CN110591927A - 一株木霉菌株hb20111在消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质方面的应用及菌剂 - Google Patents

一株木霉菌株hb20111在消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质方面的应用及菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明属于菌株及其应用技术领域，涉及一株具有酚酸消解功能的菌株及应用，具体为一株木霉菌株HB20111在消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质方面的应用及菌剂。该木霉菌株HB20111，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.16963，保藏日期为2018年12月5日。该木霉菌株HB20111具有消解酚酸类物质的能力，7d后HB20111对丁香酸、阿魏酸、苯甲酸的消除率达到100％。

Description

一株木霉菌株HB20111在消解作物连作障碍因子酚酸类自毒 物质方面的应用及菌剂
技术领域
本发明属于菌株及其应用技术领域，涉及一株具有酚酸消解功能的菌株及应用，具体为一株木霉菌株HB20111在消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质方面的应用及菌剂。
背景技术
木霉菌(Trichoderma spp.)已作为一种防治土传病害、生物安全、无污染、无残留的高效生防菌株被业界认可，本研究室曾研究发现木霉菌LTR-2具有消除草酸的作用，进而降低灰霉病原菌的致病力；研究还发现，不同木霉菌对草酸的降解能力不同，防治病害作用也不同。而西洋参连作障碍主要因素之一是自毒物质酚酸的积累，因此，本研究通过筛选能够消解酚酸类物质的木霉菌株，研究其降解谱，选育广谱降解木霉菌株，并通过田间小区试验进而筛选具有降解土壤自毒物质、促进西洋参生长的木霉菌株，研发木霉菌菌剂及应用技术，构建木霉菌解除西洋参连作障碍的技术体系，为西洋参产业健康、可持续发展和乡村振兴计划提供技术支撑。
发明内容
本发明提供一株木霉菌株HB20111在消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质方面的应用及菌剂，该木霉菌株HB20111是从滨州黄河边采集的土样中分离获得的，具有消解酚酸类物质的特性。
本发明的技术方案为：
一株木霉菌株HB20111在消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质方面的应用及菌，该木霉菌株HB20111，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.16963，保藏日期为2018年12月5日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，分类命名：深绿木霉 Trichoderma atroviride。经形态学与ITS序列分析，将HB20111鉴定为深绿木霉(T. atroviride)。
本发明的木霉菌株HB20111通过土壤处理、拌种、蘸根、灌根或浸泡种子的方式进行消解酚酸类物质。
所述的消解酚酸类物质包括丁香酸、阿魏酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、对香豆酸、水杨酸等。
进一步的，采用木霉菌株HB20111发酵培养获得的分生孢子进行消解酚酸类物质；具体为采用由分生孢子母药制备得到的菌剂，通过土壤处理、拌种、蘸根、灌根或浸泡种子。
所述的分生孢子母药的制备方法为，(1)斜面培养：采用PDA培养基，将菌株HB20111接种在试管培养基上，28℃培养2-3d；
(2)三角瓶培养：采用PDB培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28℃振荡培养1d；
(3)液体培养：采用液体发酵培养基，115℃灭菌30min，将菌种接种到发酵罐，接种量0.1％(v/v)，28℃培养，通气量1：0.5-1.0，搅拌速度为160r/min，培养1-2d；
(4)固体培养：采用固体发酵培养基，121℃灭菌30min，在拌料罐中将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为2-5％(v/v)，接种完毕转移到固体培养室，培养基厚度为3-4cm，料温控制在28±2℃，室温控制在22-25℃，培养室空气的相对含水量为95-100％，培养时间为3-4d；
(5)孢子收集：培养后用生理盐水洗脱分生孢子，5 000r/min以上离心10 min，收集沉淀，得到分生孢子；
(6)分生孢子母药制备：将上述分生孢子与硅藻土按照1:10进行充分混匀，过80筛后备用。
步骤(3)中，液体发酵培养基为，玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉4％，K2HPO40.2％，KH2PO4 0.3％，余量为水，pH 6.0-6.5。
步骤(4)中，固体发酵培养基为，玉米粉1.0％，麸皮42.2％，稻壳5.0％，余量为水。
进一步的，本发明还提供一种具有消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质作用的木霉菌剂，该菌剂组成为：分生孢子母药2％，几丁质1％，海藻酸钠 0.5％，凹凸棒土96.5％。
本发明的有益效果在于，
本发明的木霉菌株HB20111用于消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质的应用，该木霉菌株HB20111具有消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质的能力， 7d后HB20111对丁香酸、阿魏酸、苯甲酸的消除率达到100％，对对羟基苯甲酸消除率达到92.7％，显著高于对照菌株LTR-2。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1木霉菌株HB20111的形态学特征。
注：A-C：25℃培养7d的菌落特征(A：SNA，B：PDA，C：CMD)； D分生孢子；E厚垣孢子；F-G分生孢子梗和瓶梗；标尺10μm。
图2木霉菌株HB20111的系统发育进化树。
图3木霉菌株HB20111对利用清水、酚酸类物质作为培养液的黄瓜种子的发芽试验。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1木霉HB20111的分离与鉴定
菌株HB20111是利用木霉选择性培养基PDAm(PDA+300mg/L氯霉素 +100mg/L链霉素+20mg/L玫瑰红+0.05％Triton X-100)，从滨州黄河边采集的土样中分离获得的。
称取10g土样，放入添加90mL 0.9％NaCl的盐水三角瓶中，28℃，160 r/min，振荡1h充分混匀，取1mL混入含9mL 0.9％NaCl的盐水试管中，涡旋震荡混匀，依次进行梯度稀释，各梯度取1mL加入90mm的培养皿中。 PDA培养基冷却至60℃以下，加入300mg/L氯霉素，100mg/L链霉素，20 mg/L玫瑰红和0.05％Triton X-100，每个培养皿中倒入约20mL培养基，轻轻旋转混匀使培养皿中样品均匀分散在培养基中，28℃培养3-4d，分离筛选疑似木霉的菌株进行鉴定。
木霉菌株HB20111的形态特征见图1。菌株HB20111在SNA培养基上 20℃、25℃、30℃、35℃培养72h，菌落半径分别为15.0-17.0mm、26.0-28.5 mm、30.0-32.0mm、2.5-4.0mm，高于40℃不生长，最适生长温度为25-30℃。在SNA培养基上25℃培养7d，菌落表面气生菌丝疏松，分生孢子绿色，产生锯齿状同心轮纹，边缘有绿色产孢簇，基质中无水溶性色素分布，菌落反面无色。
在PDA培养基上20℃、25℃、30℃、35℃培养72h，菌落半径分别为43.0-44.5mm、56.5-58.5mm、40.0-42.0mm、2.0-3.5mm，高于40℃不生长，最适生长温度为25-30℃。在PDA培养基上25℃培养7d，菌落表面呈丝绒状，边界清晰，中央有一菌丝相对致密的圆盘状结构，是分生孢子的主要产生区域，分生孢子绿色浓密，菌落反面白色，有椰香味气体产生。
在CMD培养基上25℃培养7d，菌落表面呈粉尘颗粒状，菌丝疏松、有两圈绿色同心轮纹，菌落边缘分布直径为2.0-3.0mm的产孢簇，分生孢子绿色，菌落反面白色，基质中无水溶性色素产生，有椰子气味。
分生孢子梗分枝特征与深绿木霉(T.atroviride)一致，为典型的单侧分枝，分枝角度近似90°，但也常见成对着生分枝。瓶梗长度(4.2-)6.0-9.7(-15.0)μm，长宽比例(1.1-)1.8-3.5(-6.3)，基部宽度为(1.2-)1.7-2.5(-3.5)μm，无间生瓶梗。
分生孢子绿色，亚球型或卵圆形，表面光滑，(2.3-)2.8-3.5(-4.0)μm，长宽比例为(0.8-)1.0-1.3(-1.6)。
在CMD培养基上25℃培养7d可产生大量的厚垣孢子，球形至亚球形，端生或间生，直径为(5.0-)8.5-7.5(-11.0)μm。
菌株HB20111的ITS序列为608bp，在GenBank上的登录号为EU272523.1，经www.isth.info中的TrichOKEY进行比对，分别在73、94、241、399、503处发现了木霉的5个DNA寡核苷酸条形编码，种类鉴定结果表明菌株HB20111为深绿木霉(T.atroviride)。
将ITS序列提交NCBI进行比对，菌株HB20111与T.atroviride菌株 ACCC32886[MF871543.1]同源性最高，为100.0％。选取NCBI中与菌株HB20111 的ITS同源性较高的序列构建系统发育进化树，结果见图2。进化树中HB20111与T. atroviride位于同一分枝，同源性最高，故HB20111应为T.atroviride。
实施例2木霉HB20111菌剂的制备
(1)斜面培养：采用PDA培养基，将菌株HB20111接种在试管培养基上， 28℃培养2-3d；
(2)三角瓶培养：采用PDB培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28℃振荡培养1d；
(3)液体培养：采用液体发酵培养基，115℃灭菌30min，将菌种接种到发酵罐，接种量0.1％(v/v)，28℃培养，通气量1：0.5-1.0，搅拌速度为160r/min，培养1-2d；
(4)固体培养：采用固体发酵培养基，121℃灭菌30min，在拌料罐中将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为2-5％(v/v)，接种完毕转移到固体培养室，培养基厚度为3-4cm，料温控制在28±2℃，室温控制在22-25℃，培养室空气的相对含水量为95-100％，培养时间为3-4d；
(5)孢子收集：培养后用生理盐水洗脱分生孢子，5 000r/min以上离心10 min，收集沉淀，得到分生孢子；
(6)母药制备：将上述分生孢子与硅藻土按照1:10进行充分混匀，过80 筛后备用。
(7)菌剂制备：该菌剂组成为：分生孢子母药2％，几丁质1％，海藻酸钠0.5％，凹凸棒土96.5％。
步骤(3)中，液体发酵培养基为，玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉4％，K2HPO40.2％，KH2PO4 0.3％，余量为水，pH 6.0-6.5。
步骤(4)中，固体发酵培养基为，玉米粉1.0％，麸皮42.2％，稻壳5.0％，余量为水。
实施例3酚酸类物质存在下木霉HB20111对黄瓜种子发芽试验
将灭菌滤纸放入无菌培养皿中，并在培养皿中加入清水(对照)或100mM 的酚酸混合液，然后将用108CFU/mL木霉菌悬浮液浸泡15min的黄瓜种子放入上述培养皿中，每个皿中约20粒，每个处理3个重复，25℃培养箱中培养，结果见图3。清水对照种子发芽率为90.0％，酚酸对照种子发芽率只有35.0％，而酚酸+HB20111处理后，种子发芽率达到了85.0％，显著高于酚酸处理，与清水处理间差别不大，说明木霉HB20111可有效消解酚酸对种子的毒害作用。
实施例4木霉HB20111消解酚酸类物质的检测
取培养7d的培养皿内液体10μL，然后通过液相色谱测定酚酸类物质的剩余含量。7d后，HB20111对丁香酸、阿魏酸、苯甲酸的消除率达到100％，对对羟基苯甲酸消除率达到92.7％，显著高于对照菌株LTR-2。具体见表1。
表1木霉菌株对丁香酸、阿魏酸、苯甲酸等的消除作用(7d)
实施例5木霉HB20111菌剂酚酸降解应用示范
示范区位于荣成市大疃镇贺家庄村，西洋参分别用清水、木霉HB20111、 2.5％咯菌腈拌种处理，分别于第一年7月初和第二年七月初取样检测土壤中部分酚酸含量，并测定西洋参生长情况。
第一年结果见表2。清水、木霉HB20111、2.5％咯菌腈处理后，第一年西洋参出苗率分别达到50.77％、89.23％和79.62％，木霉处理组各酚酸类物质较清水、2.5％咯菌腈处理均有显著下降，存在极显著性差异(p<0.01)，木霉HB20111 菌剂处理根际土壤阿魏酸、苯甲酸、丁香酸含量较清水对照下降95％以上，达到了消除酚酸自毒物质的效果。
第二年结果见表3。清水、木霉HB20111、2.5％咯菌腈处理后，第二年西洋参出苗率分别达到18.75％、75.00％和75.00％，木霉处理组各酚酸类物质较清水、2.5％咯菌腈处理均有显著下降，存在极显著性差异(p<0.01)，木霉HB20111 菌剂处理根际土壤阿魏酸、苯甲酸、丁香酸含量较清水对照下降95％以上，达到了消除酚酸自毒物质的效果。
表2木霉HB20111菌剂消除酚酸效果及生长情况大田示范结果
注：采用SPSS 21.0统计软件中的Duncan’s方法进行分析，结果为3次重复的平均值±标准差，不同小写字母表示各处理间在0.05水平上存在显著性差异，不同大写字母表示各处理间在0.01水平上存在极显著性差异。
表3木霉HB20111菌剂消除酚酸效果及生长情况大田示范结果
注：采用SPSS 21.0统计软件中的Duncan’s方法进行分析，结果为3次重复的平均值±标准差，不同小写字母表示各处理间在0.05水平上存在显著性差异，不同大写字母表示各处理间在0.01水平上存在极显著性差异。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一株木霉菌株HB20111在消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质方面的应用，其特征在于，该木霉菌株HB20111在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.16963，保藏日期为2018年12月5日。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，木霉菌株HB20111通过土壤处理、拌种、蘸根、灌根或浸泡种子的方式进行消解酚酸类物质。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的消解酚酸类物质包括丁香酸、阿魏酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、对香豆酸、水杨酸。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，采用木霉菌株HB20111发酵培养获得的分生孢子进行消解酚酸类物质。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，具体为采用由分生孢子母药制备得到的菌剂，通过土壤处理、拌种、蘸根、灌根或浸泡种子。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的分生孢子母药的制备方法为，(1)斜面培养：采用PDA培养基，将菌株HB20111接种在试管培养基上，28℃培养2-3d；
(2)三角瓶培养：采用PDB培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28℃振荡培养1d；
(3)液体培养：采用液体发酵培养基，115℃灭菌30min，将菌种接种到发酵罐，接种量0.1％(v/v)，28℃培养，通气量1：0.5-1.0，搅拌速度为160r/min，培养1-2d；
(4)固体培养：采用固体发酵培养基，121℃灭菌30min，在拌料罐中将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为2-5％(v/v)，接种完毕转移到固体培养室，培养基厚度为3-4cm，料温控制在28±2℃，室温控制在22-25℃，培养室空气的相对含水量为95-100％，培养时间为3-4d；
(5)孢子收集：培养后用生理盐水洗脱分生孢子，5 000r/min以上离心10min，收集沉淀，得到分生孢子；
(6)分生孢子母药制备：将上述分生孢子与硅藻土按照1:10进行充分混匀，过80筛后备用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，
步骤(3)中，液体发酵培养基为，玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆饼粉4％，K2HPO40.2％，KH2PO4 0.3％，余量为水，pH 6.0-6.5。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，
步骤(4)中，固体发酵培养基为，玉米粉1.0％，麸皮42.2％，稻壳5.0％，余量为水。
9.一种具有消解作物连作障碍因子酚酸类自毒物质作用的木霉菌剂，其特征在于，该菌剂组成为：分生孢子母药2％，几丁质1％，海藻酸钠0.5％，凹凸棒土96.5％。
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