促进生长作用。

本发明公开的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明公开的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂对防控茄果类蔬菜病毒病有明显增效效果，与现有技术相比防效明显提高；

（2）本发明公开的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂可有效防治茄果类蔬菜病毒病（TMV、CMV、TYLCV），防治范围有所增加；

（3）本发明公开的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂对植物生长有明显的诱抗和促进生长作用。

具体实施方式

本发明实质性特点可以从下述实施例中得以体现，但是这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定，下面通过实例来进一步阐明本发明深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法及应用。下述实施例中的实验方法和试剂，如无特别说明，均为常规方法并均有市售。

实施例1：

深绿木霉、解淀粉芽孢杆菌的分离与筛选。

通过平皿对峙培养、苗期促生作用、种子处理进行具有拮抗与促生作用的木霉和芽孢杆菌定向筛选，获得深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌株，其对番茄、辣椒等茄果类蔬菜和黄瓜等瓜类作物有较强的诱导抗性作用，诱抗作用达50~90%。同时对番茄、辣椒、茄子等茄果类苗期、种子有显著地促生作用，对苗期促长率达35~85%，对种子萌发促进率达40~85%。

通过伤口接种安全试验，深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126均未引起番茄、辣椒和烟草萎蔫或猝到，未见其根部和叶部发生病变，植株生长正常，说明所筛选到的深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126对番茄、辣椒和烟草等茄果类植株安全，无致病性。

实施例2：

深绿木霉的鉴定。

木霉菌株Tr1208在PDA培养基上生长迅速，菌落3天内生长直径大于90mm，菌丝表面疏松、平坦，生长呈辐射状；培养3天可见明显孢子产生，最初为淡绿色，后逐渐增多，呈深绿色、同心轮纹状。

显微观察，木霉菌株Tr1208菌丝体无色、分枝繁复，具分隔；分生孢子无隔膜，呈球形，聚头状排列，单生，细胞壁存在明显而微小的粗糙突起。

以木霉菌株Tr1208基因组DNA为模板，利用木霉菌翻译延伸因子进行扩增，采用正向引物：EF1-728F（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’），反向引物：TEF1rev(5’-GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3’)。利用引物进行PCR扩增，扩增翻译延伸因子得到特异性条带，将PCR产物测序，并对测序结果进行BLAST比对。菌株Tr1208扩增片段长度523bp，通过在GeneBank核酸序列数据库进行比对，与深绿木霉（Trichodermaatroviride）的相似度为100%。据此，结合其形态特征及序列分析结果，将菌株Tr1208鉴定为深绿木霉（Trichodermaatroviride）。

实施例3：

解淀粉芽孢杆菌的鉴定。

芽孢杆菌B1126在NA培养基上培养，其菌体污白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色菌体呈阳性，为革兰氏阳性菌，杆状；接触酶实验阳性；氧化酶实验阴性；葡萄糖阳性；乳糖阳性；蔗糖阳性。可利用阿拉伯糖、甘露醇、木糖产酸产气。

以芽孢杆菌B1126基因组DNA为模板，利用16SrDNA进行扩增，采用正向引物：P1(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)，反向引物：P6(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)。将PCR产物测序，测序结果提交GenBank，将序列在GenBank中进行同源性比较，经鉴定B1126属于芽孢杆菌属，解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）。

实施例4：

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备。

1）菌种活化和菌液制备：保藏号为CGMCCNo.6828的深绿木霉Tr1208（Trichodermaatroviride）的菌株，在23~28℃下，在PDA培养基中活化72h，备用；在23~28℃下，在PD培养液中震荡培养72~96h，培养后得到深绿木霉Tr1208种子液。

保藏号为CGMCCNo.6827的解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens）的菌株，30~37℃下，在NA培养基中活化24h，备用；在30~37℃下，在NA培养液中震荡培养24~48h，培养后得到解淀粉芽孢杆菌B1126菌液。

所述的PDA培养基（或PD培养液）组成为：马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15~20克（培养液不添加）、蒸馏水1000毫升，自然pH。

所述的NA培养基（或NA培养液）组成为：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、15~20克（培养液不添加）、蒸馏水1000毫升，pH7±0.5。

2）固体发酵培养及菌粉的获得：在固体发酵培养基料中加入水20~45%（w/w），初始pH为6.5~7.5之间，高温灭菌，然后待温度降到30℃以下，接入步骤2）的深绿木霉Tr1208种子液，再在温度为20~30℃，间隔24~30h，定期搅拌的条件下发酵培养96~148h；测定发酵培养基料中菌体的数量，待发酵基料中孢子量达到10⁹cfu/g以上后停止发酵培养，培养物料经常温干燥，采用万能粉碎机粉碎、过筛后成深绿木霉菌粉。

所述的固体发酵培养基料（w/w）的组成为：麦粉2~4%，麦麸12~18%，食用菌废料渣或/和木屑77.1~84%，过磷酸钙0.5~1%，尿素0.2~0.5%，蔗糖0.2~0.5%，润水后灭菌备用。

解淀粉芽孢杆菌B1126菌液经过喷雾干燥，获得解淀粉芽孢杆菌菌粉。

实施例5：

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126，含菌量为5×10⁹cfu/g；

黄原胶0.08%（w/w）；

蔗糖1.2%（w/w）；

腐植酸钠或黄腐酸钾0.08%（w/w）；

余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:4。

实施例6：

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126，含菌量为2×10¹⁰cfu/g；

黄原胶0.1%（w/w）；

蔗糖1.5%（w/w）；

腐植酸钠或黄腐酸钾0.2%（w/w）；

余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:5。

实施例7：

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126，含菌量为1×10¹⁰cfu/g；

黄原胶0.05%；

蔗糖1%；

腐植酸钠或黄腐酸钾0.05%；

余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比=1:2。

实施例8：

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126，含菌量为9×10⁹cfu/g；

黄原胶0.1%（w/w）；

蔗糖1%（w/w）；

黄腐酸钾0.2%（w/w）；

余下量为小麦粉和高岭土，其中小麦粉：高岭土的重量份数比为1:5。

实施例9：

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126，含菌量为8×10⁹cfu/g；

黄原胶0.05%（w/w）；

蔗糖1.5%（w/w）；

腐植酸钠或黄腐酸钾0.05%（w/w）；

余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:3。

实施例10：

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126，含菌量为2×10¹⁰cfu/g；

黄原胶0.1%（w/w）；

蔗糖1.5%（w/w）；

腐植酸钠或黄腐酸钾0.2%（w/w）；

余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:5。

实施例11：

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂对番茄病毒病的盆栽防病试验。

对所研制的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂进行预防番茄病毒病（CMV）的试验，试验结果见表1。试验结果显示，深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂对番茄病毒病的发生具有较好的预防作用，深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌复合菌剂及其单剂施用后接种CMV对CMV有明显的预防作用，深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌复合菌剂及深绿木霉、解淀粉芽孢杆单剂预防效果分别为55.66%，49.75%，44.83%。

表1、深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂预防番茄病毒病试验

CMV	级数	0	1	3	5	7	9	总叶片数	病情指数	预防效果
											1	木霉和芽孢杆菌菌剂	10	12	7	3			32	16.67	55.66
2	木霉菌剂	7	12	8	3			30	18.89	49.75
											3	芽孢杆菌菌剂	2	14	14				30	20.74	44.83
4	清水对照		12	7	7	4	1	31	37.63

对所研制的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂进行对番茄病毒病（CMV）的体外钝化防病试验，试验结果见表2。试验结果显示，深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌复合菌剂及其单剂处理对CMV病毒有明显的钝化作用，深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌复合菌剂及深绿木霉、解淀粉芽孢杆单剂钝化防病效果分别为63.16%，51.88%，76.77%。

表2、深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂对番茄病毒病的钝化作用试验

CMV	级数	0	1	3	5	7	9	总叶片数	病情指数	钝化效果
											1	木霉和芽孢杆菌菌剂	11	9	4				24	9.72	63.16
2	木霉菌剂	12	9	6	1			28	12.70	51.88
											3	芽孢杆菌菌剂	15	13	1				29	6.13	76.77
4	清水对照	5	6	9	2	2		24	26.39

深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂对番茄、辣椒病毒病田间防病试验。

对所研制的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂进行番茄病毒病（TMV、CMV、TYLCV）和辣椒病毒病（CMV）的田间防病试验，试验结果表明，深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂500倍液、750倍液和1000倍液，对番茄和辣椒病毒病的发生具有较好的防控作用，其田间防控病毒病效果分别在52.5%~85.5%之间。

实施例12：

通过对番茄种子萌发试验，结果显示深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂对番茄种子均有较好的促进作用。在4d后清水对照番茄种子未见萌发，而由深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂、木霉菌剂和芽孢杆菌菌剂处理的番茄种子萌发率有显著提高，4d不同处理的萌发率分别在6.67~43.33%，20.00~36.67%，13.33~40.00%。

经过5d后调查番茄种子的发芽率较对照亦有显著提高，清水对照种子萌发率仅为33.33%，而由深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂、木霉菌剂和芽孢杆菌菌剂处理的番茄种子萌发率有显著提高，5d不同处理的萌发率分别在56.67~73.33%，66.67~80.00%，56.67~73.33%。其稀释10000倍液后，对番茄种子萌发有显著促进作用，深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂、木霉菌剂和芽孢杆菌菌剂处理的胚根分别为4.77mm、5.00mm和5.03mm，而清水对照胚根仅为2.40mm。试验表明，木霉和芽孢杆菌菌剂对番茄等有很好的促进生长作用。

表3、木霉和芽孢杆菌菌剂对番茄种子萌发等的试验

Claims (13)

1.一株具有体外钝化、抑制侵染和诱导抗性作用的深绿木霉菌株，其特征在于该菌株为深绿木霉Tr1208（Trichodermaatroviride），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6828。

2.一株具有体外钝化、抑制侵染和诱导抗性作用的解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于该菌株为解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6827。

3.一种深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，是以深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌体为有效活性成分，其特征在于它是由保藏号为CGMCCNo.6828的深绿木霉Tr1208（Trichodermaatroviride）和保藏号为CGMCCNo.6827的解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens）的菌体和它的次生代谢物为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体以及菌体保护剂组成；其中有效活性成分为5×10⁹cfu/g~2×10¹⁰cfu/g，菌体保护剂含量为0.1~1%（w/w）。

4.权利要求3所述的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其中所述的菌体为深绿木霉的分生孢子、菌丝和厚垣孢子的混合，以及解淀粉芽孢杆菌的菌体和芽孢；农业上可接受的载体为：硅藻土、碳酸钙、水、小麦粉、木屑、高岭土、不饱和烃类一种或几种的混合物；所述的菌体保护剂为黄原胶、蔗糖、腐植酸钠、黄腐酸钾、苯甲酸钠、丙酸钙、山梨酸钾一种或几种的混合物。

5.权利要求2-4任一项所述的深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：

深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126含菌量为5×10⁹cfu/g~2×10¹⁰cfu/g；

黄原胶0.02~0.1%（w/w）；

蔗糖0.05~0.5%（w/w）；

腐植酸钠或黄腐酸钾0.02~0.2%（w/w）；

苯甲酸钠或丙酸钙或山梨酸钾0.01~0.2%（w/w）。

6.余下量为碳酸钙和硅藻土或水载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:2~5。

7.权利要求2-4任一项所述深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）菌种活化和菌液制备：保藏号为CGMCCNo.6828的深绿木霉Tr1208（Trichodermaatroviride）的菌株，在23~28℃下，在PDA培养基中活化72h，备用；在23~28℃下，在PD培养液中震荡培养72~96h，培养后得到深绿木霉Tr1208种子液；

保藏号为CGMCCNo.6827的解淀粉芽孢杆菌B1126（Bacillusamyloliquefaciens）的菌株，30~37℃下，在NA培养基中活化24h，备用；在30~37℃下，在NA培养液中震荡培养24~48h，培养后得到解淀粉芽孢杆菌B1126菌液；

所述的PDA培养基（或PD培养液）组成为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15~20克（培养液不添加）、蒸馏水1000毫升，自然pH；

所述的NA培养基（或NA培养液）组成为：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2.5g、15~20克（培养液不添加）、蒸馏水1000毫升，pH7±0.5；

2）固体发酵培养及菌粉的获得：在固体发酵培养基料中加入水20~45%（w/w），初始pH为6.5~7.5之间，高温灭菌，然后待温度降到30℃以下，接入步骤2）的深绿木霉Tr1208种子液，再在温度为20~30℃，间隔24~30h，定期搅拌的条件下发酵培养96~148h；测定发酵培养基料中菌体的数量，待发酵基料中孢子量达到10⁹cfu/g以上后停止发酵培养，培养物料经常温干燥，采用万能粉碎机粉碎、过筛后成深绿木霉菌粉；

所述的固体发酵培养基料（w/w）的组成为：麦粉2~4%，麦麸12~18%，食用菌废料渣或/和木屑77.1~84%，过磷酸钙0.5~1%，尿素0.2~0.5%，蔗糖0.2~0.5%，润水后灭菌备用；

解淀粉芽孢杆菌B1126菌液经过喷雾干燥，获得解淀粉芽孢杆菌菌粉。

8.制备深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂：深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌粉；黄原胶0.02~0.1%（w/w）；蔗糖0.05~0.5%（w/w）；腐植酸钠或黄腐酸钾0.02~0.2%（w/w）；苯甲酸钠或丙酸钙或山梨酸钾0.01~0.2%（w/w）。

9.余下量为碳酸钙和硅藻土或水载体，其中碳酸钙：硅藻土的重量份数比为1:2~5。

10.混合制备深绿木霉和解淀粉芽孢杆菌菌剂含菌量5×10⁹cfu/g~2×10¹⁰cfu/g。

11.权利要求1、2所述深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌株作为制备防控茄果类蔬菜病毒病菌剂应用。

12.权利要求1、2所述深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌株制备作为防控茄果类蔬菜病毒病（TMV、CMV、TYLCV）菌剂中的应用。

13.权利要求1所述深绿木霉Tr1208和解淀粉芽孢杆菌B1126菌株在制备作为促进植物生长菌剂中的应用。