KR101883870B1

KR101883870B1 - 멀꿀 나무 추출물을 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101883870B1
Application number: KR1020160150644A
Authority: KR
Inventors: 임순성; 황승환; 권신화; 김샛별; 이수경
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2018-08-01
Also published as: KR20180053178A

Abstract

본 발명은 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 우수한 혈당 조절 및 알도스 환원 효소 억제 효능을 가져 당뇨합병증을 예방하거나 치료할 수 있는 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

멀꿀 나무 추출물을 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic complications containing stauntonia hexaphylla extract}

본 발명은 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 우수한 혈당 조절 및 알도스 환원 효소 억제 효능을 가져 당뇨합병증을 예방하거나 치료할 수 있는 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

당뇨병(diabetes mellitus, DM)은 인슐린 결핍 및 인슐린 저항성 또는 둘 모두를 특징으로 하는 흔히 비만과 관련되는 진행성 질환(progressive disease)이다. 공복 및 식후 혈당이 증가하면, 실명, 신부전, 심장 질환, 졸중(stroke) 및 절단(amputation)을 야기하는 급성 및 만성 합병증(미세혈관 및 대혈관(micro- and macro-vascular))에 환자가 노출된다. 혈당 조절의 개선이 이러한 당뇨합병증의 위험성을 낮추는 것으로 입증되었다.

이러한 질환의 진행적 속성 때문에, 혈당 조절을 유지하기 위해서는 진화하는 치료 전략이 필요하다. 2가지 형태의 당뇨병: 제1형 당뇨병, 또는 소아 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 및 제2형 당뇨병, 또는 성인형 당뇨병 또는 비 인슐린 의존성 당뇨병 (NIDDM)이 있다. 제1형 당뇨병 환자는 인슐린을 합성 및 분비하는 췌장 β세포의 면역학적 파괴로 인하여 절대적으로 인슐린이 부족하다. 제2형 당뇨병은 병인이 더 복합적이며 상대적인 인슐린 결핍, 인슐린 작용 감소, 및 인슐린 저항성을 특징으로 한다. 조기 발생 NIDDM 또는 소아발생 성인형 당뇨병(maturity-onset diabetes of the young; MODY)은, 중년에 발병하는 가장 일반적인 형태의 NIDDM의 많은 특성을 공유한다(Rotter 외, 1990). 명확한 방식의 유전(상염색체 우성)이 MODY에 대해 관찰되었다. 적어도, 3가지의 전혀 다른 돌연변이가 MODY 가족에서 확인되었다 (Bell 외, 1996).

한편, 당뇨합병증은 신경병증, 신장병증, 백내장, 심근경색증, 당뇨발궤양 또는 망막병증을 포함하며, 이의 주요 원인은 폴리올 경로의 알도스 환원 효소(aldose reductase) 활성으로 비롯한 과다 솔비톨 축적으로 알려져 있다. 따라서, 알도스 환원 효소의 억제가 당뇨합병증 치료 및 예방에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 지금까지 개발된 알도스 환원 효소 억제제들인 zopolrestat, ponalrestat, sorbinil, tolrestat, fidarestat, ranireatat와 epalrestat 등이 여러 동물실험에서 당뇨 합병증을 예방, 지연시킨다는 보고가 있다.

그러나 임상에서 zopolrestat와 ponalrestat은 효능이 낮았고, sorbinil의 과민반응과 tolrestat의 간기능 장애와 같은 부작용으로 개발 과정에서 중단되었다. 현재 일본과 미국에서는 ranireatat와 fidarestat의 임상실험이 진행되고 있다. Epalrestat는 미국식품의약국 (FDA)에는 승인되지 않았지만, 일본에서만 1992년에 승인되어 시판 중이다.

또한, 솔비톨 축적은 솔비톨 탈수소효소에 의해 과당으로 전환되어, 고농도의 과당이 단백질과 결합하여 결국은 최종당화산물(advanced glycation end products, AGE)의 형성을 가속화시킨다. 여기서, 최종당화산물은 생체 조직과 세포를 공격하여 노화를 촉진할 뿐만 아니라, 당뇨, 심장질환, 암 등을 포함해 다양한 질환을 유발하는데 관여한다고 알려져 있다. 또한, 최종당화산물이 형성되면 혈관 벽이나 림프구 등의 세포막에 최종당화산물과 결합할 수 있는 수용체(RAGE: Receptor of AGEs)가 만들어지는데, 최종당화산물이 수용체에 결합하면 염증과 관련된 각종 면역 인자가 활성화되어 만성질환을 유발하거나 악화시키게 된다.

한편, 멀꿀 나무(stauntonia hexaphylla)는 한국, 일본 및 중국의 따뜻한 산기슭과 저지대에 널리 퍼져있다. 멀꿀 나무는 통상적으로 진통제, 진정제 및 이뇨제 등에 사용된다. 최근에는 멀꿀 나무에 많은 관심을 받고 있으며, 그 이유로는 멀꿀 나무가 생물학적 활성, 항HIV-1, 항염증성 및 세포독성과 같은 다양한 성질을 가지고 있기 때문이다. 멀꿀 나무의 고지된 화학성분은 triterpenoids, glucosides, flavonoids, phenylpropannoids, phenolic glucosides 및 chlorogenic acid analogues 포함한다.

이에 따라. 멀꿀 나무 추출물을 이용한 종래기술로는 미국 공개특허공보 제2016-0193265호에는 stauntonia Hexaphylla 잎의 추출물을 활성 성분으로 포함한 해열제가 공지되어 있으며, 대한민국 공개특허공보 제 2013-0020095호에는 멀꿀 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 조성물이 공지되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제 1221617호에는 멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염조성물이 공지되어 있다.

그러나, 앞서 상술한 종래기술에서는 멀꿀 나무 추출물을 이용한 당뇨합병증의 예방 또는 치료에 사용한 것에 대한 기재는 보고된 바 없다.

이에 본 발명에서는 항산화 효과가 있고, 당뇨합병증의 예방 또는 치료에 대한 효과를 가지는 활성물질에 대한 연구를 진행하였다. 그 결과 멀꿀 나무 잎에 유기용매를 가하여 추출물을 수득한 경우 항산화 효과를 가질뿐만 아니라, 알도스 환원 효소 및 최종당화산물의 형성에 대하여 억제 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 알도스 환원 효소 및 최종당화산물의 형성을 억제 시킴으로써 당뇨합병증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 멀꿀 나무 추출물을 함유하는 당뇨합병증 의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대해 제공하고자 한다.

본 발명은 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 우수한 알도스 환원 효소 억제 효능 및 혈당 조절을 가져 당뇨합병증을 예방하거나 치료할 수 있는 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체 예에 따르면, 멀꿀 나무 추출물 및 분획물은 잎으로부터 얻는 것이 특증으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 추출물은 용매 추출법, 초음파 추출법, 초임계 추출법, 발효법 및 포제법에 의한 추출법으로부터 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수득할 수 있다.

멀꿀 나무 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 일 예로 멀꿀 나무 잎의 분쇄물에 추출용매를 가함으로써 제조하거나 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 더 가하여 분획하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 용매 추출법은 물 및 유기 용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 유기 용매는 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올, 상기 알코올 희석수 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성 용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다. 바람직하게는 70% 에탄올을 사용하여 추출하는 것이나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 추출 과정을 통하여 멀꿀 나무 잎내 포함된 유효성분을 더 많이 수득할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 다른 일 구체 예에 따르면, 멀꿀 나무 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는, 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 유기용매는 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 분획물은 멀꿀 나무 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 순으로 계통분획하여 얻은 헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물일 수 있다. 멀꿀 나무 에틸아세테이트 분획물이 알도스 환원 효소를 탁월한 억제율을 가짐으로써 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 멀꿀 나무 추출물 또는 멀꿀 나무 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일 예로 회전증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일 예로 동결건조법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 조성물은 당뇨합병증 발생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 글루코오스 대사경로인 폴리올 경로의 촉매 효소인 알도스 환원 효소를 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 조성물은 당뇨합병증으로 인해 최종당화산물의 형성을 억제할 수 있음을 확인함으로써, 멀꿀 나무 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 최종당화산물의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 조성물은 DPPH 라디칼을 소거 가능함을 확인함으로써, 상기 멀꿀 나무 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 멀꿀 나무 추출물 또는 분획물은 전체 조성물에 대해 0.1 내지 20.0 중량%로 함유되어 있는 것을 특징으로 한다. 여기서 상기 멀꿀 나무 추출물이 전체 조성물에 대해 0.1 중량% 미만이면 상기 멀꿀 나무 추출물의 유효 성분이 매우 적어 상기 상술한 효과를 나타낼 수 없으며, 상기 멀꿀 나무 추출물이 전체 조성물에 대해 20.0 중량% 초과하면 상기 멀꿀 나무 추출물 내 포함된 유효성분 외의 물질에 의해 알도스 환원 효소 억제 및 혈당 조절에 대한 효과가 떨어질 수 있다. 여기서, 바람직한 예로는, 상기 멀꿀 나무 추출물이 전체 조성물에 대해 0.5 내지 15 중량%이며, 더 바람직한예로는, 1 내지 10 중량%이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 구체 예에 따르면, 멀꿀 나무 추출물로부터 분리된, 하기 화학식 1 내지 화학식 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

여기서, R₁ 내지 R₃는 각각 독립적으로, H 또는 하기 화학식 4 이며;

[화학식 4]

R₄는 H이며;

R₅는 하기 화학식 5 내지 화학식 7 중 어느 하나이며;

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

R₆는

이며;

* 은 결합부위를 나타낸다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 화합물은 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionic acid, chlorogenic acid, neochlorogenic acid, calceolarioside B, luteolin-3'-O-glucoside, quercetin-3-O-glucoside, luteolin-7-O-glucoside 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 화합물이 luteolin-3'-O-glucoside 인 것이 알도스 환원 효소 억제능이 우수하여 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 화합물이 neochlorogenic acid인 것이 최종당화산물의 형성에 대하여 우수한 억제효과를 가짐으로 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 화합물이 calceolarioside B인 것이 우수한 항산화 효과를 가짐으로 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 일 구체 예에 따르면, 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 멀꿀 나무에 저급 알코올을 가하여 추출하는 단계; 및 상기 멀꿀 나무 추출물을 감압 농축하여 건조하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 저급 알코올은 에탄올인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 추출물을 수득한 후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 부탄올, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 분획과정을 추가로 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체 예에 따르면, 멀꿀 나무 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는, 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 멀꿀 나무에 저급 알코올을 가하여 추출하여 멀꿀 나무 추출물을 얻는 단계; 상기 멀꿀 나무 추출물을 감압 농축하여 건조하는 단계; 및 건조된 멀꿀 나무 추출물을 분획하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 건조된 멀꿀 나무 추출물을 분획하는 단계는 2종 이상의 용매를 이용하여 계통분획하는 단계일 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하거나 혼합하여 사용하여, 각 용매 분획물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 용매는 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 및 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 당뇨합병증은 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신장병증, 당뇨병성 심근경색증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장 및 당뇨발궤양으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘예방’이란 본 발명의 약학 조성물의 투여에 의해 당뇨합병증을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘치료’란 본 발명의 약학 조성물의 투여에 의해 당뇨합병증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, ‘비경구’는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명의 일 효과는 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 포함하여 항산화 효과를 갖는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 효과는 멀꿀 나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 알도스 환원 효소 및 최종당화산물을 억제시키는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예로 멀꿀 나무의 추출 및 계통분리를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 형태들을 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

[ 제조예1 ] 멀꿀 나무 추출물 및 분획물의 제조방법

건조된 멀꿀 나무 잎을 대광한약국(대한민국, 춘천)으로부터 구매하였다. 멀꿀 나무 잎은 70% 에탄올에 담은 상태로, 2시간동안 상온에서 추출하여 멀꿀 나무 추출물을 얻었다. 상기 추출물을 모아 40℃에서 감압 농축하여 건조시켰다. 건조된 추출물을 물에 현탁한 후, 순차적으로 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물을 가하여 각각의 멀꿀 나무 분획물을 얻었다.

[ 제조예 2] 멀꿀 나무 추출물로부터 화합물 분리하는 방법

상기 제조예 1를 통하여 얻은 멀꿀 나무 에틸아세테이트 분획물 내 포함된 화합물을 분리하기 위해 전개용매인 메탄올 및 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 사용하였다. 먼저, 전개용매로 메탄올-물(4:1, v/v) 및 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 멀꿀 나무 에틸아세테이트 분획물에서 하기 표1에 나타낸 화합물 1내지 화합물5을 분리하였다. 그 다음, 전개용매로 메탄올-물(1:1, v/v) 및 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 멀꿀 나무 에틸아세테이트 분획물에서 하기 표 1에 나타낸 화합물 6 및 화합물 7을 분리하였다.

여기서, 화합물 1내지 7은 각 화합물에 대한 ¹H NMR 스펙트라, ¹³C NMR 스펙트라 및 COSY, HMBC, 및 HMQC와 같은 상관 NMR 스펙트라를 얻어, 이를 이전에 보고된 데이터와 비교하여 구조를 규명하였다.

구분	화학 구조	화학 명
화합물 1		3-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionic acid
화합물 2		chlorogenic acid
화합물 3		neochlorogenic acid
화합물 4		calceolarioside B
화합물 5		luteolin-3'-O-glucoside
화합물 6		quercetin-3-O-glucoside
화합물 7		luteolin-7-O-glucoside

[ 제조예 3] 알도스 환원 효소 제조방법

저급 렛트 렌즈 알도스 환원효소는 하기 방법에 따라 제조되었다. 250 내지 280g의 수정체들을 Sprague Dawley 렛트로부터 제거되었으며, 사용하기 전 -70℃에 냉동시켰다. 백내장이 아닌 투명한 수정체(lens)를 적출하고, 균질액은 0.1M phosphate buffer saline (pH 6.2)에서 제조되었다. 상기 균질액은 10,000rpm에서 20분동안 냉장형 원심분리기를 이용하여 원심분리한 후, 그 상등액을 취하여 렛트 렌즈 알도스 환원 효소 시험의 효소원으로 사용하였다. 모든 절차는 4℃에서 이루어졌다.

[ 실험예1 ] 멀꿀 나무 추출물의 알도스 환원 효소 억제율 평가 방법

기질로 DL-glyceraldehyde를 사용하여 4분동안 340nm에서 NADPH 흡광도의 감소율을 분광광도계로 측정함으로써 알도스 환원 효소의 활성도를 평가하였다. 각 1.0ml 큐벳에 상기 제조예 3으로부터 준비된 동량의 알도스 환원 효소, 0.10M의 sodium phosphate buffer(pH 6.2), 0.3mM의 NADPH 및 실험군을 담았다. 상기 큐벳은 10mM기질을 포함하거나 포함하지않을 수 있다. 알도스 환원 효소 억제율은 알도스 환원효소 억제효과가 있다고 알려진 대조군으로 퀘르세틴(quercetin)을 사용하였으며, 상기와 같은 방법으로 처리하여 NADPH 흡광도의 감소율을 측정한 후 하기의 계산식으로 멀꿀 나무 잎 추출물 및 분획물의 알도스 환원 효소 억제율을 구하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

계산식1: 알도스 환원 효소 억제율={(cotrol-sample)/(control-blank)}*100

(control: 약물을 넣지 않은 상태에서 효소와 기질을 넣은 것, blank: 기질을 뺀 나머지를 모두 넣은 상태)

한편, 상기 제조예 2로부터 얻은 화합물 1내지 7에 대한 알도스 환원 효소의 활성이 50% 억제되는 시점에 대한 각 시료의 농도(IC₅₀)는 잔존 활성에 대해 표시된 로그 농도의 최소 제곱 회기선으로부터 산출하였다. 이 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

구분		알도스 환원 효소 억제율(%)
멀꿀 나무 잎 추출물	70% 에탄올 추출물	22.97±2.41
멀꿀 나무 잎 분획물	헥산	20.70±2.10
	메틸렌클로라이드	40.02±3.42
	에틸아세테이트	93.72±6.89
	부탄올	48.10±4.65
	물	2.45±0.21
양성 대조군	퀘르세틴	83.22±4.44

구분	IC ₅₀ ( μM )
화합물 1	>1000
화합물 2	8.35±0.45
화합물 3	72.03±25.77
화합물 4	23.99±2.30
화합물 5	7.34±0.35
화합물 6	10.40±1.38
화합물 7	16.10±1.20
양성 대조군(퀘르세틴)	18.09±1.30

상기 표 2와 같이, 멀꿀 나무 잎 추출물 및 분획물은 알도스 환원 효소를 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 멀꿀 나무 잎 분획물 중 에틸아세테이트 분획물은 93.72%의 알도스 환원 효소 억제율로 알도스 환원 효소 억제 효과가 탁월함을 나타내었다.

상기 표 3과 같이, 화합물 2, 5, 6 및 7은 각각 8.35, 7.34, 10.40, 및 16.10μM의 IC₅₀을 가짐으로써, 양성대조군에 비해 우수한 알도스 환원 효소에 대한 억제 효과를 가지는 것을 확인 하였다. 또한, 화합물 3 및 4는 각 72.03μM 및 23.99μM의 의 IC₅₀을 가짐으로써, 알도스 환원 효소에 대한 억제 효과를 가지는 것을 확인 하였다.

이 결과를 이용하여, 멀꿀 나무 잎 성분의 억제 성향과 구조적 활성에 대한 연관 관계를 조사하였다. 멀꿀 나무 잎 성분에 있어 잠재적 알도스 환원 효소에 대한 억제 효과는 카페 산 구조 내 quinic acid 및/또는 다른 ?COOH 잔기의 위치에 의존하는 것으로 보여진다 (화합물 2>화합물4>화합물3). caffeoylquinic acid가 알도스 환원 효소를 억제한 것에 근거로 가능한 매커니즘은 이 구조의 작용 위치와 연관될 수 있다. 게다가, 많은 flavonoids 내 당 위치의 구조적 성질은 알도스 환원 효소를 억제하는 것으로 보고되었다. luteolin에서 B링의 3’위치에 당 잔기가 증가함에 따라 알도스 환원 효소 억제 활성이 증가한다. 이와 대조적으로, luteolin에서 A링의 7’위치에 당 잔기가 증가함에 따라 알도스 환원 효소 억제 활성이 감소한다(화합물 5>화합물6>화합물7).

[ 실험예 2] BSA-메틸글리옥살을 이용한 최종당화산물 형성 평가 방법

우태아 혈청(bovine serum albumin) 용액(50mg/mL)에 메틸글리옥살(100mM)용액을 가하고, 각 실험군을 농도별로 처리한 후, 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 여기서, 우태아 혈청과 메틸글리옥살 용액은 sodium phosphate buffer(0.1M, pH 7.4)에 준비하였다. 그 다음, 형광분광광도계(Luminescence spectrometer, Perkin-Elmer Ltd., Buckinghamshire, England)를 이용하여 excitation 파장 355nm와 emission파장 460nm에서 형광도를 측정하였다. 비히클(vehicle)인 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO)는 반응에 영향을 미치지 않음을 발견하였으며 이를 대조군으로 사용하였다. 또한, 최종당화산물의 형성 억제제인 aminoguanidine(5.0mM)을 양성대조군으로 사용하였다. 모든 시약과 실험군은 0.2mm 막 필터를 통해 여과하여 멸균하였다.

상기와 같은 방법으로 처리하여 멀꿀 나무 추출물과 최종당화산물 형성 억제율은 하기의 식을 이용하여 계산하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

계산식2: 최종당화산물 형성 억제율=(1- 실험군의 형광도)/대조군의 형광도)*100

한편, 상기 제조예 2로부터 얻은 화합물 1내지 7에 대한 최종당화산물의 형성이 50% 억제되는 시점에 대한 각 시료의 농도(IC₅₀)는 잔존 최종당화산물의 형성에 대한 로그 농도의 최소 제곱 회기선으로부터 산출하였다. 이 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

구분		최종당산화물 형성 억제율(%)
멀꿀 나무 잎 추출물	70% 에탄올 추출물	23.39±1.19
멀꿀 나무 잎 분획물	헥산	22.63±2.80
	메틸렌클로라이드	41.05±3.91
	에틸아세테이트	99.81±5.99
	부탄올	45.51±4.19
	물	2.41±0.19
양성 대조군	aminoguanidine	84.28±7.14

구분	IC ₅₀ ( μM )
화합물 1	184.06±17.62
화합물 2	>1000
화합물 3	115.07±10.47
화합물 4	>1000
화합물 5	117.80±11.46
화합물 6	>1000
화합물 7	>1000
양성 대조군(aminoguanidine)	820.44±79.42

상기 표 4와 같이, 멀꿀 나무 잎 추출물 및 분획물은 최종당화산물의 형성을 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 멀꿀 나무 잎 분획물 중 에틸아세테이트 분획물은 99.91%의 최종당화산물 형성 억제율로 최종당화산물 형성 억제에 대한 효과가 탁월함을 나타내었다.

상기 표 5와 같이, 화합물 3은 각 115.07μM의 IC₅₀을 나타냄으로써, 화합물 중 가장 우수한 최종당산화물 형성에 대한 억제 효과를 나타내었다. 또한, 화합물 1 및 5는 각 184.06μM 및 117.80μM의 IC₅₀을 가짐으로써, 최종당화산물 형성에 대한 억제 효과를 가지는 것을 확인 하였다.

[ 실험예 3] 멀꿀 나무 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위한 DPPH 라디칼 소거율 평가 방법

안전한 자유 라디칼인 DPPH 라디칼은 멀꿀 나무 잎 추출물의 자유 라디칼 소거율을 확인하기 위해 사용하였다. 간단하게, 각 30μl의 실험군에 180μl의 DPPH 용액(0.32mM)을 가하였다. 여기서, DPPH 용액은 메탄올에 녹여 준비하였다. 각 용액을 암조건하에서 15분동안 배양한 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

멀꿀 나무 추출물 및 분획물의 라디칼 소거율을 하기 계산식과 같이 계산하였으며 이의 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

계산식3: DPPH 라디칼 소거율={1- (실험군의 흡광도/대조군의 흡광도)}*100

여기서, 대조군은 시료를 넣지 않은 상태로, DPPH 라디칼과 용매(DMSO)만 있는 상태를 말한다.

DPPH 라디칼 소거제로 잘 알려진 L-ascorbic acid를 양성대조군으로 사용하였다.

한편, 상기 제조예 2로부터 얻은 화합물 1 내지 7에 대한 DPPH 라디칼이 50% 소거되는 시점에 대한 각 시료의 농도(IC₅₀)는 잔존 DPPH 라디칼에 대한 로그 농도의 최소 제곱 회기선으로부터 산출하였다. 이 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

구분		DPPH 라디칼 소거율( % )
멀꿀 나무 잎 추출물	70% 에탄올 추출물	39.84±2.56
멀꿀 나무 잎 분획물	헥산	1.22±0.20
	메틸렌클로라이드	24.43±1.79
	에틸아세테이트	64.81±5.42
	부탄올	32.67±2.54
	물	13.88±1.22
양성 대조군	L-ascorbic acid	58.34±5.11

구분	IC ₅₀ ( μM )
화합물 1	109.73±9.39
화합물 2	162.60±14.39
화합물 3	>1000
화합물 4	94.60±6.86
화합물 5	96.28±9.19
화합물 6	122.34±10.94
화합물 7	>1000
양성 대조군(L-ascorbic acid)	54.39±5.73

상기 표 6과 같이, 멀꿀 나무 잎 추출물 및 분획물의 항산화 활성에 대해 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 또한, 멀꿀 나무 잎 분획물 중 에틸아세테이트 분획물은 58.34%의 DPPH라디칼 소거율을 나타낸 양성대조군에 비해 64.81%의 DPPH라디칼 소거율을 가짐으로써 항산화 활성이 탁월함을 나타내었다.

상기 표 7과 같이, 대부분의 화합물들은 94.60내지 162.60μM의 IC₅₀을 나타내어, DPPH 라디칼 소거에 대한 효과를 확인 하였다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

멀꿀 나무(stauntonia hexaphylla) 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 멀꿀 나무 추출물이 건조된 멀꿀 나무 잎으로부터의 추출물임을 특징으로 하는, 약학 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 알도스 환원 효소(aldose reductase)를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 최종당화산물(advanced glycation end products, AGE)의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 멀꿀 나무의 에틸아세테이트 분획물은 전체 조성물에 대해 0.1 내지 20.0 중량%로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
삭제
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제 1항에 있어서,
상기 멀꿀 나무 추출물은 멀꿀 나무를 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 분획물은 멀꿀 나무 추출물을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 순으로 계통분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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멀꿀 나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionic acid, calceolarioside B 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항 또는 제 15항에 있어서,
상기 당뇨합병증은 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신장병증, 당뇨병성 심근경색증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 백내장 및 당뇨발궤양으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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