KR100686951B1

KR100686951B1 - 항산화 작용을 가지는 남성 발기부전 예방 또는 치료용조성물

Info

Publication number: KR100686951B1
Application number: KR1020060047755A
Authority: KR
Inventors: 이은정; 김희석; 황성연; 황성완
Original assignee: 주식회사 케이엠에스아이; 황성연
Priority date: 2006-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2007-03-02

Abstract

본 발명은 토사자 추출물 40 내지 70 중량%, 복분자 추출물 20 내지 50 중량%, 음양곽 추출물 10 내지 20 중량%를 포함하는 항산화 효과, 남성 발기부전 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항산화 효과, 남성호르몬의 증가, 신경계 및 혈관계 NO 합성물질의 효소물질들의 발현을 증가시키는 동시에 음경수축에 관여하는 효소인 PDE-5의 발현을 억제하는 다중적 역할을 하는 남성 발기부전 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

항산화, 발기부전, 남성호르몬, NOS, PDE-5

Description

항산화 작용을 가지는 남성 발기부전 예방 또는 치료용 조성물{A COMPOSITION HAVING ANTIOXIDATION EFFECT FOR PREVENTING OR TREATING IMPOTENCE}

도 1은 본 발명의 방법에 따라 제조한 각각의 조성물의 세포내 cGMP 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

도 2는 본 발명의 실시예 2-1에서 선별된 KH-304의 세포내 cGMP의 농도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며,

도 3은 KH-304의 항산화 효과 중 DPPH 시험에 관한 그래프이고,

도 4는 KH-304의 항산화 효과 중 SOD 시험에 관한 그래프이고,

도 5는 실시예 4-1 및 실시예 4-2에서 경구 투여시 수컷 흰쥐에서의 KH-304의 농도에 따른 eNOS, nNOS 및 PDE-5의 발현에 관한 그래프이고,

도 6은 실시예 4-3에서 경구 투여시 수컷 흰쥐에서의 KH-304의 투여 기간에 따른 eNOS, nNOS 및 PDE-5의 발현에 관한 그래프이고,

도 7은 실시예 4-4에서 경구 투여시 노화 수컷 흰쥐에서의 KH-304의 농도 및 투여 기간에 따른 eNOS, nNOS 및 PDE-5의 발현에 관한 그래프이며,

도 8은 실시예 4-5에서 경구 투여시 노화 수컷 흰쥐에서의 KH-304의 투여 농도에 따른 혈장 테스토스테론의 농도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 항산화 작용을 가지는 남성 발기부전 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 토사자, 복분자 및 음양곽으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 식물 추출물을 포함하는, 항산화 작용 뿐만 아니라 혈중 남성 호르몬의 증가, 발기 촉진 및 유지효과를 나타내는 항산화 및 남성의 발기 촉진 및 또는 유지용 조성물에 관한 것이다.

성기능 장애는 임상적으로 남성의 발기부전증, 조루증, 지루증 등으로 분류된다. 이중 남성 발기부전이란 미국립보건원의 정의에 따르면 '지속적으로 성생활을 만족스럽게 수행할 정도의 발기가 유발되지 않거나 유지되는 경우'를 뜻한다. 다양한 역학 조사의 결과 50세 이후의 남성에서 높은 유병율을 보이며 이로 인해 삶의 질에 미치는 부정적인 영향도 상당한 것으로 알려져 있다. 발기부전 유병율은 지역에 따라 매우 다양하게 보고되며 미국의 Massachusettes male Aging Study (MMAS)에 따르면 40에서 70 대 남성들의 52 %가 정도의 차이는 있지만 발기부전을 경험하고 있다고 하였고, 우리나라의 보고(대우증권 산업분석 연구 보고서, 2001)에서도 30 세 이상 성인의 32 %에서 발기부전이 나타났다고 보고된 바 있다.

현재까지 발기부전을 유발하는 여러 병태 생리가 알려져 있으나 이중 혈관성 병태 생리가 발기부전의 발생에 있어 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 50 세 이상의 연령층에서 나타나는 발기부전의 약 반수 정도는 혈관계 질환에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있다.

일산화질소 (NO)는 혈관확장 작용, 항응고 작용, 항산화 작용, 항염증 작용, 항부착 작용 등의 역할을 통해서 혈관의 항상성을 유지하는데 있어서 가장 중요한 역할을 담당한다. 따라서 혈관내피에서 NO를 생산하는 NOS (nitric oxide synthase)의 감소, 유리 라디칼의 증가로 생산된 NO의 불활성화 등이 발생하면 NO의 생리적 활성의 감소가 일어나며 그 결과로 죽상동맥경화가 발생하는 것으로 여겨지고 있다. 음경해면체의 이완에도 NO가 중요한 역할을 하며, 발기부전과 높은 연관성을 지닌 노화, 죽상동맥경화, 고혈압, 당뇨 등의 질병모델에 대한 연구결과는 NO의 작용으로 발생하는 비아드레날린성-비콜린성 음경해면체 평활근의 이완장애, NOS 활성의 감소, 음경 내 NOS 발현의 장애 등을 보여 NO의 생리적 활성감소가 발기부전의 원인으로 작용함을 잘 보여준다.

또한, 유해산소라 불려지는 활성산소는 불안전한 이온의 상태이기 때문에 운동력이 크며 단백질, DNA, 효소 및 T세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 각종 질환을 일으킨다. 특히, 불포화 지방산을 공격하여 과산화반응을 일으켜 체내 과산화지질을 축적함으로써 생체기능이 저하되고 동시에 노화 및 성인병 질환을 유발하는 것으로 알려졌다. 이런 맥락에서 음경해면체 조직내의 동맥 또는 세동맥 평활근의 이완반응에 이상이 생기거나 음경해면체 근육의 경직 유지실패에 기인하여 나타나는 남성 발기부전은 세포의 노화와 밀접한 관련이 있다.

이와 더불어, 성욕과 관련된 중추신경계에서의 역할을 하는 남성호르몬이 최근에 음경의 혈류와 신경전달을 포함한 발기능과 관련된 말초에서의 역할을 수행하며, 음경의 국소 Nitric Oxide-cyclic guanosin monophosphate (NO-cGMP) 향상시킴으로써 발기를 강화시키고 대뇌시상하부에 작용하여 성욕을 증대시킨다. 또한, 당뇨병 동물 모델에서 당뇨의 2차적 신경 손상에 대하여 테스토스테론(testosterone) 투여가 NOS 함유 신경섬유 및 신경원들이 정상과 대등한 수준을 유지하는 실험결과를 보여주기도 하였다.

최근 비아그라와 같은 실데나필 유도체의 개발로 발기부전 치료제에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 이와 같은 실데나필 유도체는 NO-cGMP 경로에서 cGMP 농도를 높이기 위하여 cGMP 가수분해효소인 PDE-5의 활성을 억제하는 기전으로 작용하여, 음경의 수축을 억제함으로서 음경의 발기를 유지하는 역할을 한다. 그러나, 현재 심근경색, 심부전, 혈압강하, 뇌경색, 안면홍조, 시력 감퇴 등 다양한 부작용이 보고되고 있어 안전한 발기부전 치료제로서 대체 물질이 절실하다

상기한 바와 같은 종래기술에서의 부작용을 줄이기 위해 천연물로부터 발기부전 치료제를 개발하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 대한민국 특허 제10-0364684호(식물추출물을 포함하는 발기촉진 및 유지용 조성물)에서는 산수유, 구기자, 토사자, 오미자 및 복분자의 식물추출물에서 발기촉진 및 유지의 효능을 지닌 조성물이 개발되었는데, 기존의 발기부전 치료제와는 달리 PDE-5의 활성을 억제함과 동시에 eNOS와 nNOS를 활성화시킴으로써 음경의 발기를 유지할 뿐만 아니라 촉진시킴을 특징으로 하고 있다.

이처럼 기존의 발기부전 치료제와는 다른 기전의 치료 효능을 지닌 제품을 개발하기 위한 연구가 계속적으로 진행되고 있다. 하지만 식물추출물을 포함하는 발기부전 치료제의 경우 비아그라와 같은 단일 합성 의약품에서 나타나는 심혈관계 및 시력장애 등의 부작용이 없는 장점과는 대조적으로, 저용량 및 단기간 투여만으로 확실한 효능을 보이지 않아 고용량 및 장기간 복용하여야 하는 단점을 지니고 있다.

본 발명은 기등록된 특허 제10-0364684호의 조성물을 포함한 대부분의 식물추출물에서 나타나는 심혈관계 및 시력장애 등의 부작용이 없고, 단일 합성 의약품에서와 같이 저용량 및 단기간 투여만으로도 탁월한 효능을 지닌 남성의 발기부전 예방 및 치료제를 개발하는데 그 목적이 있다.

따라서, 본 발명에서는 NO를 합성하는 NOS의 활성 촉진, PDE-5 (phosphodiesterase-5)의 활성 억제 정도가 본 발명자들의 기등록된 조성물 보다 더 우수하고, 이와 더불어 항산화 작용 및 혈장 중 남성호르몬을 증가시킬 수 있어 여러 작용기전에 작용하여 남성 발기부전 치료 효능을 지닌 물질을 개발하고자 예의 연구한 결과, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 종래의 남성 발기부전 치료용 생약제제 보다 적은 종류의 성분을 사용하여 저용량, 단기간 투여에도 우수한 효과를 나타낼 수 있는 남성 발기부전 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 토사자 추출물, 복분자 추출물 및 음양곽 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 식물 추출물을 포함하는 남성 발기부전 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 토사자 추출물 40 내지 70 중량%, 복분자 추출물 20 내지 50 중량%, 음양곽 추출물 10 내지 20 중량%를 포함하는, 항산화 효과를 가지는 남성 발기부전의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 항산화 효과, 혈중 남성호르몬의 증가, 신경계 및 혈관계 NO 합성물질의 효소물질들의 발현을 증가시키는 동시에 음경수축에 관여하는 효소인 PDE-5의 발현을 직접적으로 억제하는 다중적 역할을 하는 남성 발기부전 예방 및 치료용 조성물인 것이다.

토사자는 메꽃과에 속한 1년생 기생초본인 심새삼 및 등속식물의 씨를 건조한 것이다. 토사자는 맛이 맵고 달며 평이한 성질을 지니고 있는 것으로 항암, 강심, 혈압강하작용 및 혈당강하, 신장과 비장을 보호하는데 그 효능이 있다. 동의보감에서는 "정력을 증강시키고 기운을 북돋우며, 요통과 무릎이 시린 증상에 효과가 좋고 달여서 수시로 마시면, 당뇨병에 효과가 있다"라고 전하고 신농본초경에 "여러 가지 부족증을 보충해주며 기력을 더해주고 건실하게 한다. 오래 복용하면 눈이 밝아지고 장수할 수 있다"라고 전해진다.

복분자는 장미과에 속한 낙엽관목인 익지 않은 복분자 딸기의 열매를 건조한 것으로 맛이 시고 따뜻한 성질을 가지고 있는 것으로, 간장과 신장을 보호하는데 그 효능이 있다. 동의보감에 의하면 복분자는 성질은 평하고 맛은 달고 시며 독이 없고 "남자의 신정 (腎精)의 허갈 (虛喝)과 여자의 무자 (無子)를 주치하고 남자의 음기를 굳세고 길게 하며 간을 도우며, 눈을 맑게 하며, 신장의 기운을 가득하게 하여 몸을 가볍게 하고, 머리털이 희어지지 않게 한다"라 기록되어 있다. 또한, 최근 연구에서 신장기능, 불임증, 음위증, 유정몽설, 강장제, 혈액 등을 맑게 해주며 간을 보하고 눈을 맑게 하는 효능이 증명되었으며 복분자 딸기의 덜 익은 열매의 가수분해성 탄닌으로서 1종의 gallotannin과 3종의 ellagitannin을 분리하였으며, 이화학적 성상과 스펙트럼 데이터를 토대로 갈릭산(gallic acid), 2,3-(S)-HHDP-D-글루코피라노즈, 산귄(sanguiin) H-4 및 산귄 H-6를 보고하였다. 복분자의 경우 효소적 지질과 산화에 대해서도 강한 억제 활성을 나타내며 그 성분으로는 갈릭산 등의 페놀화합물이 확인되었다. 페놀성 화합물은 식품계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가지며, 이들은 페놀성 히드록실기를 가지고 있기 때문에 단백질 등의 거대분자들과 결합하는 성질을 가지며, 항산화 효과, 항균성, 아질산염 소거능 등의 생리활성 기능도 가진다.

음양곽은 매자나무과 다년생 초본인 삼지구엽초의 줄기 및 잎으로 이카린(Icariin), 탄닌, 파이토스테롤(phytosterol), 매그노플로린(magnoflorin) 알칼로이드의 성분을 함유하고 있으며 동의 치료에서 강정강장약으로 신경쇠약, 류마티스, 전신불수, 특히 성기능이 약하거나 성발육이 잘 안될때의 약재로 사용된다. 즉 성호르몬 장애, 성기능부족, 월경장애, 건망증에 쓰인다. 민간약에서는 일반강장약으로 쓰는데 건위소화약, 땀내기약, 종양치료약으로 쓰인다. 보고된 약리작용은 혈압을 내리고, 강정작용이 있으며 척수의 반사기능을 높여 정액분비를 잘 시킨다. 성기관의 발육을 돕는데 이러한 작용은 이카린에 의한 것으로 보고되고 있다. 또한, 자궁의 수축진폭과 긴장도를 강화시키고 많은 양에서는 오줌량을 줄인다.

본 발명에 따른 조성물은 상기 각 생약재의 단일 추출물, 이들 단일 추출물을 2종 이상 포함하는 혼합 추출물, 또는 바람직하기로는 상기 각 생약재를 2종 이상 포함하는 식물을 함께 추출하여 제조되는 복합 추출물을 포함한다.

본 발명에 따른 식물 추출물은 통상의 물 추출물, 알코올 등을 용매로 한 용매 추출법 등을 적용하여 제조한 조추출물일 수 있으며, 또한 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획추출물일 수 있다. 본 발명에 따른 추출물의 제조방법은 당해 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 식물 추출방법을 모두 적용할 수 있으며, 예컨대 물, 알코올 또는 혼합용매에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 물, 알코올 또는 혼합용매에 의한 추출법으로 얻어진 식물 추출물은 농축한 후, 동결건조한 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 양태로서, 상기 3가지 재료를 모두 포함하는 복합 추출물인 경우에는, 토사자 추출물 40 내지 70 중량%, 복분자 추출물 20 내지 50 중량%, 음양곽 추출물 10 내지 20 중량%를 포함하는 추출물인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 조성물은 세포 내에서 cGMP의 농도를 증가시키는데, 이는 본 발명의 조성물이 흥분성 신경계 및 혈관계 NO 생성 효소의 발현을 증가시키거나 PDE-5 발현을 억제시켜 음경해면체의 평활근 세포의 이완을 촉진시키거나 수축을 억제할 수 있음을 시사한다.

특히 저용량 투여군에서 탁월한 PDE-5의 발현억제를 나타낼 뿐만 아니라, 본 발명자들의 기 등록된 특허 제10-364684호의 도 3과 비교하여 월등한 효소발현 감소효과가 확인되었다. 즉, 신경계 및 혈관계 NO 생성효소의 발현 양상의 변화에서 본 발명에 따른 KH-304는 저용량 투여만으로도 우수한 효과를 나타내었다.

또한, 본 발명의 조성물은 DPPH 자유 래디칼 소거활성과 SOD(Superoxide dismutase)의 활성 측정 시험 결과, 농도에 따라 DPPH와 SOD에 대하여 유의성 있는 증가를 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 조성물이 체내에서 활성산소에 의한 산화작용을 억제하는 항산화 효과가 있음을 입증하는 것으로, 체내 산화작용의 억제는 노화 유발을 저해하여 노화와 밀접한 관련이 있는 남성 발기부전 증상을 개선할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 경구 투여할 경우 남성 성호르몬인 테스토스테론의 혈중 농도가 증가된다. 혈장 내 테스토스테론의 증가는 본 발명의 조성물이 남성 발기부전을 개선시킬 뿐만 아니라, 남성 생식기능에도 효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.

본 발명에 따른 조성물은 각각의 사용목적에 맞게 이 분야에서 알려진 통상의 방법에 의해 산제, 액제, 정제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼제, 시럽제, 또 는 환제 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액 형태 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구용 액상제제에는 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일 등의 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기재로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화 제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또다른 양태에서, 본 발명은 상기한 조성물을 투여하여 남성의 생식기능 및 성기능을 개선하고 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다.

본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 조성물의 제조

토사자, 복분자 및 음양곽을 5:3:2 비율로 혼합한 100 g을 물 1 L에 3 내지 4시간 동안 가열하여 추출한 후 여과하였다. 여과액은 감압농축기를 이용하여 여과액의 1/10배 부피까지 농축한 후 동결건조하여 각각의 추출물을 얻었다.

각각의 추출물 및 각각의 추출물을 혼합한 복합재료를 표 1과 같이 구성한 후 남성 음경의 발기에 중요한 역할을 수행하는 세포내 2차 신호전달물질인 cGMP의 농도를 실시예 2와 같이 실시하여 가장 우수한 효능을 지닌 구성비를 선정하였다.

단일 조성물은 KH-301로, 두가지 조성물은 KH-302 및 KH-303으로, 세가지 조성물은 KH-304로 분류하여 명명하였다.

명명	조성비(중량 %)			비고
명명	토사자 추출물	복분자 추출물	음양곽 추출물	비고
KH-301A KH-301B KH-301C KH-302A KH-302B KH-302C KH-303A KH-303B KH-303C KH-303D KH-303E KH-303F KH-304A KH-304B KH-304C	100 0 0 50 50 0 70 70 30 30 0 0 70 40 50	0 100 0 50 0 50 30 0 70 0 70 30 20 50 30	0 0 100 0 50 50 0 30 0 70 30 70 10 15 20

실시예 2: 세포에서의 Cyclic GMP 면역에세이( Immunoassay )

평활근 세포 (Smooth muscle cell) 수를 세어 100 mm 또는 60 mm dish로 옮겨 접종한 후 70 내지 80 % 정도 배양한 후, 24시간 동안 상기 실시예 1에서 제조한 추출물로 처리하였다. 배지와 세포를 분리하여 배지는 cGMP 정량의 시험시료에 사용하였다. 표준물질 (500, 100, 20, 4, 0.8, 0 pmol/ml)과 시험시료를 준비한 후 표준물질과 시험시료를 각각 배양배지에 담긴 e-튜브에 200 ㎕씩 담았다. Goat anti-rabbit IgG microplate에 표준물질과 시험시료를 100 ㎕씩 가하고 각 웰(well)에 cGMP 컨쥬게이트 (50 ㎕)와 cGMP 항체 용액 (50 ㎕)을 가한 후 horizontal orbital microplate shaker에서 2시간 실온에서 반응시켰다. 이 플레이트의 용액을 버리고 세척완충용액으로 세척한 후 200 ㎕ pNPP 기질을 가한 후 1시간 반응시켰다. 50 ㎕의 반응 정지용액을 가한 후 ELISA 판독기로 흡광도 (405 nm)를 측정하였다.

실시예 2-1 각 조성물에 대한 cGMP 정량

표 1의 각각의 조성물에 대한 세포에서의 cGMP에 미치는 영향을 알아보기 위해 각각의 조성물은 50 ug/ml로 하였으며, 음성대조군으로는 생리식염수를, 양성대조군으로는 실데나필 시트레이트 (33.3 ug/ml)를 사용하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었으며, 실시예 1에서 제조한 모든 조성물에서 식염수를 처리한 대조군 (Control)과 비교하여 유의성 있는 증가를 보였다 (*p<0.01, **p<0.001). 또한, 단일 조성물 (KH-301)보다는 두 가지 이상의 원료로 구성된 조성물 (KH-302, KH-303, KH-304)에서 cGMP의 농도가 증가하는 경향을 나타내었다. 특히, 세가지 원료로 구성된 조성물 (KH-304)는 다른 조성물과 비교해 유의성있는 증가를 보여 더욱 우수한 효능이 있음을 확인하였다 (p<0.05). 그러나, 세가지 원료로 구성된 조성물 간에는 유의성있는 차이는 나타나지 않았다.

이하, 실시예에서는 전체 조성물 100 중량%에 대하여 토사자 추출물 40 내지 70 중량%, 복분자 추출물 20 내지 50 중량%, 및 음양곽 추출물 10 내지 40 중량%로 함량비를 설정하고 이 조성물을 KH-304로 명명하였다.

실시예 2-2 KH-304 농도별 cGMP 정량

실시예 2-1에서 우수한 효능을 보인 KH-304를 농도별 (10, 30, 100 ug/ml)로 처리하여 세포에서의 cGMP에 미치는 영향을 알아보았다. 그 결과, 도 2와 같이 모든 시험물질에서 생리식염수를 처리한 대조군 (con)과 비교하여 유의성있는 증가를 보였다 (0.05). KH-304에서 농도의존적인 증가의 경향을 나타냈으나 농도별 통계적 유의성은 관찰되지 않았다. 또한, 모든 농도에서 양성대조물질인 실데나필 시트레이트(sildenafil citrate)의 경우보다 높은 경향을 나타냈으나 통계적 유의성은 관찰되지 않았다.

이는 KH-304가 세포내 cGMP의 농도에 영향을 미치는 흥분성 신경계 및 혈관계 NO 생성 효소의 발현을 증가시키거나 PDE-5 발현을 억제시켜 음경 해면체의 평활근 세포의 이완을 촉진하거나 수축을 억제할 수 있는 가능성이 있음을 의미한다. 또한, KH-304의 농도별 cGMP의 정량 결과, 10 ug/ml 처리군에서도 100 ug/ml 처리군과 동일한 수준의 cGMP의 증가를 보여 소량의 투여로도 평활근 세포의 이완을 촉진하거나 수축을 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: 항산화 효능 검색

실시예 3-1 DPPH

시료를 2.5 ul씩 첨가하여 메탄올로 용해시킨 DPPH용액을 247.5 ul씩 96-웰 플레이트에 Multi-channel pipette으로 분주하고 여기에 최종 반응용액이 250 ul가 되도록 하였다. 이를 30 분 동안 반응시킨 후 Microplatereader를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH용액의 농도는 1.5 x 10^-4 M로 하였으며 대조약물은 아스코르빈산을 사용하였고, KH-304의 농도는 1, 10, 50, 100, 500 ug/ml으로 희석하여 측정한 결과는 도 3에 나타내었으며, 농도 의존적인 유의성 있는 증가를 확인하였다 (p<0.005).

실시예 3-2: SOD

SOD (Superoxide dismutase)의 활성 측정은 헤마톡실린(hematoxylin)을 이용한 Martin의 방법을 사용하였다.

헤마톡실린은 자연상태에서 붉은색인 헤마틴으로 자가 산화한다. 이러한 과정에 SOD가 관여하면 자동산화를 억제하게 된다. 0.1 mM EDTA가 함유된 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.5) 1 ml에 각각의 시료 50 ul 씩을 가하고 5 분동안 미리 항온처리하였다. 여기에 5 mM 헤마톡실린 30 ul를 가한 후 인산염 완충액을 공액으로 하여 UV/visible 스펙트로포토미터를 사용해 568 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었으며, SOD 함량의 농도의존적인 유의성 있는 증가를 나타냈다 (p<0.005).

이상의 실시예 3의 결과를 볼 때, KH-304는 세포막의 불포화 지방산을 쉽게 과산화 시킴으로써 세포막을 손상하고 비정상적인 체내 반응과 생리활동을 유발할 수 있는 자유산소라디칼을 농도의존적으로 소거하는 항산화 기능을 지님을 확인하였다. 또한, 남성 성기능과 관련하여 자유산소라디칼의 생성을 억제하여 음경조직의 산화적 스트레스를 해소함으로써 저하된 성기능을 회복시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: NOS 및 PDE -5의 발현에 대한 동물실험

실험동물의 하나인 흰쥐의 음경발기 기전은 사람과 동일하므로 본 실시예에서는 정상 및 노화된 수컷 Sprague-Dawley (SD) 랫트를 사용하여 실시예 2에서 cGMP의 농도가 가장 많이 증가된 KH-304에 대해 그 효과를 확인하였다.

정상쥐는 생후 6주된 실험동물을 사용하였으며 노화쥐는 생후 20개월된 실험동물을 사용하였다.

선택된 추출물을 10일간 농도별 (100 내지 700 mg/kg 랫트)로 경구투여하고 음경발기에 관여하는 신경계 NO 합성효소 (nNOS), 혈관계 NO 합성효소 (eNOS) 및 cGMP 분해효소인 포스포디에스터라제-5 (phosphodiesterase-5, PDE-5) 효소 발현을 음경조직에서 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 이 방법은 발현된 단백질의 양을 비교할 수 있으므로 유전자 발현에 미치는 효과를 직접 확인할 수 있다. 이는 액체질소 내에서 파쇄된 전체 단백질을 전기영동하여 분자량에 따라 분리된 단백질들에서 단일클론항체 anti-nNOS, anti-eNOS (Transduction Laboratories, Lexington, KT, USA)를 이용하여 반응염색 강도에 따라 그 발현의 양적변화를 확인하였다. 단백질발현 정도는 densitometer를 이용하여 측정하였으며, 증가 또는 감소정도를 대조군 (생리식염수 투여군)과 비교하여 student's t-test에 의한 통계적 유의성을 검증하였다.

또한, 효능이 높은 투여군을 선정하여 투여 기간에 따른 NOS 및 PDE-5의 발현에 미치는 영향을 관찰하였다.

실시예 4-1 음경조직에서 신경계 NO 합성효소 (nNOS) 및 혈관계 NO 합성효소 (eNOS)의 발현

도 5는 흰쥐의 음경조직에서 신경계 NO 합성효소 (nNOS)의 발현 양상을 나타내는 것으로서, KH-304 100 mg/kg 랫트 투여군에서 대조군에 비교해 가장 높은 nNOS 효소발현의 유의성있는 증가를 확인할 수 있었다. 또한, 흰쥐 음경조직에서 혈관계 NO 합성효소 (eNOS)의 단백질 발현 양상을 나타내는 것에서도 KH-304 100 mg/kg 랫트 투여군에서 대조군에 비교해 가장 높은 eNOS 효소발현의 유의성있는 증가를 확인할 수 있었다

상기의 결과는 산수유, 구기자, 오미자, 복분자 및 토사자로 이루어진 조성물에 대한 국내특허 (제10-364684호)의 도 3 및 도 4와 비교할 때 월등한 효소발현의 증가를 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 추출물을 경구투여한 쥐에서 음경에서 nNOS 및 eNOS 발현증가효과가 있어 음경발기를 촉진시킴으로서 발기부전에 효과가 있음을 확인하였다. 특히 저용량 투여군인 100 mg/kg 투여군에서 가장 탁월한 nNOS 및 eNOS의 발현증가를 나타내어 기존 특허 (제10-364684)와 비교할 때 저용량 투여만으로도 더 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 4-2 음경조직에서 PDE-5 효소발현에 대한 효과

도 5는 흰쥐의 음경조직에서 PDE-5의 발현 양상을 나타내는 것으로서, KH-304 100 mg/kg 랫트 투여군에서 대조군에 비교해 가장 높은 PDE-5 효소발현의 유의성있는 감소를 확인할 수 있었다. 이는 음경내 PDE-5의 활성을 억제함으로서 cGMP의 농도가 더욱 증가할 수 있는 효과를 확인한 것이다. 이 결과는 비아그라와 같은 cGMP 유사체와 동일한 효과로 나타나지만 cGMP 가수분해과정에서 나타나는 경쟁적 억제제인 비아그라와는 달리 본 발명 조성물의 작용기전은 PDE-5 유전자 발현과정을 직접 억제, 조절하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 추출물을 경구투여한 쥐에서 음경에서 PDE-5 발현의 억제효과가 있어 음경발기를 유지 및 지속시킴으로서 발기부전에 효과가 있음을 확인하였다. 특히 저용량 투여군인 100 mg/kg 투여군에서 가장 탁월한 PDE-5의 발현억제를 나타내었을 뿐만 아니라, 기존 특허 (제10-364684호)의 도 3과 비교할 때 월등한 효소발현의 감소를 확인할 수 있었다. 즉, 신경계 및 혈관계 NO 생성효소의 발현 양상의 변화에서 나타났던 결과처럼 KH-304의 저용량 투여만으로도 그 효과가 우수함을 확인하였다.

실시예 4-3 투여 기간에 따른 NOS 및 PDE-5 효소발현에 대한 효과

도 6은 실시예 4-1 및 4-2에서 NOS 및 PDE-5의 효소발현에 가장 크게 영향을 미친 100 및 300 mg/kg 투여군에 대하여 기간에 따른 각각의 효소발현 정도를 확인한 결과이다. 기간에 따른 효소발현 정도에는 큰 변화가 없음을 확인하였다.

실시예 4-4 노화 쥐의 음경조직에서의 nNOS, eNOS 및 PDE-5 효소발현에 대한 효과

KH-304가 노화 쥐에 미치는 영향을 관찰하기 위해 생후 20개월된 수컷 랫트를 생리식염수 투여군 (대조군), KH-304 100 mg/kg 투여군, KH-304 300 mg/kg 투여군으로 나누어 실험을 실시하였다. 시험물질은 매일 투여하였으며, 10일 투여 후 도살하여 장기 및 혈액을 채취하여 효소발현 및 혈장 중 테스토스테론 함량 분석에 이용하였다.

도 7은 노화 쥐의 음경조직에서 신경계 NO 합성효소 (nNOS)의 발현 양상을 나타내는 것으로서, KH-304 100 mg/kg 랫트 투여군에서 대조군에 비교해 가장 높은 nNOS 효소발현의 유의성있는 증가를 확인할 수 있었고 정상쥐에서 보다 더 높은 유의성을 나타냈다. 혈관계 NO 합성효소 (eNOS)의 발현 양상도 KH-304 100 mg/kg 랫트 투여군에서 대조군에 비교해 가장 높은 유의성 있는 증가를 확인할 수 있었다. 노화 쥐의 음경조직에서 PDE-5의 발현 양상의 결과도 KH-304 100 mg/kg 랫트 투여군에서 대조군에 비교해 가장 높은 PDE-5 효소발현의 유의성있는 감소를 확인할 수 있었다. 노화 쥐에서 나타난 NOS 및 PDE-5 효소발현은 정상 쥐에서와 동일한 양상을 보였다.

실시예 4-5 노화 쥐의 혈장 테스토스테론 측정

혈장 테스토스테론 함량은 실시예 4-4에서 채취하여 냉동보관한 혈장을 4 ℃에서 녹인 다음 steroid displacement reagent를 처리한 후 면역에세이 키트 (R&D Systems, USA)를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 8과 같으며, 노화 흰 쥐의 실험 대조군의 혈청 내 테스토스테론 농도는 343.2 ± 11.5 pmole/ml이었고, KH-304 100, 300 투여군에서는 각각 560 ± 15.3 pmole/ml, 615 ± 17.6 pmole/ml로 KH-304 100 mg/kg, 300 mg/kg 투여군 모두에서 생리식염수를 투여한 대조군과 비교하여 유의성 있는 증가를 보였다 (P< 0.005)

상기 실시예의 결과로부터, KH-304는 정상쥐 및 노화쥐에 저용량 및 단기간 경구투여에서 기존 특허 (제10-364684호)보다 음경발기 기전에 관여하는 대표적인 효소들의 발현 및 활성을 촉진 또는 감소시키고 남성호르몬을 증가시킴으로써 음경발기에 매우 탁월한 효과를 나타냄을 알 수 있다. 또한, 단일 합성 의약품인 비아그라의 PDE-5 효소발현 억제를 통한 음경발기의 유지의 기능 뿐만아니라, nNOS 및 eNOS의 효소발현을 활성화시켜 음경발기를 촉진시키는 다중적 역할을 하는 것을 확인하였다.

실시예 5: 음경발기 촉진 및 유지에 대한 동물실험

음경발기는 어떠한 원인이든지 음경해면체 평활근 (이하 평활근)이 이완되어 혈류에 의한 음경내압이 증가하면서 유발된다. 이에 동물의 평활근을 분리하여 생체외 실험에 사용한다. 이 실시예에서는 발기부전 개선 효과를 가지는 KH-304를 평활근에 직접 투여하여 성기능개선 관련 유무를 판단할 수 있다 (건강기능식품의 기능성 시험가이드 I, (재)한국보건공정서연구회, p 147 ~ 177 (2004)).

실험동물 래빗을 마취한 후 해면체를 적출하여 적당한 크기 (2 내지 2.5 cm²)로 잘라서 변성된 Kreb 용액 (pH 7.4)이 담긴 organ bath 내의 tissue holder에 장치하고 1시간 정도 안정화 시킨 후 0.5 % CMC 관류 5분후 phenylephrine에 의한 수축작용에 미치는 효과를 측정하였다. 변성된 Kreb 용액을 흘려 20분간 안정화시키고 이와 동일하게 본 발명 추출물을 관류 후 수축작용에 미치는 효과를 측정하였다. 변성된 Kreb 용액을 흘려 20분간 안정화시킨 후 KCl 30 mM을 넣어 수축반응 효과를 측정하였다. KCl 30 mM 수축력을 100이라 놓고 각각의 농도를 %로 계산하였다. Plugsys bridge amplifier를 통해 처리된 모든 신호를 Pressure transducer로 폴리그래프로 기록하였다.

표 2는 수축 평활근에서의 KH-304의 효과를 나타낸 것으로 페닐에프린(phenylephrine) 10^-6 M로 수축시킨 평활근에 KH-304를 61, 183 및 549 mg/L로 축적용량으로 처리하였을 때 각각 3.6, 8.2 및 19.5%의 용량의존적인 이완율을 나타내어 KH-304가 래빗의 음경 해면체에 직접적으로 이완을 촉진시킴을 확인하였다.

10^-6 M phenylephrine으로 수축시킨 단리된 래빗의 음경 해면체에 대한 KH-304 및 sodium nitroprusside의 효과

시험군	시험조성물	투여량 (mg/L)	Ratio of relaxation (%)	Reference Item	Dose (M)	Ratio of relaxation (%)
G1 G2 G3 G4	KH-304 KH-304 KH-304 KH-304	0 61 183 549	0.00 ± 0.00 3.64 ± 7.35 8.22 ± 8.03 19.47 ± 13.86	SNP SNP SNP SNP	10^-8 10^-7 10^-7 10^-6	13.59 ± 7.77 42.23 ±15.36 88.31 ±14.23 93.83 ± 8.20

모든 수치는 평균값±S.D. (n=10). SNP: Sodium nitroprusside.

실시예 6 독성시험

실시예 6-1 단회투여 독성시험

본 독성시험은 식품의약품안정청 고시 제1999-61호 '의약품 등의 독성시험기준'에 준하여 랫트에서 실시예 2에서 선정된 KH-304에 대해 단회독성시험을 KGLP기관인 (주)켐온에 의해 수행되었다.

상기 추출물 KH-304의 단회 경구투여에 의한 독성을 조사하기 위하여 Sprague Dawley (SD) 계통 암수 랫트에 멸균주사용수를 투여하는 부형제 대조군과 시험물질을 2,000 및 5,000 mg/kg을 투여하는 시험물질 투여군을 설정하여 시험하였다. 각 군별 동물수는 10 마리 (암수 각 5 마리)로 하였고, 2 주간의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰하였다. 시험결과 모든 시험기간 동안 시험물질에 의한 사망동물은 관찰되지 않았고, 모든 시험기간동안 시험물질 투여와 관련한 특이한 증상은 관찰되지 않았고, 체중 변화에서 시험물질에 의한 특이한 변화는 관찰되지 않았으며, 부검소견에서는 시험물질의 투여와 관련된 독성학적 이상소견은 관찰되지 않았다.

이상의 결과로 보아 본 시험 조건 하에서 KH-304의 랫트에 대한 단회 경구투여에서 독성학적인 변화는 관찰되지 않았다. 또한 사망동물은 관찰되지 않아 본 시험물질의 랫트에서의 최소치사량 (MLD)은 5,000 mg/kg을 상회하는 것으로 평가되었다.

실시예 6-2 4주 반복투여 독성시험 및 2주 회복시험

본 독성시험은 식품의약품안정청 고시 제2005-60호 '의약품 등의 독성시험기준' 및 식품의약품안전청고시 제2000-63호 '비임상시험관리기준'에 준하여 실시하였으며, 무해용량, 표적장기 및 회복성을 알아보기 위하여 실시하였다.

Sprague-Dawley (SD) 계통 암수 랫트에 시험물질 100, 300 및 1,000 mg/kg/day을 투여하는 KH-304 투여군을 설정하여 부형제 대조군과 비교하였다. 각 군별 동물 수는 주요군으로 각 군당 암수 각각 10 마리, 회복군으로 부형제 대조군과 고용량군 암수 각각 5 마리로 하였다. 시험항목으로는 사망률, 일반증상, 체중변화, 사료 및 물 섭취량, 안검사, 뇨검사, 혈액학 및 혈액생화학 검사, 장기중량 측정 및 부검소견을 관찰하였다.

시험결과 시험물질의 독성과 관련된 사망동물, 시험물질투여에 의한 일반증상의 변화는 관찰되지 않았다. 체중의 변화, 사료 섭취량, 물섭취량 관찰 결과 본 시험물질 투여와 관련된 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 또한, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 장기중량, 육안적인 부검소견 모두에서 본 시험물질 투여와 관련된 유의한 변화 및 독성학적 이상소견은 관찰되지 않았다.

이상의 결과로 보아 본 시험 조건 하에서 KH-304의 랫트에 대한 4 주 반복 경구투여 독성시험 및 2 주 회복시험에서 시험물질 투여로 인한 독성학적 변화는 없는 것으로 나타났다. 따라서 상기 시험조건에서 무독성량 (NOAEL)은 1,000 mg/kg/day으로 평가되었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 토사자 추출물, 복분자 추출물 및/또는 음양곽 추출물을 포함하여서 되는 본 발명에 따른 조성물은 항산화 효과 및 남성 발기부전의 예방 및 치료용 조성물로서, 혈중에서 남성호르몬을 증가시키고, 항산화 효과를 증가시키며, 신경계 및 혈관계 NO 합성물질의 효소물질들의 발현을 증가시키는 동시에 음경수축에 관여하는 효소인 PDE-5의 발현을 직접적으로 억제하는 다중적 역할을 하여 남성 발기부전의 예방 및 치료용 조성물로서 기존의 생약 추출물보다 저용량 및 단기간 복용으로도 탁월한 음경발기 촉진 및 유지 효능을 나타낼 수 있다. 또한, 화학적 합성제품의 투여로 인해 발생되는 심혈관계 및 시력장애의 부작용 등이 없어 발기부전으로 고통받는 환자뿐만 아니라 일반인에게도 적용되어 그 효과를 얻을 수 있고 항산화 효과를 부가적으로 가지고 있어 노화 억제물질의 개발가능성도 상당히 높다.

본 발명의 조성물은 항산화 작용 뿐만 아니라 혈중 남성 호르몬의 증가, 발기 촉진 및 유지효과를 예상할 수 있다.

Claims

삭제
토사자 열수 추출물 40 내지 70 중량%, 복분자 열수 추출물 20 내지 50 중량% 및 음양곽 열수 추출물 10 내지 20 중량%를 포함하는 남성 발기부전 예방 또는 치료용 조성물.
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제 2항에 있어서, 상기 조성물이 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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