KR101763315B1 - 항염증 활성을 갖는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 이의 합성방법 - Google Patents
항염증 활성을 갖는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 이의 합성방법 Download PDFInfo
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Abstract
고시페틴은 자연 화합물로, 히비스커스의 꽃받침(calyx of Hibiscus sabdariffa)로부터 유래한다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물로 Raw 264.7 세포를 처리한 후, 상기 세포의 면역적 활성 효과를 분석 및 비교하였다. 그 결과 본 발명에 따른 신규한 플라보노이드계 화합물로 처리한 Raw 264.7 세포로부터 염증 반응 경로(inflammasome pathway)를 활성화하는 NLRP3과 NF-kB의 발현이 상당히 억제되었음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 신규한 플라보노이드계 화합물이 대식세포에서의 염증 매개물질과 인플라마솜을 저해하고, 이와 관련된 TNF-α와 IL-1β의 분비도 억제한다는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 실험예에서와 같이 본 발명에 따른 신규한 플라보노이드계 화합물이 LPS로 처리되어 염증 활성이 유발된 세포에서의 염증질환 발현에 대해, 종래 고시페틴 화합물보다 우수한 항염증 효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 신규한 플라보노이드계 화합물이 대식세포에서의 염증 매개물질과 인플라마솜을 저해하고, 이와 관련된 TNF-α와 IL-1β의 분비도 억제한다는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 실험예에서와 같이 본 발명에 따른 신규한 플라보노이드계 화합물이 LPS로 처리되어 염증 활성이 유발된 세포에서의 염증질환 발현에 대해, 종래 고시페틴 화합물보다 우수한 항염증 효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
Description
본 발명은 항염증 활성을 갖는 플라보노이드계 화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항염증 효과가 뛰어난 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 합성방법에 관한 것이다.
현재, 세계에는 무수히 다양한 종류의 질병이 있고, 이러한 질병의 위험에 많은 사람들이 노출되어 있다. 이 중에서도 염증 질환은 너무 일반적이라 그 위험성이 쉽게 간과되어지지만, 염증 질환에 의해 암 등의 고질적 질환이 야기되기 때문에 매우 위험하다.
염증은 일반적으로 스트레스, 물리적 행동에 의한 부상, 고칼로리 음식의 과섭취 등의 요인에 의해 발생되고, 신경학적 질환, 대사성 질환 및 암과 같은 만성 질병들과 관련이 깊다고 보고되어 왔으나, 이들의 복잡한 반응과정을 비롯하여 염증반응과 만성적 질환과의 유도과정에 관해서는 아직 많은 부분들이 명백하게 밝혀지지 못했다.
현재까지의 연구결과에 따르면, 염증이란 크게 급성 염증과 만성 염증으로 나누어 볼 수 있고, 상기 급성 염증은 염증의 초기 단계로 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 재생하기 위한 생체 방어 반응과정으로 작용하며, 외부 침입균에 대항하여 유도되는 정상적인 신체반응이라 할 수 있다. 이에 반해 만성 염증은 과도한 염증반응이 유도되어, 비정상적으로 자유 라디칼이 생성되고, 조직이 손상되거나 악화되며, 이러한 반응과정으로 심장병, 암과 같은 만성 질환을 야기하게 되는 위험한 질환이다.
이러한 만성 염증은 NF-kB(nuclear factor kappa B)와 TNF(종양괴사인자수용체, tumor necrosis factor receptor), IL(인터루킨) 및 chemokines(키모카인)의 증가를 동반한다는 것이 밝혀져 왔는데, 상술한 실험을 바탕으로 만성 염증의 치료 물질이 개발된 바에 따르면 이들은 모두 초기 염증 단계를 방지하기 위한 정도에 그치고 있어, 새로운 항염증 물질에 대한 연구가 시급하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 항염증 활성을 갖는 신규한 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 플라보노이드계 화합물의 합성방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 화학식에서,
상기 R1 내지 R6은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, 히드록시, C1-6의 알킬에스터기 및 C6 -15의 아릴에스터기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물은 하기 화학식 2 내지 5 중에서 어느 하나로 표시될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물이 NF-kB와 NLRP3-인플라마솜 염증조절복합체의 활성을 억제할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물은 하기 특성 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다.
1) 세포내 산화질소(NO) 분비 억제;
2) 염증 관련 매개물질인 TNF-α, IL-1β, iNOS, COX-2의 발현 억제;
3) NF-kB와 NLRP3-인플라마솜 염증조절복함체 경로 활성화 억제; 및
4) 활성산소종 생성 억제;
상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물이 1 내지 150 μM의 양으로 포함될 수 있다.
상기 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 패혈증, 화상, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
또한 본 발명은 LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 염증 활성 인자 발현을 억제하는데 유효한 하기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 세포의 염증 활성의 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여 Ⅰ) 유기용매 또는 유기용매와 물의 공용매 및 염기 조건하에서, 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물의 히드록시기가 아세틸화, 알킬화 또는 아릴화되는 단계;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식에서,
상기 R1 내지 R6은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, 히드록시, C1-6의 알킬에스터기 및 C6 -15의 아릴에스터기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 Ⅰ) 단계에서 제조된 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 히드록시기가 알킬화 또는 아릴화하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 염기는 NaHCO3, K2CO3 및 Et3N으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계는 20-70 ℃에서 10-30 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 제조방법을 통해 수득된 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 수율이 10-80%일 수 있다.
본 발명은 신규한 폴라보노이드계 화합물을 제공하며, 이러한 폴라보노이드계 화합물은 염증 사이토카인의 발현을 억제하고, 염증 관련 매개물질들의 생성을 억제함으로써 우수한 염증 억제 효과를 달성할 수 있으므로, 염증 관련 질환 등의 치료 및 예방제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 화학식 2의 화합물(합성예 2)의 1H-NMR 스펙트럼 데이터이다.
도 1b는 화학식 3의 화합물(합성예 3)의 1H-NMR 스펙트럼 데이터이다.
도 1c는 화학식 4의 화합물(합성예 4)의 1H-NMR 스펙트럼 데이터이다.
도 1d는 화학식 5의 화합물(합성예 5)의 1H-NMR 스펙트럼 데이터이다.
구체적으로 도 2는 Raw 264.7 세포에 화학식 2-6의 화합물과 양성 대조군인 이부프로펜을 각각 처리한 후, 이에 따른 세포 생존율(%)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 Raw 264.7 세포에서, LPS 처리에 따른 세포 생존율(%)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 4a는 LPS 처리 시간에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4b는 도 4a에서 LPS대무 처리 시간에 따른 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4c는 도 4a에서 LPs 처리 시간에 따른 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4d는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4e는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4f는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 P65의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4g는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 LPS 처리 시간에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5b는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5c는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5d는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2 내지 6의 화합물의 처리/비처리에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6b는 도 6a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6c는 도 6a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6d는 도 6a에서 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6e는 도 6a에서 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6f는 도 6a에서 PGE2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6g는 도 6a에서 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2 내지 6의 화합물의 처리/비처리에 따른 염증성 매개물질(NLPR3, ASC, Caspase-1(P10) 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7b는 도 7a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7c는 도 7a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7d는 도 7a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8b는 도 8a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8c는 도 8a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8d는 도 8a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NF-kB 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9b는 도 9a에서 IkB-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9c는 도 9a에서 p-IkB-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9d는 도 9a에서 p65의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 10a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome)과 NF-kB 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10b는 도 10a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도10c는 도 10a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10d는 도 10a에서 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10e는 도 10a에서 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10f는 도 10a에서 PPCE2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10g는 도 10a에서 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 11a 내지 도 11f는 LPS 유도된 염증 활성 세포(Raw 264.7)에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 ROS 생산 정도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 도 11의 결과를 수치화하여 막대 형태로 나타낸 그래프이다.
도 13은 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 세포사멸(apoptosis) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14a는 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 IL-1α, TNF-α, NLRP3, ASC, Caspase-1와 같은 다양한 염증관련 매개물질들의 발현 여부를 PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 14b는 도 14a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 14c는 도 14a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14d는 도 14a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14e는 도 14a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14f는 도 14a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG) 농도(μM)에 따른 아질산염(nitrite)의 발생량을 나타낸 그래프이다.
도 1b는 화학식 3의 화합물(합성예 3)의 1H-NMR 스펙트럼 데이터이다.
도 1c는 화학식 4의 화합물(합성예 4)의 1H-NMR 스펙트럼 데이터이다.
도 1d는 화학식 5의 화합물(합성예 5)의 1H-NMR 스펙트럼 데이터이다.
구체적으로 도 2는 Raw 264.7 세포에 화학식 2-6의 화합물과 양성 대조군인 이부프로펜을 각각 처리한 후, 이에 따른 세포 생존율(%)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 Raw 264.7 세포에서, LPS 처리에 따른 세포 생존율(%)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 4a는 LPS 처리 시간에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4b는 도 4a에서 LPS대무 처리 시간에 따른 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4c는 도 4a에서 LPs 처리 시간에 따른 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4d는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4e는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4f는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 P65의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 4g는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 LPS 처리 시간에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5b는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5c는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5d는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2 내지 6의 화합물의 처리/비처리에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6b는 도 6a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6c는 도 6a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6d는 도 6a에서 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6e는 도 6a에서 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6f는 도 6a에서 PGE2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6g는 도 6a에서 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2 내지 6의 화합물의 처리/비처리에 따른 염증성 매개물질(NLPR3, ASC, Caspase-1(P10) 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7b는 도 7a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7c는 도 7a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7d는 도 7a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8b는 도 8a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8c는 도 8a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8d는 도 8a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NF-kB 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9b는 도 9a에서 IkB-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9c는 도 9a에서 p-IkB-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9d는 도 9a에서 p65의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 10a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome)과 NF-kB 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10b는 도 10a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도10c는 도 10a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10d는 도 10a에서 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10e는 도 10a에서 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10f는 도 10a에서 PPCE2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10g는 도 10a에서 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 11a 내지 도 11f는 LPS 유도된 염증 활성 세포(Raw 264.7)에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 ROS 생산 정도를 나타낸 그래프이다.
도 12는 도 11의 결과를 수치화하여 막대 형태로 나타낸 그래프이다.
도 13은 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 세포사멸(apoptosis) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14a는 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 IL-1α, TNF-α, NLRP3, ASC, Caspase-1와 같은 다양한 염증관련 매개물질들의 발현 여부를 PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 14b는 도 14a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 14c는 도 14a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14d는 도 14a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14e는 도 14a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14f는 도 14a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 15는 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG) 농도(μM)에 따른 아질산염(nitrite)의 발생량을 나타낸 그래프이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
일반적으로 염증은 급성과 만성 두 분류로 크게 나누어 볼 수 있다. 급성 염증은 해로운 요소에 대응하기 위한 신체의 초기 반응으로, 세포 조직의 항상성을 유기하기 위해 수행된다. 급성 염증은 사이토카인(cytokines)과 케모카인(chemokines)이 대식세포에 의한 방출됨으로써 시작되는데, 이는 손상된 세포 조직이 혈관으로부터 백혈구(eukocytes)를 증가시키도록 한다.
다시 말해, 호증성 백혈구(neurological)와 다른 백혈구가 혈관으로부터 혈관 주위 세포 조직과 손상된 부위로 이동하는 상기 급성 염증의 반응과정은 외부의 손상에 반사적으로 이루어지고, 이러한 급성 염증 반응은 인간에게 해롭지 않은 방향으로 수행되며, 단지 침투한 병원균을 파괴하고 손상된 세포 조직을 수복하기 위해 백혈구와 혈관 확장만이 야기된다.
이에 반해 만성 염증은 산화종(ROS)과 과량의 염증성 매개물질로 인해 병리학적 염증을 유발하게 되는데, 이러한 제어할 수 없는 과도한 염증반응으로 인해 암, 당뇨, 폐 질환 및 알츠하이머와 같은 만성 질환들을 오히려 발생시킨다.
즉, 급성 염증은 단순히 외부 침입에 대항하기 위한 초기 신체 반응이라면, 만성 염증은 다양한 만성적 질환을 유발하는 하나의 질환으로 치료의 대상이 되어야한다. 그럼에도 불구하고 만성 염증 즉, 염증 질환을 치료하기 위해서, 단지 만성 염증 반응의 초기 단계를 제어할 수 있는 물질들만이 개발되어 있는 실정이다.
이러한 예로 TNF, IL 패밀리 유전자들과 같이, 염증 전(pro-inflammatory) 세포질분열의 신호 체계를 억제하는 물질들이 개발되었고, 대표적으로 이부프로펜이 있는데, 이는 체내의 통증 유발물질인 COX-2를 억제하여 통증을 줄여주는 정도의 약효만을 가지며, 위장출혈의 위험성이 있고, 아스피린과 동시에 복용할 경우 심장병 발생 위험이 높아지는 등의 문제점을 가지고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-6 and IFN-γ 등의 다양한 염증 전(pro-inflammatory) 사이토카인(cytokines)들에 억제 효과를 갖는 물질들이 개발되었으나, 이러한 억제 효과를 통해서는 파킨슨병 환자(PD patients)의 초기 단계에서만 염증 억제 효과가 발휘되었으며, 더군다나 류마티스성 관절염 특히 TNF-α에 의해 유발되는 질환은 오히려 야기하는 등의 문제가 발견되었다.
즉, 다양한 사이토카인이 다수의 질환에서 연구되었지만, 아직 어느 하나 정확하게 만성 염증에 대해 우수한 억제 효과를 갖는 물질이 개발되지 못하였다.
이에 본 발명자는 대량 스크리닝을 통해, Raw 264.7 세포에서 항염증 효과를 나타내는 신규한 플라보노이드계 화합물을 발견하였으며, 이는 만성 염증 질환과 관계된 여러 염증 매개물질들을 억제한다는 점에 기인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 화학식에서,
상기 R1 내지 R6은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, 히드록시, C1-6의 알킬에스터기 및 C6 -15의 아릴에스터기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
바람직하게 상기 화학식에서, 상기 R1 내지 R6은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, -OH, OMe, OAc 및 
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로도 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다.
약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로, 이 염에 기인한 부작용이 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.
상기 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있고, 상기 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있으며, 상기 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물은 하기 화학식 2 내지 5 중에서 어느 하나로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물은 1) 세포내 산화질소(NO) 분비 억제; 2) 염증 관련 매개물질인 TNF-α, IL-1β, iNOS, COX-2의 발현 억제; 3) NF-kB와 NLRP3-인플라마솜 염증조절복함체 경로 활성화 억제; 및 4) 활성산소종 생성 억제; 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 특성을 가질 수 있다.
즉, 상기 약학 조성물은 백혈구 세포사멸 억제 또는 LPS관여 신호전달 억제에 관여하며, 구체적으로 염증 유발인자인 NF-kB 경로, NLRP3-인플라마솜(inflammasome) 염증조절복합체의 활성화를 저해하여 항염증 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
상기 약학조성물은 세포질의 IkB-a가 핵안으로 이동하는 것을 억제하는 것을 확인하였고, NF-kB 경로와 관련된 염증성 인자인 HIF-1a, COX-2, IL-1b, TNF-a 등을 억제하는 것을 확인하여, 결과적으로 염증 질환을 억제하는 효과를 달성한다.
상기 약학 조성물은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 패혈증, 화상, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증 질환에 대하여 항염증 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물 내의 유효성분으로서 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의해 적절하게 조절할 수 있으며, 구체적으로 상기 플라보노이드계 화합물은 상기 약학 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 50 중량% 포함될 수 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 약학 조성물 내의 유효성분으로서 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물이 1 내지 150 μM의 양으로 포함되는 것이 바람직한데, 왜냐하면 상기 상한치를 초과하면 세포 독성이 높아지는 문제가 있고 상기 하한치 미만이면 항염증 활성이 충분하지 않다는 문제가 있다.
가장 바람직하게는 본 발명에 따른 약학 조성물 내의 유효성분으로서 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물이 100 내지 150 μM의 양으로 포함될 수 있는데, 실험예에서 후술하는 바와 같이 상기 농도 범위에서 항염증 효과가 2 배 이상 향상되는 현저히 우수한 효과를 달성할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 저제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 염증 활성 인자 발현을 억제하는데 유효한 하기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물과 접촉시켜 시험관 내(in vitro) 세포의 염증 활성을 억제하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 염증 활성 인자 발현의 억제는 TNF-α, IL-1β, iNOS, COX-2, NLRP3, ASC, caspase-1의 발현을 억제하여 NF-kB와 NLRP3-인플라마솜 염증조절복함체 경로 활성화를 억제하며, 염증성 싸이토카인인 TNF-a와 IL-1b의 생성을 억제하는 효과를 통해 이루어질 수 있다.
[화학식 1]
상기 화학식에서,
상기 R1 내지 R6은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, 히드록시, C1-6의 알킬에스터기 및 C6 -15의 아릴에스터기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
바람직하게 상기 화학식에서, 상기 R1 내지 R6은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, -OH, OMe, OAc 및 
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 시험관(in vitro)내에서 LPS에 의해 염증 활성이 유도된 세포에서의 염증 활성을 억제하는 방법은 상기 세포를 배양하는 배지에 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물을 직접 처리하거나, 또는 상기 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 조성물을 배양 배지에 처리하는 것일 수 있다.
이때 상기 배양 배지에 처리할 수 있는 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 농도는 최종농도가 1 μM 내지 150 μM이 되도록 처리할 수 있으며, 바람직하게는 가장 효과가 우수하면서 세포 독성이 없는 100 μM 내지 150 μM로 처리할 수 있다.
또한 본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
Ⅰ) 유기용매 또는 유기용매와 물의 공용매 및 염기 조건하에서, 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물의 히드록시기가 아세틸화, 알킬화 또는 아릴화되는 단계;를 통해 하기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물이 제조될 수 있다.
[화학식 6]
[화학식 1]
상기 화학식에서,
상기 R1 내지 R6은 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, 히드록시, C1-6의 알킬에스터기 및 C6 -15의 아릴에스터기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 아세틸화, 알킬화 또는 아릴화는 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물의 히드록시기의 수소가 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 C1 -6의 알킬기, 아세틸기, C6-15의 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환된 것이다.
바람직하게 상기 히드록시기의 수소가 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, OMe, OAc 및 
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 Ⅰ) 단계에서 제조된 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물에서의 히드록시기를 동일 또는 다른 치환기로 치환하기 위해, 상기 Ⅰ) 단계를 반복할 수 있는데, 구체적으로 상기 Ⅰ) 단계에서 제조된 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 히드록시기를 알킬화 또는 아릴화하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상술한 과정을 거치게 되면 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물의 히드록시기의 수소가 적어도 하나 이상 종류의 치환기로 치환된 플라보노이드계 화합물을 얻을 수 있다. 예컨대 하기 화학식 4, 5로 표시되는 화합물이 제조될 수 있다.
상기 알킬화 또는 아릴화는 상기 Ⅰ) 단계에서 제조된 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 히드록시기의 수소를 C1-6의 알킬기, C6-15의 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환하는 것이다.
바람직하게 상기 히드록시기의 수소가 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로, OMe 또는 
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 치환되는 것일 수 있다.
상기 유기용매는 디에틸에테르, 테트라히드로퓨란, 메틸렌클로라이드, 메탄올, 시클로헥센, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 이에 한정되지 않는다.
상기 염기는 NaHCO3, K2CO3 및 Et3N으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 Ⅰ) 단계는 20-70 ℃에서 10-30 시간 동안 수행하여 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물을 제조한다.
상기 제조방법을 통해 수득된 상기 화학식 1로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 수율은 10-80%인데, 이들 중에서도 특히 화학식 2로 표시되는 화합물의 수율은 69 내지 80%로 우수할 뿐만 아니라, 염증 관련 매개물질들의 발현 또는 생성을 억제하는 효과가 매우 우수하다. 아울러 150 μM 이하의 함량에서는 세포 독성도 현저히 낮은 안전한 물질이다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
시약
배양배지인 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)와 FBS(소태야혈청, fetal bovine serum)은 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구입하였다.
고시페틴(gossypetin)은 Carbone scientific에서 구입하였고, DMSO(Dimethylsulfoxide), MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide), EtBr(ethidium bromide)과 DCF-DA(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
BCA 단백질 검출 시약(bicinchoninic acid)은 Thermo Scientific Pierce(Rockford, IL, US)에서 구입하였고, IL-1β, NLRP3, ASC and Caspase and β-actin은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.
또한, TNF-α, IkB-α, p-IkB-α, and p65는 ell Signaling Technology, Inc.,(Danvers, MA, USA)에서 구입하였고, PGE2 Biorbyt(Biorbyt LLC, CA, USA)에서 구입하였다.
또한 COX-2 Cayman(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였고, HIF-1α Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, iNOS Novus(Novus Biologicals LLC, LT, USA)에서 구입하였다.
이외 모든 시약은 별도의 언급이 없는 한 분석용 시약(analytical grade)을 사용하였다.
참고예
1. 세포주 및 세포 배양
미국 ATCC로부터 분양받은 Raw 264.7 세포를 사용하였다. 상기 세포는 1% P/S, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여, 37 ℃에서 습한 5% CO2 분위기 하에서 배양하였다. 예컨대 세포가 습한 5% CO2 분위기에서 37 ℃ 조건하에서, 군집이 80% 도달한 후 전배양을 하였다.
참조예
2. 세포 생존율 분석(Cell viability assay)
Raw 264.7 세포의 생존력은 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)를 이용하여 분석할 수 있고, 이러한 세포의 생존력 분석을 통해 선별된 화합물의 세포 독성 여부를 확인할 수 있다.
우선, Raw 264.7 세포를 96-웰 배양 플레이트(well culture plate)에 2 × 104 cells/well 밀도로 분주(seeding)한 다음, 24 시간 배양하였다. 상기 배양된 세포에 다양한 농도의 화합물을 처리하고, 24 시간동안 반응시킨 후, 여기에 MTT를 최종 농도가 0.5 ㎎/㎖가 되도록 첨가하고, 이를 37 ℃에서 3 시간동안 배양한 후, 배양액을 모두 제거하고, 형성된 포르마잔 결정(formazan crystals)을 DMSO(100 ㎕)에 완전히 용해시킨 다음, 이를 VERSA Max Microplate Reader(Molecular Devices Corp., CA, USA) 장치로 540 ㎚에서 흡광도(OD, optical density)를 측정하였으며, 아래 수학식 1에 따라 세포 생존율(%)을 계산하였다.
[수학식 1]
세포 생존율(Cell viability)(%) = [(A540, OD of drug-treated sample) / (A540, OD of untreated sample)] × 100
상기 수학식 1에서,
상기 drug-treated sample은 화학식 2 내지 6의 화합물로 처리한 세포로부터 측정된 A540이고,
상기 untreated sample은 아무것도 처리하지 않은 세포로부터 측정된 A540 이다.
참고예
3.
Annexin
V-
FITC
/
propidium
iodide(PI) 염색
세포사멸체(apoptotic) 세포를 분석하기 위해, 우선 Raw 264.7 세포를 60 ㎜ 세포 배양 접시에 2×104 세포밀도로 분주(seeding)하여, 24시간 후에 LPS(1 ㎍/㎖)를 조사(irradiate)하거나 각기 다른 농도의 합성예 2로부터 합성된 화학식 2의 화합물(6, 30 및 150 μM) 또는 이부프로펜(10 μM)으로 처리하였다.
다음 상기 세포에 annexin V-FIRC/propidium iodide(PI) 이중 염색을 이용하는 FITC-Annexin V Apoptosis 검출 키트(BD Pharmingen, Bedford, USA)으로 처리하여, 상기 세포를 염색한 후, 100 ㎕ Annexin V 바인딩 버퍼에 재현탁하고, Annexin V 5 ㎕와 PI 5 ㎕로 염색한 다음 상온의 빛이없는 암환경에서 15 분간 배양하였다.
상기 염색된 시료들은 즉시 Guava EasyCyte Plus Flow Cytometer system(Merck Millipore, Billerica, MA, USA)에 의해 관찰하였다.
참고예
4.
DCF
-DA(
Dichlorofluorescein
diacetate
) 분석
세포내 활성산소종(ROS)의 형성을 분석하기 위하여, 2',7'-DCF-DA(Dichlorofluorescein diacetate)의 형광 방출을 사용하였다. 상기 2',7'-DCF-DA(Dichlorofluorescein diacetate) 형광 물질은 세포의 세포질을 투과할 수 있고, 활성산소종에 의해 2'-7'-DCF(dichlorofluorescein)로부터 세포내 에스테라아제에 의해 가수분해되고, 산화되어 진다.
분석을 위해서 Raw 264.7 세포를 60 ㎜ 세포 배양 접시에 2×104 세포밀도로 분주하고, LPS를 처리하여 배양한 다음 각기 다른 농도의 화학식 2로 표시되는 화합물(6, 30 및 150 μM) 또는 이부프로펜(10 μM)으로 처리한 후, DPBS로 두차례 세척한 후, DMEM에 용해된 10 μM DCF-DA 용액(페놀 레드 무첨가)으로 30 분간 37 ℃, 빛이 차단된 암환경하에서 로딩하였다.
상기 세포 외에 존재하는 염색을 제거하기 위해 DPBS로 두차례 세척하고, 유세포 분석기(flow cytometry)로 이미지를 분석하였다.
참조예
5.
웨스턴
블롯
분석
배양이 완료된 세포를 배양기에서 꺼내, 차가운 PBS로 세 차례 세척한 후, 이를 원심분리 튜브에 옮겨 PRO-PREP 단백질 추출 용액으로 4 ℃에서 20 분간 용해(lysed)한 다음, 이를 원심분리(12,000 rpm, 5 분)한 다음 상등액을 모아, 여기에 존재하는 단백질을 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Ficher Scientific Inc.)를 사용하여 정량하였다.
동일한 양의 단백질을 포함하는 상등액을 SDS-PAGE 전기영동하고, 전기영동된 겔 상의 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인(Merck Millipore)에 280 ㎃로 90 분간 옮겼고, 멤브레인을 5% 스팀밀크분말(nonfat milk powder)(with 0.1% Tween-20 in PBS)로 블로킹한 다음 4 ℃에서 밤새 1차 항체를 반응시켰다. 이후 상기 멤브레인을 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS 버퍼액으로 세차례 세척하고, 2차 항체를 반응시켰다. 항체 반응이 끝난 멤브레인은 형성된 단백질-항체 복합체를 측정하기 위해, ECL 발색 시약(Luminata crescendo western HRP substrate, Merck Millipore)과 Davinch chemi imager(Davinch-K, Seoul, Korea)로 측정하였다.
밴드 세기는 Image-J 소프트웨어(Image Processing and Analysis in Java; NIH, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 정량하였다.
참조예
6.
PCR
분석
참고예 1에서 배양된 RAW 264.7 세포를 1×104 cells/well로 6 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 상기 웰을 그룹으로 나누어서, 각각 화학식 2 내지 6의 화합물을 각기 다른 농도로 처리한 후 동시에 LPS를 처리한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
음성 대조군은 LPS만 처리하고, 정상구로서 아무것도 처리하지 않은 웰 그룹도 동일하게 배양하였다.
각 배양액을 QLAzol 용해 시약(QLAGEN, HD, Germany) 1 ㎖로 처리하여 RNA를 분리하고, 이를 UV 스펙트로미터(Beckman Coulter Inc, CF, USA)를 이용하여 정량하였다. 합성된 cDNA와 프라이머로는 각 염증인자 (IL-1α, TNF-α, NLRP3, ASC, Caspase-1) 유래의 것을 사용하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로 상기 IL-1α, TNF-α, NLRP3, ASC, Caspase-1의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
| 센스 프라이머 | 안티센스 프라이머 | |
| IL-1α | forward 5'-ATC-TCG-CAG-CAG-CAC-ATC-AA-3' | reverse 5'-ATG-GGA-ACG-TCA-CAC-ACC-AG-3' |
| TNF-α | forward 5'-CCT-CTC-ATC-AGT-TCT-ATG-GC-3' | reverse 5'-TTG-AAG-AGA-ACC-TGG-GAG-TA-3' |
| NLRP3 | forward 5'-AGA-GCC-TAC-AGT-TGG-GTG-AAA-TG-3' | reverse 5'-CCA-CGC-CTA-CCA-GGA-AAT-CTC-3' |
| ASC | forward 5'-GGA-TGC-TCT-GTA-CGG-GAA-GG-3' | reverse 5'-CGC-ATC-TTG-CTT-GGG-TTG-3' |
| Caspase-1 | forward 5'-AGG-CAT-GAC-AAT-GCT-GCT-ACA-A-3' | reverse 5'-TGT-GCA-AAT-GCC-TCC-AGC-TC-3' |
참조예
7. 질산(Nitric oxide) 검출
참고예 1에서 배양된 RAW 264.7 세포를 1×104 cells/well로 6 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 상기 웰을 그룹으로 나누워서, 각각 화학식 2 내지 6의 화합물을 각기 다른 농도로 처리한 후 동시에 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지에서의 아질산염(nitrite)의 생성량(μM)을 측정하기 위하여 총 NO 분석 키트(Thermo Fisher Scientific Inc)를 사용하여 NO 발현의 지시자를 검출하였다.
참조예
8. 통계 해석(statistical analysis)
모든 정량값은 post hoc Tukey's 다중 비교 테스트의 편도 분산 분석(one-way analysis)에 의해 분석하여, 평균치 ± 표준오차로 나타낸다. 위험율 P<0.05로 통계학적으로 의미가 있다고 판단했다.
<
합성예
> 대상 후보물질 스크리닝과 양성 대조군(positive control)
1) 대상 후보물질
상기 참고예 1에 따라 Raw 264.7 세포를 70-80% 성장시킨 다음, 여기에 후보물질을 처리하기 전, 상기 세포를 24 시간동안 무혈청 배지에서 배양하고, 이후에 후보물질을 DMSO에 용해하고 이를 상술한 세포의 무혈청 배양 혈청에 직접 첨가하여 항염증 효과를 보인 화합물을 선별하였다.
여기서 최종 DMSO 농도가 0.1%(v/v)를 초과하지 않도록 하는데, 상기 DMSO의 농도가 0.1%(v/v)를 초과하면 세포독성을 야기하거나, 세포 생존율에 영향을 주기 때문이다.
효과를 보이는 선별된 화합물 4종은 하기 합성예 2 내지 5에 따라 합성된 화학식 2 내지 6의 화합물이며, 아래 실험예를 통해 이들의 항염증 활성을 보다 구체적으로 비교하였다.
2) 양성 대조군(positive control)
상기 참고예 1에 따라 Raw 264.7 세포를 70-80% 성장시킨 다음, 상기 세포에 10 μM의 이부프로펜(Sigma-aldrich co. Inc)를 처리한 다음 24 시간 동안 배양한 것을 양성 대조군으로 사용하였다.
이때 상기 Raw 264.7 세포는 LPS 처리 없이 배지를 사용한 것을 사용한다.
합성예
1.
고시페틴
화합물
하기 화학식 6으로 표시되는 고시페틴 화합물은 Carbone scientific에서 구입한 것을 사용하였다.
[화학식 6]
합성예
2. 화학식 2로 표시되는
아세틸화된
고시페틴
화합물(
GD
1)의 합성.
H2O/THF(2㎖, 1:1)에 용해된 고시페틴 화합물을 오븐에서 건조한 튜브에 채우기 위하여, 상온에서 NaHCO3(168 ㎎, 4.0 mmol, 2000 mol%)와 acetic anhydride(204.2 ㎎, 2.0 mmol, 1000 mol%)를 혼합하였다.
상기 반응물을 12 시간동안 혼합하고, 이를 간수(brine)에 담그고, 에탄올과 물로 층을 분리하였다. 상기 층 중에서 유기층을 분리하여, 여기에 MgSO4를 넣어 섞어준 후 필터한 다음 회전농축기로 농축하였다.
상기 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-hexanes/EtOAc/Diethyl ether=1:1:1)를 이용하여 정제하여, 70%의 수율로 화학식 2로 표시되는 아세틸화된 고시페틴 화합물(GD 1) 74.3 ㎎을 수득하였다(반응식 1 참조). 분리된 화합물은 도 1a의 1H-NMR를 통해 확인하였다.
[반응식 1]
합성예
3. 화학식 3으로 표시되는 메틸화된
고시페틴
화합물(
GD
2)의 합성
아세톤(1 ㎖)에 용해된 고시페틴 화합물을 오븐에서 건조한 튜브에 채우기 위하여, 상온에서 아이오도메테인(iodomethane, 141.9 ㎎, 1.0 mmol, 500 mol%)와 K2CO3(276.4 ㎎, 2.0 mmol, 1000 mol%)를 혼합하였다.
상기 반응물을 60 ℃에서 12 시간동안 혼합하고, 이를 간수(brine)에 담그고, 에탄올과 물로 층을 분리하였다. 상기 층 중에서 유기층을 분리하여 여기에 MgSO4를 넣어 섞어준 후 필터한 다음 회전농축기로 농축하였다.
상기 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-hexanes/EtOAc=2:1)으로 정제하여, 10%의 수율로 메틸화된 고시페틴 화합물 6.5 ㎎을 수득하였다(반응식 2 참조). 분리된 화합물은 도 1b의 1H-NMR를 통해 확인하였다.
[반응식 2]
합성예
4. 화학식 4로 표시되는
아세틸화
/메틸화된
고시페틴
화합물(
GD
3)의 합성
아세톤(1 ㎖)에 용해된 화학식 2로 표시되는 화합물(합성예 2)(52.8 ㎎, 0.1 mmol, 100 mol%)을 오븐에서 건조한 튜브에 채우기 위하여, 상온에서 아이오도메테인(iodomethane, 28.4 ㎎, 0.2 mmol, 200 mol%)와 K2CO3(55.3 ㎎, 0.4 mmol, 400 mol%)를 혼합하였다.
상기 반응물을 60 ℃에서 12 시간동안 혼합하고, 이를 간수(brine)에 담그고, 에탄올과 물로 층을 분리하였다. 상기 층 중에서 유기층을 분리하여 여기에 MgSO4를 넣어 섞어준 후 필터한 다음 회전농축기로 농축하였다.
상기 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc)으로 정제하여, 46%의 수율로 아세틸화/메틸화된 고시페틴 화합물 24.8 ㎎을 수득하였다(반응식 3 참조). 분리된 화합물은 도 1c의 1H-NMR를 통해 확인하였다.
[반응식 3]
합성예
5. 화학식 5로 표시되는
아세틸화
/
벤조일화된
고시페틴
화합물(
GD
4)의 합성
MC(1 ㎖)에 용해된 화학식 2로 표시되는 화합물(합성예 2)(26.0 ㎎, 0.05 mmol, 100 mol%)을 오븐에서 건조한 튜브에 채우기 위하여, 상온에서 벤조일클로라이드(benzoylchloride, 50.0 ㎎, 0.35 mmol, 700 mol%)와 트리에틸아민(triethylamine, 25.0 ㎎, 0.25 mmol, 500 mol%)를 혼합하였다.
상기 반응물을 상온에서 12 시간동안 혼합하고, 이를 간수(brine)에 담그고, 에탄올과 물로 층을 분리하였다. 상기 층 중에서 유기층을 분리하여 여기에 MgSO4를 넣어 섞어준 후 필터한 다음 회전농축기로 농축하였다.
상기 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(n-hexanes/EtOAc=1:1)으로 정제하여, 84%의 수율로 아세틸화/벤조일화된 고시페틴 화합물 26.5 ㎎을 수득하였다(반응식 4 참조). 분리된 화합물은 도 1d의 1H-NMR를 통해 확인하였다.
[반응식 4]
<
실험예
>
실험예
1. 세포 독성
상기 참조예 2의 세포생존율 분석에 따라, Raw 264.7 세포에서의 합성예 1-5의 화합물 처리군 및 양성 대조군에 따른 세포 생존율(%)을 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
이때, 사용된 화합물은 화학식 6의 화합물(합성예 1), 화학식 2의 화합물(합성예 2)(100, 150 및 200 μM)과 화학식 3의 화합물(합성예 3)(10, 50 및 250 μM) 화학식 4의 화합물(합성예 4)(100, 150 및 200 μM) 및 화학식 5의 화합물(합성예 5)(10, 50 및 250 μM)을 사용하였고, 양성 대조군으로 이부프로펜(10, 50 및 250 μM)을 사용하였다.
구체적으로 도 2는 Raw 264.7 세포에 화학식 2-6의 화합물과 양성 대조군인 이부프로펜을 각각 처리한 후, 이에 따른 세포 생존율(%)을 분석하여 나타낸 그래프이다.
구체적으로 도 2a는 합성예 1로부터 합성된 고시페틴 화합물(gossypetin)로 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 생존율(%)을 나타낸 그래프이고, 도 2b는 화학식 2로 표시되는 화합물(합성예 2)(GD 1)로 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 생존율(%)을 나타낸 그래프이며, 도 2c는 화학식 3의 화합물(합성예 3)(GD 2)로 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 생존율(%)을 나타낸 그래프이며, 도 2d는 화학식 4의 화합물(합성예 4)(GD 3)로 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 생존율(%)을 나타낸 그래프이며, 도 2e는 화학식 5의 화합물(합성예 5)(GD 4)로 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 생존율(%)을 나타낸 그래프이며, 도 2f는 양성 대조군인 이부프로펜으로 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
이때 음성 대조군(control)은 세포에 아무것도 처리하지 않은 Raw 264.7 세포의 세포 생존율(%)을 나타낸 것이다.
또한 실험 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다(*p<0.05 및 **p<0.01).
도 2에 나타난 바에 따르면 200 μM 이상의 화학식 6의 화합물(합성예 1, Gossypetin)로 처리할 경우, 세포 성장이 저하되는 것을 확인하였고, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(GD 1)은 150 μM 이상부터 세포 성장을 저해하는 것으로 확인되었으며, 화학식 3의 화합물(합성예 3)(GD 2)은 10 μM 이상에서 세포 성장을 저해하고 있음을 확인하였다.
또한 화학식 4의 화합물(합성예 4)(GD 3)은 100 μM 이상에서 세포 성장을 저해하였으며, 화학식 5의 화합물(합성예 5)(GD 4)는 150 μM 이상에서 세포 성장을 저해하였고, 양성 대조군인 이부프로펜의 경우, 10 μM 이상에서 세포성장을 저해하는 것을 확인하였다.
즉 화학식 6의 화합물(합성예 1, Gossypetin)과 본 발명에 따른 화학식 2의 화합물(합성예 2)(GD1), 화학식 4의 화합물(합성예 4)(GD 3) 및 화학식 5의 화합물(합성예 5)(GD 4)은 세포 독성이 현저히 낮은 것을 확인할 수 있다.
다만 화학식 3의 화합물(합성예 3)(GD 2)와 이부프로펜은 10 μM의 낮은 농도에서도 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예
2.
LPS
처리에 따른 세포 독성
참조예 2의 세포생존율 분석에 따라, Raw 264.7 세포에서의 LPS(lipopolysaccharide) 처리에 따른 세포 생존율(%)을 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 Raw 264.7 세포에서, LPS 처리에 따른 세포 생존율(%)을 분석하여 나타낸 그래프이다. 참고예 2에서 세포에 LPS를 처리한 것을 제외하고 모두 참고예 2와 동일하게 수행되었다. 실험 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다(*p<0.05 및 **p<0.01).
도 3의 그래프에서 c는 LPS를 처리하지 않은 Raw 264.7 세포의 생존율(%)을 분석하여 나타낸 것이다.
도 3에 나타난 바와 같이, Raw 264.7 세포를 LPS로 처리할 경우, 1 ㎍/㎖에서는 12시간까지는 세포 독성 영향을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 따라서 LPS는 1 ㎍/㎖의 농도 이하, 또는 12 시간 이내에 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
실험예
3.
LPS
처리된 Raw 264.7 세포에서 염증성 질환과 관련된 매개물질의 발현여부
Raw 264.7 세포를 LPS로 2, 4, 6, 12, 24, 48 시간별로 반응시킴에 따라 염증성 질환과 관련된 매개물질의 발현 여부를 확인하였다.
도 4a는 LPS 처리 시간에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 도 4b는 도 4a에서 LPs 처리 시간에 따른 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 4c는 도 4a에서 LPs 처리 시간에 따른 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 4d는 도 4a에서 LPs 처리 시간에 따른 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 4e는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 4f는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 P65의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 4g는 도 4a에서 LPS 처리 시간에 따른 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이때, C 또는 control로 표기된 것은, 음성 대조군으로 Raw 264.7 세포에 아무것도 처리하지 않고 측정한 것이다.
도 4에 나타난 바에 따르면 LPS 처리시 Raw 264.7 세포에서 염증성 사이토카인은 12 시간과 24 시간에서 가장 높았고, 염증성 매개물질은 2시와 12 시간에서 가장 높았다.
도 5a는 LPS 처리 시간에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 도 5b는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 5c는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 5d는 도 5a에서 LPS 처리 시간에 따른 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
이때, C 또는 control로 표기된 것은, 음성 대조군으로 Raw 264.7 세포에 아무것도 처리하지 않고 측정한 것이다.
이러한 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체는 2 내지 6시간까지 발현이 우수하였다. 상술한 결과를 토대로 하여 이후, 화학식 2 내지 6의 화합물의 영향을 분석하고자 할 때, 이를 참고할 수 있다.
실험예
4.
LPS
유도 염증 활성 세포에서의
고시페틴
화합물 또는 치환된
고
시페틴 화합물의 항염증 효과 분석(1)
상기 참조예 5의 웨스턴 블롯 분석에 따라, LPS 처리를 통해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서의 시료(화학식 2 내지 6의 화합물 등)의 처리/비처리에 따른 염증 관련 매개물질의 발현 정도를 분석하여 도 6 및 7에 나타내었다.
이때, 상기 시료는 화합물 종류에 따라 각기 다른 농도로 사용하였는데, 구체적으로 화학식 6의 화합물(합성예 1)(Gossypetin)은 200 μM, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(GD1)은 150 μM, 화학식 3의 화합물(합성예 3)(GD 2)은 10 μM, 화학식 4의 화합물(합성예 4)(GD 3)은 100 μM 및 화학식 5의 화합물(합성예 5)(GD 4)은 50 μM로 사용하였다.
도 6a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2 내지 6의 화합물의 처리/비처리에 따른 염증성 매개물질(IL-1β, TNF-α, HIF1-α, COX-2, NF-kB(P65), iNOS 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 도 6b는 도 6a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 6c는 도 6a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 6d는 도 6a에서 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 6e는 도 6a에서 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 6f는 도 6a에서 PGE2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 6g는 도 6a에서 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
상기 그래프에서 해당하는 시료를 처리한 군은 '+'로, 해당하는 시료를 처리하지 않은 군은 '-'로 나타내었고, 화학식 2 내지 5의 화합물(GD 1-4)의 경우 처리한 시료의 숫자를 표기하였고, 숫자가 표기되지 않은 군은 화학식 2 내지 6의 화합물(GD 1-4)을 처리하지 않은 것이다.
도 7a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2 내지 6의 화합물의 처리/비처리에 따른 염증성 매개물질(NLPR3, ASC, Caspase-1(P10) 및 β-actin)의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 도 7b는 도 7a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 7c는 도 7a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 7d는 도 7a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
이 역시 상기 그래프에서 해당하는 시료를 처리한 군은 '+'로, 해당하는 시료를 처리하지 않은 군은 '-'로 나타내었고, 화학식 2 내지 5의 화합물(GD 1-4)의 경우 처리한 시료의 숫자를 표기하였고, 숫자가 표기되지 않은 군은 화학식 2 내지 6의 화합물(GD 1-4)을 처리하지 않은 것이다.
상술한 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(GD 1)이 다른 화학식 3 내지 6의 화합물에 비해 상대적으로 현저히 우수한 염증 반응 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다. 특히 NLRP3와 NF-kB 경로(pathway)를 억제하고 있음을 알 수 있었다.
아울러, 도 7을 통해, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(GD 1)로 처리할 경우, 주요한 염증성 복합체인 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체의 활성화를 가장 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 화학식 2의 화합물(합성예 2)(GD 1)이 이부프로펜 또는 화학식 6의 화합물(합성예 1)(Gossypetin)에 비해 상대적으로 매우 우수한 항염증 억제 활성을 가지고 있음을 나타내는 것이다.
또한, 상기 참조예 5의 웨스턴 블롯 분석에 따라, LPS 처리를 통해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(도 8에서는 AG로 표기하였음)의 농도(0, 6, 30, 150 μM)에 따른 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 분석하여 도 8에 나타내었다.
LPS 처리에 의해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서의 항염증 효과를 조사하기 위하여, LPS 유도된 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체를 웨스턴 블롯 분석을 통해 규명해보았다.
도 8a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 도 8b는 도 8a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 8c는 도 8a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 8d는 도 8a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 실험 결과는 평균±표준편차로 표기하였다(*p < 0.05 and **p < 0.01)(#p < 0.05 and ##p < 0.01).
도 8a에서 '+'는 처리를 의미하며, '-'는 비처리를 의미한다.
도 8에 나타난 바와 같이, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도가 증가함에 따라 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체의 구성원인 NLRP3, ASC 및 Caspase-1이 억제되고 있음을 확인하였다.
실험예
5.
LPS
유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(
합성예
2)(AG)의 항염증 효과 분석(2)
상기 참조예 5의 웨스턴 블롯 분석에 따라, LPS 처리를 통해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도(0, 6, 30, 150 μM)에 따른 NF-kB 경로를 분석하여 도 9에 나타내었다.
LPS 처리에 의해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서의 NF-kB 저해제로서의 효과를 조사하기 위하여, LPS 유도된 NF-kB를 웨스턴 블롯 분석을 통해 규명해보았다.
도 9a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NF-kB 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 도 9b는 도 9a에서 IkB-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 9c는 도 9a에서 p-IkB-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 9d는 도 9a에서 p65의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 실험 결과는 평균±표준편차로 표기하였다(*p < 0.05 and **p < 0.01)(#p < 0.05 and ##p < 0.01).
도 9a에서 '+'는 처리를 의미하며, '-'는 비처리를 의미한다.
도 9에 나타난 바와 같이, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도가 증가함에 따라 IkB-α가 억제되고 있음을 확인하였고, 환언하면 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)은 LPS 처리를 통해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서 p65의 발현을 억제한다고 볼 수 있다.
아울러, 세포질의 IkB-α가 핵안으로 이동하는 것을 본 발명에 따른 화학식 2 내지 5의 화합물, 바람직하게는 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)이 억제하는 것을 확인하였다.
실험예
6.
LPS
유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(
합성예
2)(AG)의 항염증 효과 분석(3)
상기 참조예 5의 웨스턴 블롯 분석에 따라, LPS 처리를 통해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도(0, 6, 30, 150 μM)에 따른 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome) 복합체와 관련된 유전자를 분석하여 도 10에 나타내었다.
LPS 처리에 의해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서의 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome)과 NF-kB 경로와 관련된 염증 전(pro-inflammatory) 발현 여부를 조사하였다.
도 10a는 LPS 유도 염증이 활성화된 Raw 264.7 세포에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome)과 NF-kB 경로와 관련된 유전자 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 도 10b는 도 10a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도10c는 도 10a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10d는 도 10a에서 COX-2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10e는 도 10a에서 HIF-1α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10f는 도 10a에서 PPCE2의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 10g는 도 10a에서 iNOS의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 실험 결과는 평균±표준편차로 표기하였다(*p < 0.05 and **p < 0.01)(#p < 0.05 and ##p < 0.01).
도 10a에서 '+'는 처리를 의미하며, '-'는 비처리를 의미한다.
도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 합성예 2의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)은 NLRP3-인플라마솜(NLRP3-inflammasome)과 NF-kB 경로와 관련된 염증성 매개물질인 HIF-1α, COX-2, IL-1β 및 TNF-α 등을 효과적으로 억제하고 있음을 확인할 수 있다. 게다가 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도가 증가함에 따라 이러한 억제 효과역시 증대되고 있음을 확인하였다.
실험예
7.
LPS
유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(
합성예
2)(AG)의
활성산소종
억제 효과 분석.
상기 참고예 4의 DCF-DA 분석에 따라, LPS 처리를 통해 염증활성이 유도된 Raw 264.7 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도(0, 6, 30, 150 μM)에 따른 생성된 활성산소종(ROS)를 분석하여 도 11에 나타내었다.
이때 양성 대조군으로 참고예 1에 따라 배양된 Raw 264.7 세포에서, 이부프로펜(10 μM)으로 처리한 것을 사용하였고, 음성 대조군(control)으로 아무것도 처리하지 않은 세포를 사용하였다.
도 11a 내지 도 11f는 LPS 유도된 염증 활성 세포(Raw 264.7)에서, 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 농도에 따른 ROS 생산 정도를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 11a는 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(control)이고, 도 11b는 LPS 만으로 처리한 것이고, 도 11c는 이부프로펜(10 μM)으로 처리한 양성 대조군(positive control)이며, 도 11d는 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)(6 μM)로 처리한 것이며, 도 11e는 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)(30 μM)로 처리한 것이며, 도 11f는 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)(150 μM)로 처리한 것이다.
도 12는 도 11의 결과를 수치화하여 막대 형태로 나타낸 그래프이다.
실험 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다(*p < 0.05 and **p < 0.01)(#p < 0.05 and ##p < 0.01).
도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, LPS로 활성화된 ROS 생성은 산화적 스트레스와 염증성 매개물질로 유도되어 지는데, 합성예 2의 아세틸화 고시페틴 화합물(AG)로 처리된 경우에는 농도 의존적으로 ROS 생성량이 억제되는 것을 확인하였다.
특히, 150 μM의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)은 LPS로 활성화된 ROS 생성을 상대적으로 더욱 현저히 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.
실험예
8.
LPS
유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(
합성예
2)(AG)의 세포사멸(
apoptosis
) 억제 효과 분석
LPS 처리를 통해 염증 활성이 유도된 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)이 세포사멸(apoptosis) 억제 효과를 가지는 여부를 알아보기 위하여, 상기 참고예 3에 따라 Annexin V-FITC/propidium iodide(PI) 염색 분석을 통해 관찰하였다.
도 13은 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 세포사멸(apoptosis) 억제 효과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 13a는 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(control)이고, 도 13b는 LPS 만으로 처리한 것이고, 도 13c는 이부프로펜(10 μM)으로 처리한 양성 대조군(positive control)이며, 도 13d는 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)(6 μM)로 처리한 것이며, 도 13e는 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)(30 μM)로 처리한 것이며, 도 13f는 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)(150 μM)로 처리한 것이다.
도 13에 나타난 바와 같이, LPS 1 ㎍/㎖로만 처리된 세포의 경우(b), 괴사성(necrosis) 및 세포사멸(apoptosis)를 5.28% 발생하는 것을 확인하였다. 결론적으로 세포사멸 및 괴사는 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 처리를 통해 현저히 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
특히 6, 30, 150 μM의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)를 처리한 경우 세포생존율이 각각 95.90%, 97.30%, 97.66%로 증가되었다.
실험예
9.
PCR
분석
상기 참고예 6에 따라, LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 IL-1α, TNF-α, NLRP3, ASC, Caspase-1와 같은 다양한 염증 인자들의 활성을 저해하는 효과를 측정하였다.
도 14a는 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 IL-1α, TNF-α, NLRP3, ASC, Caspase-1와 같은 다양한 염증관련 매개물질들의 발현 여부를 PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 14b는 도 14a에서 NLRP3의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이고, 도 14c는 도 14a에서 ASC의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14d는 도 14a에서 Caspase-1의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14e는 도 14a에서 TNF-α의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이며, 도 14f는 도 14a에서 IL-1β의 발현 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 실험 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다(*p < 0.05 and **p < 0.01)(#p < 0.05 and ##p < 0.01).
도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 치화된 고시페틴 화합물은 대표적 염증성 싸이토카인인 TNF-α와 IL-1β를 효과적으로 억제하고 있음을 확인하였으며, 또한 NLRP3-인플라마솜(infalmmasome) 복합제에서 NLRP3의 활성을 억제하는 것을 확인하였다.
실험예
10.
LPS
유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(
합성예
2)(AG)의 아질산염 분비 억제 효과 분석
상기 참고예 7에 따라, LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)의 아질산염 분비 억제 효과를 측정하였다.
도 15는 LPS 유도 염증 활성 세포에서의 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG) 농도(μM)에 따른 아질산염(nitrite)의 발생량을 나타낸 것으로, control은 음성 대조군으로 아무것도 처리하지 않은 Raw 264.7 세포이고, LPS는 LPS만 처리한 Raw 264.7 세포이고, Ipuprofen 10 μM은 양성 대조군으로 LPS 유도 염증 활성 세포에 이부프로펜 10 μM 처리한 것이다. 실험 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었다(*p<0.05 및 **p<0.01)(#p < 0.05 및 ##p < 0.01.).
도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)은 아질산염 분비를 현저히 억제하고 있음을 확인할 수 있고, 특히 150 μM을 사용할 경우가 다른 농도를 사용할 경우보다 2배 가까이 아질산염 분비를 억제하고 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 2의 화합물(합성예 2)(AG)은 100 내지 150 μM 농도로 사용되는 것이 바람직하며, 항염증 효과도 2 배 이상 우수하다는 것을 알 수 있다.
Claims (11)
- 하기 화학식 2로 표시되는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물:
[화학식 2]
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 화학식 2로 표시되는 플라보노이드계 화합물은 하기 특성 중 어느 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
1) 세포내 산화질소(NO) 분비 억제;
2) 염증 관련 매개물질인 TNF-α, IL-1β, iNOS, COX-2의 발현 억제;
3) NF-kB와 NLRP3-인플라마솜 염증조절복함체 경로 활성화 억제; 및
4) 활성산소종 생성 억제; - 제1항에 있어서,
상기 화학식 2로 표시되는 플라보노이드계 화합물이 1 내지 150 μM의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물. - 제1항에 있어서,
상기 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 패혈증, 피부염, 치주염 및 치은염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물. - LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 염증 활성 인자 발현을 억제하는데 유효한 하기 화학식 2로 표시되는 플라보노이드계 화합물과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 세포의 염증 활성의 억제 방법.
[화학식 2]
- Ⅰ) 유기용매 또는 유기용매와 물의 공용매 및 염기 조건하에서, 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물의 히드록시기가 아세틸화, 알킬화 또는 아릴화되는 단계;를 포함하는 하기 화학식 2로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 제조방법.
[화학식 6]
[화학식 2]
- 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 염기는 NaHCO3, K2CO3 및 Et3N으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 플라보노이드계 화합물의 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 Ⅰ) 단계는 20-70 ℃에서 10-30 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 플라보노이드계 화합물의 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 제조방법을 통해 수득된 상기 화학식 2로 표시되는 플라보노이드계 화합물의 수율이 10-80%인 것을 특징으로 하는 플라보노이드계 화합물의 제조방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160033946A KR101763315B1 (ko) | 2016-03-22 | 2016-03-22 | 항염증 활성을 갖는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 이의 합성방법 |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101763315B1 true KR101763315B1 (ko) | 2017-07-31 |
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| KR1020160033946A KR101763315B1 (ko) | 2016-03-22 | 2016-03-22 | 항염증 활성을 갖는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 이의 합성방법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200125047A (ko) * | 2019-04-25 | 2020-11-04 | 한국원자력연구원 | 항염 활성을 갖는 플라보노이드 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 개선용 조성물 |
| WO2020231024A1 (ko) * | 2019-05-14 | 2020-11-19 | 주식회사 노브메타헬스 | 고시페틴을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2016
- 2016-03-22 KR KR1020160033946A patent/KR101763315B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Phytochemistry Letters, 2014, vol. 7, pp. 150~155* |
| The Journal of Nutrition, 2007, vol. 137, pp. 2190~2195* |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20200125047A (ko) * | 2019-04-25 | 2020-11-04 | 한국원자력연구원 | 항염 활성을 갖는 플라보노이드 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 개선용 조성물 |
| KR102251529B1 (ko) | 2019-04-25 | 2021-05-13 | 한국원자력연구원 | 항염 활성을 갖는 플라보노이드 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 염증 개선용 조성물 |
| WO2020231024A1 (ko) * | 2019-05-14 | 2020-11-19 | 주식회사 노브메타헬스 | 고시페틴을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 |
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