CN109682898A

CN109682898A - 草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法

Info

Publication number: CN109682898A
Application number: CN201910046942.6A
Authority: CN
Inventors: 刘小林; 徐胜光; 林丽; 凃玉莲
Original assignee: Yichun University
Current assignee: Yichun University
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明提供一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，以草莓连作后的根际鲜土壤为提取、分离纯化原料，经过除杂、过筛，加碱离心静置，酸化处理。精密过滤制分离提取样品液、最后采用高效液相色谱法进行草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化方法简单，对草莓连作过程中土壤的毒性分析状况有着重要的意义。

Description

草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法

技术领域：

本发明涉及农业生产领域，一种草莓连作障碍物质提取、分离纯化的方法，特别是一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法。

背景技术：

草莓连作障碍严重的阻碍了草莓的可持续化的生产与发展，草莓连作障碍的主要原因是根系产生的自毒作用,而酚酸类物质是草莓连作障碍的主要类物质。

草莓根际土壤的酚、酸类物质，主要有苯环、含羟基和羧酸极性基团的有机致毒物质，有对羟基苯甲酸、肉桂酸、阔马酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、棕榈酸、苯二羧酸、4-香豆酸、阿魏酸、丁香酸、DL-扁桃酸、L-苯丙氨酸、2，4-丁基苯酚、苯甲醇、邻苯二甲酸、太酸二丁酯、苯甲醛，二苯基砜、乙二酸双酯、邻苯二酸二异辛酯、硬脂酸甲酯、壬醛二甲缩醛、棕榈酸甲酯等。但大部分有苯环、含羟基和羧酸极性基团的有机致毒物质含量极低，无法定量分析。而仅有含量相对较高的没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸等少数的能够定量的分析检测，而这些物质也正是草莓连作过程中其根际土壤中自毒性的主要的酚、酸类物质。

不同连作年限的草莓根际的土壤中酚酸含量变化显著，其中没食子酸随连作年限明显增加，原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸呈先降低后升高趋势。有研究表明，随连作年限的增加，土壤总酚酸含量总体呈显著增加趋势，连作３年后土壤中酚酸物质的总浓度达到36.291mg·kg^-1，与未连作时土壤中酚酸物质的总浓度26.462 mg·kg^-1相比增长37%。

因此，如何来对草莓连作根际土壤中的障碍酚酸类物质进行提取与分离纯化，对草莓连作过程中土壤的毒性分析有着重要的意义。

发明内容：

本发明提供一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，以草莓连作后的根际鲜土壤为提取、分离纯化原料，经过除杂、过筛，加碱离心静置，酸化处理。精密过滤制分离提取样品液、最后采用高效液相色谱法进行草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化方法简单。

本发明公开一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，以草莓连作后的根际鲜土壤为提取、分离纯化原料，其包括如下步骤：

1）、除杂、过筛，将提取的草莓连作后的根际鲜土壤原料，经剔除根茬残体及其余杂物质，经粉碎、过筛，为除杂土；

2）、加碱离心静置，将1）步制备的除杂土置于离心装置中，并加入碱水溶液，并离心搅拌静置，得上清液为静置碱性溶液；

3）、酸化处理，将2）步制得的静置碱性溶液先进行震荡处理、然后加入酸溶液进行酸化处理，至溶液pH为2-3.5，得酸化处理液；

4）、精密过滤制分离提取样品液、将3）步制得的酸化处理液，用精密过滤器过滤制得分离提取样品液；

5）、将4）步制备的分离提取样品液使用液相柱采用高效液相色谱法进行草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化，测得到草莓连作障碍酚酸类物质。

所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，其步骤1)所述过筛是过30-50目筛。

所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，优选的，是其步骤2）加入碱水溶液是加NaOH溶液，控制NaOH溶液的浓度为0.8-1.5 mol·L^-1；所述静置是控制静置时间为20-30小时。

本发明所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，其步骤3）酸化处理是将静置碱性溶液，经震荡处理后，置于离心装置中，加入盐酸溶液，然后再离心处理，控制盐酸溶液浓度为10-13 mol·L^-1，控制离心处理过程中的离心转速为3500-4300r·min^-1，控制离心处理时间8-15 min，酸化处理时间为1.5-2.5h，控制酸化处理至酸化处理液的pH为2.5-3时为终点，得酸化处理液。

进一步的，是步骤4）所述精密过滤制分离提取样品液的过程中还包括萃取，所述萃取，是向步骤3）酸化处理液加入乙酸乙酯萃取若干次，合并萃取液，萃取渣经烘干处理后，再用乙醇和/或甲醇液充分溶解后过滤得过滤液，和合并萃取液一同经精密过滤器过滤制得分离提取样品液。

优选的，是步骤4）所述精密过滤是采用微孔滤膜滤过，控制微孔滤膜微孔直径为0.35-0.65 µm。

优选的，是步骤5）所述液相柱是为Kromasil C₁₈柱，其规格为4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相为甲醇-水-乙酸=20：80：0.2；检测波长为250-280nm；柱温为22-28℃；控制流速为0.5-0.9 mL·min^-1；采用外标法定量分析峰面积。

本发明公开的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，以草莓连作后的根际鲜土壤为提取、分离纯化原料，可对草莓连作后的根际土壤中的酚酸类物质没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸等，进行分离纯化，并可进行定性与定量分析，方法简单。对草莓连作过程中土壤的毒性分析状况有着重要的意义。

附图说明：

图1，为没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸对照品溶液的HPLC谱图；

图2，为本发明草莓连作后的根际鲜土壤样品中提取、分离纯化出的没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸的HPLC谱图。

从图1和图2所示的HPLC谱图可以看出，本发明方法草莓连作后的根际鲜土壤样品中提取、分离纯化出的没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸的峰谷图与图1中的没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸的对照品溶液的HPLC谱图相一致。具体实施方式：

下面结合具体实例对本发明作进一步说明；质量或质量比。本发明公开的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，以草莓连作后的根际鲜土壤为提取、分离纯化原料，其包括如下步骤：

1）、除杂、过筛，将提取的草莓连作后的根际鲜土壤原料，经剔除根茬残体及其余杂物质，粉碎、过筛，为除杂土；

4）、精密过滤制分离提取样品液、将3）步制得的酸化处理液，加酯萃取、得萃取液，萃取渣经烘干再用醇溶解，过滤后制得的过滤液和萃取液合并后用精密过滤器过滤制得分离提取样品液；

优选的，是步骤2）加入碱水溶液是加NaOH溶液，控制NaOH溶液的浓度为0.8-1.5mol·L^-1；所述静置是控制静置时间为20-30小时。

步骤3）酸化处理是将静置碱性溶液，经震荡处理后，置于离心装置中，加入盐酸溶液，然后再离心处理，控制盐酸溶液浓度为10-13 mol·L^-1，控制离心处理过程中的离心转速为3500-4300 r·min^-1，控制离心处理时间8-15 min，酸化处理时间为1.5-2.5h，控制酸化处理至酸化处理液的pH为2.5-3时为终点，得酸化处理液。

步骤4）所述的萃取，是向步骤3）酸化处理液中加入乙酸乙酯，萃取若干次，将若干次萃取的萃取液合并为合并萃取液，萃取渣经烘干处理后，烘干渣再用乙醇和/或甲醇液充分溶解后过滤得过滤液，将过滤液和合并萃取液一同经精密过滤器过滤制得分离提取样品液。优选的是使用甲醇液进行溶解，用乙酸乙酯对步骤3）的酸化处理液进行萃取次数，一般控制在3-4次，将3-4次制备的萃取液合并为合并萃取液；烘干处理是控制烘干温度为40-55℃，烘干时间为1-2小时，萃取时乙酸乙酯的用量和甲醇溶解时的用量按现有技术用量控制，如乙酸乙酯的用量为酸化处理液质量的2-3倍，同样甲醇的用量也可以是烘干物重量的2-3倍。

步骤4）所述精密过滤是采用微孔滤膜滤过，控制微孔滤膜微孔直径为0.35-0.65µm。

具体工作过程为：将草莓连作后的根际不同鲜土取样后剔除根茬等残体，过40目筛后，称20g鲜土于离心管中，加入20 mL 1 mol·L^-1 NaOH 放置过夜，次日振荡30 min，于离心装置内在速度为4000 r·min^-1的条件下，离心10 min 后，制得的上清液，用浓度为12mol·L^-1的盐酸进行酸化至上清液的pH为 2.5，2h后，再用离心装置于4000 r·min^-1下，离心10 min，再经萃取、烘干、溶解，制得的分离提取样品液；然后用微孔滤膜直径为0.45 µm滤过，过滤，制得作为待测的样品溶液即分离提取样品液。采用高效液相色谱法，对草莓连作障碍酚酸类物质进行提取、分离纯化与鉴定测定。将上面分离提取样品液，用色谱柱为Kromasil C₁₈柱规格为4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相为甲醇-水-乙酸=20：80：0.2；270nm为检测波长；柱温为25℃；流速0.7 mL·min^-1。以外标法定量分析峰面积。用微量注射器精密吸取制备的土壤样品溶液各20 μL进样，测定样品液中的没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸对照品峰面积积分值，用外标法计算没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸的平均含量。经分离、纯化、检测结果表明，在不同连作年限土壤中，均检测出没食子酸、原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸，并且各物质的色谱峰大小存在差异，表明各酚酸类化感物质的含量也存在较大的差异。不同连作年限土壤中酚酸含量变化显著，其中没食子酸随连作年限明显增加，原茶儿酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸呈先降低后升高趋势。随连作年限的增加，土壤总酚含量总体呈显著增加趋势，连作３年后土壤中酚酸物质的总浓度达到36.291mg·kg^-1，与未连作时土壤中酚酸物质的总浓度26.462 mg·kg^-1相比增长37%。说明草莓连作后的根际鲜土壤中的酚酸类物质等连作后呈增加趋势。

Claims

1.一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，以草莓连作后的根际鲜土壤为提取、分离纯化原料，其特征是包括如下步骤：

1)、除杂、过筛，将提取的草莓连作后的根际鲜土壤原料，经剔除根茬残体及其余杂物质，经粉碎、过筛，为除杂土；

2)、加碱离心静置，将1）步制备的除杂土置于离心装置中，并加入碱水溶液，并离心搅拌静置，得上清液为静置碱性溶液；

2.根据权利要求1所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，其特征是步骤1)所述过筛是过30-50目筛。

3.根据权利要求1所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，其特征是步骤2）加入碱水溶液是加NaOH溶液，控制NaOH溶液的浓度为0.8-1.5 mol·L^-1；所述静置是控制静置时间为20-30小时。

4.根据权利要求1所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，其特征是步骤3）酸化处理是将静置碱性溶液，经震荡处理后，置于离心装置中，加入盐酸溶液，然后再离心处理，控制盐酸溶液浓度为10-13 mol·L^-1，控制离心处理过程中的离心转速为3500-4300 r·min^-1，控制离心处理时间8-15 min，酸化处理时间为1.5-2.5h，控制酸化处理至酸化处理液的pH为2.5-3时为终点，得酸化处理液。

5.根据权利要求1所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，其特征是步骤4）所述精密过滤制分离提取样品液的过程中还包括萃取，所述萃取，是向步骤3）酸化处理液加入乙酸乙酯萃取若干次，合并萃取液，萃取渣经烘干处理后，再用乙醇和/或甲醇液充分溶解后过滤得过滤液，和合并萃取液一同经精密过滤器过滤制得分离提取样品液。

6.根据权利要求1所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，其特征是步骤4）所述精密过滤是采用微孔滤膜滤过，控制微孔滤膜微孔直径为0.35-0.65 µm。

7.根据权利要求1所述的一种草莓连作障碍酚酸类物质提取、分离纯化的方法，其特征是步骤5）所述液相柱是为Kromasil C₁₈柱，其规格为4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相为甲醇-水-乙酸=20：80：0.2；检测波长为250-280nm；柱温为22-28℃；控制流速为0.5-0.9 mL·min^-1；采用外标法定量分析峰面积。