KR101624586B1 - 스틸벤계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
스틸벤계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 스틸벤계(stilbene) 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항염증용, 특히 폐손상 관련 항염증용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 [화학식 1]의 화합물 및 이의 유도체는 LPS 유도에 의한 NF-κB 및 MAPK 경로와 관련된 단백질을 억제하고, t-BHP 유도에 의한 Nrf2가 매개된 옥시제네즈-1(oxygenase-1)를 상승조절을 하고 세포내 ROS 및 퍼옥시니트리트(peroxynitrite)를 억제함으로써 염증성 질환, 특히 폐손상 관련 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명의 목적은 스틸벤계(stilbene) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 건강식품을 제공하는 것이다.
염증(inflammation)이란 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻한다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게 되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생되는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다. 염증에 의한 농양의 치료는 소염작용을 통하여 촉진될 수 있는데, 소염작용이란 항균제를 이용하여 침입균의 증식을 억제하거나 농양 중에 축적된 이물질들을 탐식하는 대식세포(macrophage)를 활성화하여 상기 이물질들을 소화 및 배설하는 대식세포의 기능을 항진시키는 등의 염증치료 촉진작용이다.
일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 한다. 상기 염증질환은 외부자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류머티스성 관절염과 같은 관절 내에서의 질환, 건선 등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식 등의 알레르기성 염증질환 등을 포함한다.
이러한 염증 질환을 치료하기 위한 가장 일반적인 염증성 질환 예방 또는 치료용제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 염증성 질환 예방 또는 치료용제로 구분되며, 이중 대부분의 합성 염증성 질환 예방 또는 치료용제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 효과가 탁월하며 부작용이 적은 염증성 질환 예방 또는 치료용제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 특히, 효능 및 부작용 측면에서 볼 때, 예로부터 임상적 경험이 풍부하고 안전성 측면에서 탁월한 평가를 받고 있는 천연물 제제가 염증 질환의 예방 및 치료제 개발에 있어 좋은 후보물질이 될 것으로 여겨진다.
대황(Rhubarb, Rheum)은 200 여년 전 아시아에서 발견되어 설사약 등으로 사용되고 있으며, 최근에는 대황의 약학적 효과에 대해 많은 연구가 진행되고 있다. 구체적으로, 대황 추출물 및 이의 주요 구성요소인 에모딘(emodin)은 항알레르기 활성이 보고되어 있으며, 종대황(Rheum undulatum L.)으로 분리된 스틸벤 유도체는 항알레르기, 항 당뇨성, 항 비만, 항암 효과 등이 알려져 있으나, 종대황으로부터 분리된 스틸벤 유도체 중 데속시라폰티제닌의 현저한 급성폐손상 치료효과에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 급성폐손상을 포함하는 염증성 질환 치료제를 개발하기 위하여 노력한 결과, 종대황으로부터 분리한 스틸벤계 유도체인 데속시라폰티제닌(desoxyrhapontigenin)은 세포독성이 없고 염증관련 단백질, 예를 들면, PGE2, TNF-α, iNOS, COX-2, IL-6, 및 MyD88를 억제하고 IKKα/β, IκBα, JNK1, ERK, p38 및 Akt의 인산화 또는 ROS 및 퍼옥시니트리트(peroxynitrite)를 감소시키고, Nrf2 전사인자의 DNA 결합을 촉진시켜 항산화 관련 단백질 및 효소를 증가시켜서 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 하기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서, R1은 수소, C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 글루코실이고; R2는 수소, 하이드록시, C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고; R3는 수소, 또는 C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다).
또한, 본 발명의 목적은 상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 스틸벤계(stilbene) 화합물인 데속시라폰티제닌(desoxyrhapontigenin)은 세포독성이 없고 염증관련 단백질, 예를 들면, PGE2, TNF-α, iNOS, COX-2, IL-6, 및 MyD88를 억제하고 IKKα/β, IκBα, JNK1, ERK, p38 및 Akt의 인산화 또는 ROS 및 퍼옥시니트리트(peroxynitrite)를 감소시키며, Nrf2 전사인자의 DNA 결합을 촉진시켜 항산화 관련 단백질 및 효소를 증가시킴으로써 급성 폐손상을 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 스틸벤(stilbene)계 유도체의 구조 및 MTT 분석을 이용한 세포독성 측정에 관한 도이다.
도 2는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 PGE2 및 TNF-α 생성에 대한 데속시라폰티제닌(desoxyrhapontigenin)의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 IκBα의 인산화 및 분해와 MyD88 및 인산화된 IKKα/β의 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 웨스턴블랏으로 나타낸 도이다.
도 5는 Akt 및 MAPK 경로에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 NF-κB 및 AP-1 DNA 결합 활성에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 카라기난(carrageenan)으로 유도된 마우스 모델에서 발 부종에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 t-BHP로 유도된 RAW 264.7 세포에서 ROS 및 퍼옥시니트리트(peroxynitrite)에 대한 스틸벤계 유도체의 효과를 나타낸 도이다. 쿠에르세틴(Quercetin)은 양성 대조군으로 사용되었다.
도 9는 항산화 효소의 mRNA 발현 및 HO-1의 단백질 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 10은 RAW 264.7 대식세포로부터 핵과 세포질의 분획물에서 Nrf2, p-Nrf2 및 Keap1의 단백질 발현 수준 및 ARE의 전사 활성에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 11은 데속시라폰티제닌에 의한 HO-1의 유도에서 특정 억제제, 및 Nrf2 및 HO-1의 유도에 대한 siAKT 및 HO-1의 효과를 나타낸 도이다.
도 12는 LPS로 유도된 폐염증에서 데속시라폰티제닌의 Nrf2, HO-1 및 p65의 면역조직화학 분석을 나타낸 도이다.
도 13은 분자도킹 연구(molecular docking study)에서 KEAP의 단백질 활성 부위 내의 데속시라폰티제닌의 결합 모드(mode)를 나타낸 도이다.
도 2는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 PGE2 및 TNF-α 생성에 대한 데속시라폰티제닌(desoxyrhapontigenin)의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 IκBα의 인산화 및 분해와 MyD88 및 인산화된 IKKα/β의 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 웨스턴블랏으로 나타낸 도이다.
도 5는 Akt 및 MAPK 경로에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 NF-κB 및 AP-1 DNA 결합 활성에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 카라기난(carrageenan)으로 유도된 마우스 모델에서 발 부종에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 t-BHP로 유도된 RAW 264.7 세포에서 ROS 및 퍼옥시니트리트(peroxynitrite)에 대한 스틸벤계 유도체의 효과를 나타낸 도이다. 쿠에르세틴(Quercetin)은 양성 대조군으로 사용되었다.
도 9는 항산화 효소의 mRNA 발현 및 HO-1의 단백질 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 10은 RAW 264.7 대식세포로부터 핵과 세포질의 분획물에서 Nrf2, p-Nrf2 및 Keap1의 단백질 발현 수준 및 ARE의 전사 활성에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 나타낸 도이다.
도 11은 데속시라폰티제닌에 의한 HO-1의 유도에서 특정 억제제, 및 Nrf2 및 HO-1의 유도에 대한 siAKT 및 HO-1의 효과를 나타낸 도이다.
도 12는 LPS로 유도된 폐염증에서 데속시라폰티제닌의 Nrf2, HO-1 및 p65의 면역조직화학 분석을 나타낸 도이다.
도 13은 분자도킹 연구(molecular docking study)에서 KEAP의 단백질 활성 부위 내의 데속시라폰티제닌의 결합 모드(mode)를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, "개선" 또는 "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 하기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 R1은 수소, C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 글루코실이고;
R2는 수소, 하이드록시, C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고;
R3는 수소, 또는 C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬인 것이 바람직하고, 상기 R1은 수소, 또는 글루코실이고; R2는 수소, 하이드록시, 또는 메톡시이고; R3는 수소, 또는 메틸인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 가장 바람직하다.
1) (E)-2-(3-하이드록시-5-(3-하이드록시-4-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
2) (E)-5-(3-하이드록시-4-메톡시스티릴)벤젠-1,3-디올;
3) (E)-2-(3-하이드록시-5-(4-하이드록시-3-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
4) (E)-2-(3-하이드록시-5-(4-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
5) (E)-5-(4-메톡시스티릴)벤젠-1,3-디올; 및
6) (E)-5-(4-하이드록시스티릴)벤젠-1,3-디올.
상기 염증성 질환은 폐렴, 급성 호흡곤란 증후군(acute repiratory distress syndrome;ARDS), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐형성 장애(broncho pulmonary dysplasia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 급성폐손상인 것이 보다 바람직하다.
상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 중성구침윤(neutrophil infiltration) 또는 폐포출혈(alveolar hemorrhage)을 감소시키는 것이 바람직하다.
하기 표 1에 본 발명의 <실시예 1>에서 제조한 화합물의 화학구조식과 이들의 상용명을 함께 나타내었다.
| 실시예 (상용명) |
화학구조식 |
| 1 (Rhaponticin) |
 |
| 2 (Rhapontigenin) |
 |
| 3 (Isorhaponticin) |
 |
| 4 (Desoxyrhaponticin) |
 |
| 5 (Desoxyrhapontigenin) |
 |
| 6 (Resveratol) |
 |
상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물은 종대황(Rheum undulatim)으로부터 분리된 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 [화학식 1]로 기재되는 화합물은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 종대황(Rheum undulatim)을 추출용매로 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물의 n-헥산 분획물을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 수득한 분획물에 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 상기 제조방법을 단계별로 설명한다.
먼저, 단계 1)은 종대황을 추출용매로 추출하는 단계이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 종대황은 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 C1-C4의 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출 용매의 양은 종대황 건조 중량의 1 내지 20 배인 것이 바람직하고, 10 배인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 방법은 열수추출, 침지추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 초음파 추출방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 추출시 온도는 10℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하며 상온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 시간은 1일 내지 7일인 것이 바람직하고, 3일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 종대황 추출물을 제조하는 방법은 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 수득한 추출액의 농축은 감압농축의 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 상온건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
다음으로, 단계 2)는 단계 1)에서 수득한 추출물로부터 노르말-헥산 분획물을 수득하는 단계이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 유기용매는 노르말-헥산, 에틸아세테이트 또는 노르말-부탄올인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 분획물은 종대황 추출물을 물에 현탁시킨 후, 노르말-헥산, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 노르말-헥산 분획물인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 분획물은 상기 종대황 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
다음으로, 단계 3)은 단계 2)에서 수득한 분획물에 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피 및 고압액체 크로마토그래피(HPLC:High performance liquid chromatography)를 순차적으로 수행하여 상기 화학식 1 또는 2의 신규한 구아이안 세스퀴테르핀계 화합물을 수득하는 단계이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마트그래피 및 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피는 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 수행되며 고압액체 크로마토그래피(HPLC:High performance liquid chromatography)는 메탄올과 물 혼합용매를 사용하여 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매의 농도 구배는 20:1 ~ 1:1인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 고압액체 크로마토그래피(HPLC:High performance liquid chromatography)를 수행하는 방법은 메탄올과 물의 혼합용매 7:3(V/V) 조건에서 수행하는 것이 바람직하고, 4 ㎖/min의 속도로 용출하여 28분 및 35분 후에 각각의 활성분획을 수득하는 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 종대황은 에탄올로 추출하여 종대황의 에탄올 추출물을 제조하였고, 이를 물에 현탁하여 노르만-헥산으로 분획한 분획물을 수득한 후, 상기 분획물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 활성분획을 용출한 후, 고속액체크로마토그래피를 이용하여 본 발명의 화합물 1을 분리하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 종대황을 이용하여 종대황으로 분리된 데속시라폰티제닌(desoxyrhapontigenin)을 포함하는 스틸벤계 유도체를 제조하고, 상기 추출된 스틸벤계 유도체를 다양한 조건으로 NF-κB-SEAP-NPT 구조체가 형질감염된 RAW 264.7 세포에 처리한 후 생산된 NO, NF-κB 및 세포 생존률의 양을 측정한 결과, 스틸벤계 유도체 중 데속시라폰티제닌 및 레스베라트롤(resveratol)은 NO 및 NF-κB 의 생산을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다(도 1 참조).
또한, 데속시라폰티제닌의 염증 관련 단백질에 대한 효과를 조사하기 위하여, 활성화된 대식세포로부터 생성된 PGE2 및 TNF-α를 EIA 키트를 사용하여 측정한 결과, 데속시라폰티제닌은 PGE2 및 TNF-α배출을 농도 의존적으로 감소시켰다(도 2 참조).
나아가, 데속시라폰티제닌의 염증 관련 단백질에 대한 효과를 조사하기 위하여, iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-6 mRNA 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 정량적 실시간 RT-PCR 분석을 통하여 확인한 결과, 염증 관련 단백질(iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-6)의 mRNA 발현이 데속시라폰티제닌에 의해 감소됨을 확인하였다(도 3 참조).
또한, TLR4 신호 경로에 포함되어 있는 다양한 종류의 어댑터(adapters) 및 신호 단백질들에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 조사한 결과, MyD88, p-Akt, p38, JNK1 및 ERK의 인산화는 데속시라폰티제닌에 의해 억제됨을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조).
나아가, 데속시라폰티제닌이 NF-κB의 이동을 저해하는지 확인하기 위하여, NF-κB의 DNA-결합 활성을 EMSA에 의해 조사한 결과, 데속시라폰티제닌은 AP-1의 DNA-결합 활성을 감소시키는 AP-1의 핵 이동에 있어서 농도 의존적인 감소를 나타냄을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 데속시라폰티제닌의 생체내 항염증성 효과를 평가하기 위하여, 마우스에서 카라기난으로 유도된 발 부종(carrageenan-induced paw edema) 테스트를 실행한 결과, 데속시라폰티제닌은 카라기난에 의해 유도된 부종의 형성을 억제하였다(도 7 참조).
나아가, ROS 및 퍼옥시니트리트(peroxynitrite) 생성에 대한 스틸벤계 유도체의 효과를 조사하기 위하여, ROS 및 퍼옥시니트리트 생성을 측정한 결과, 데속시라폰티제닌 및 레스베라트롤은 농도 의존적으로 t-BHP로 유도된 ROS 및 퍼옥시니트리트를 억제함을 확인하였다.(도 8 참조).
또한, 항산화 효소의 mRNA 발현 및 HO-1 단백질 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 확인한 결과, 데속시라폰티제닌(50 μM)은 HO-1의 발현을 증가시킴을 확인하였다(도 9 참조).
나아가, 데속시라폰티제닌에 의한 Nrf 전사인자의 발현 및 Keap1의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴블랏 및 EMSA를 이용하여 측정한 결과, 데속시라폰티제닌은 Nrf2의 억제제인 Keap1의 단백질 발현을 농도 의존적으로 하향조절하고 ARE 서열에 대한 Nrf2 결합을 증가시킴을 확인하였다(도 10 참조).
또한, 데속시라폰티제닌이 매개된 Nrf-2 활성 및 HO-1 유도에 관여하는 상위 신호경로를 증명하기 위하여, HO-1의 단백질 발현을 측정한 결과, siAkt 또는 siNrf-형질감염된 세포에서 데속시라폰티제닌은 Nrf2의 활성을 억제하고, siNrf2-형질감염된 세포에서 HO-1 유도를 억제함을 확인하였다(도 11 참조).
나아가, 마우스 모델에서 LPS-유도된 염증성 폐손상에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 확인하기 위하여, 급성 폐염증 분석을 실행한 결과, 데속시라폰티제닌은 LPS로 유도된 두꺼운 폐포 중격벽(alveolar septal wall)을 감소시켰고 중성구 침윤(neutrophil infiltration) 및 폐포출혈(alveolar hemorrhage)을 감소시켰으며 NF-κB p65 발현을 억제함을 확인하였다(도 12 참조).
따라서, 본 발명의 상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 세포독성이 없고 염증관련 단백질, 예를 들면, PGE2, TNF-α, iNOS, COX-2, IL-6, 및 MyD88를 억제하고 IKKα/β, IκBα, JNK1, ERK, p38 및 Akt의 인산화 또는 ROS 및 퍼옥시니트리트(peroxynitrite)를 감소시키고 Nrf2 전사인자의 DNA 결합을 촉진시켜 항산화 관련 단백질 및 효소를 증가시키며, LPS로 유도된 급성 폐손상 동물 모델에서 유의적인 치료효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 스틸벤계 화합물은 급성 폐손상을 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체 등을 모두 포함한다.
상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 - 90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 크라이토싸이빈 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 본 발명의 추출물 또는 이의 분획물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서,
R1은 수소, C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 글루코실이고;
R2는 수소, 하이드록시, C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고;
R3는 수소, 또는 C1 -5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이다).
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기의 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.
1) (E)-2-(3-하이드록시-5-(3-하이드록시-4-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
2) (E)-5-(3-하이드록시-4-메톡시스티릴)벤젠-1,3-디올;
3) (E)-2-(3-하이드록시-5-(4-하이드록시-3-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
4) (E)-2-(3-하이드록시-5-(4-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
5) (E)-5-(4-메톡시스티릴)벤젠-1,3-디올; 및
6) (E)-5-(4-하이드록시스티릴)벤젠-1,3-디올.
상기 염증성 질환은 폐렴, 급성 호흡곤란 증후군(acute repiratory distress syndrome;ARDS), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐형성 장애(broncho pulmonary dysplasia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 화합물은 중성구침윤(neutrophil infiltration) 또는 폐포출혈(alveolar hemorrhage)을 감소시키는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 상기 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 세포독성이 없고 염증관련 단백질, 예를 들면, PGE2, TNF-α, iNOS, COX-2, IL-6, 및 MyD88를 억제하고 IKKα/β, IκBα, JNK1, ERK, p38 및 Akt의 인산화 또는 ROS 및 퍼옥시니트리트(peroxynitrite)를 감소시키고 Nrf2 전사인자의 DNA 결합을 촉진시켜 항산화 관련 단백질 및 효소를 증가시키며, LPS로 유도된 급성 폐손상 동물 모델에서 유의적인 치료효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 스틸벤계 화합물은 급성 폐손상을 포함하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 데속시라폰티제닌 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 [화학식 1]로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 데속시라폰티제닌 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 - 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 제조예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
스틸벤계
(
stilbene
) 유도체의 제조
종대황(Rheum undulatum)으로부터 스틸벤계 유도체를 제조하기 위하여, 4.7 ㎏의 종대황을 20 ℓ의 70% 에탄올로 3회 추출하였다. 상기 에탄올 추출물을 혼합하고 농축한 후 잔류물(650 g)로부터 Ngoc T.M. et al., Lipoxygenase inhibitory constituents from rhubarb, (2008) Arch. Pharm. Res. 31 598-605의 문헌에 있는 방법에 따라, 라폰티신(rhaponticin), 라폰티제닌(rhapontigenin), 이소라폰티신(isorhaponticin), 데속시라폰티신(desoxyrhaponticin), 데속시라폰티제닌(desoxyrhapontigenin), 레스베라트롤(resveratrol)을 분리하였다(도 1A).
<
실시예
2> 세포독성 확인
상기 <실시예 1>에서 추출된 스틸벤계 유도체의 세포 생존능력을 확인하기 위하여, 스틸벤계 유도체를 24 시간 처리하여 MTT((4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석을 수행하였다.
구체적으로, RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 1x104 세포의 농도로 깔고 37℃에서 24 시간 동안 배양한 후, 상기 각각의 스틸벤계 유도체 및 비히클(vehicle)을 처리하고 추가적으로 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후, 100 ㎕의 MTT(DPBS 내에 0.5 mg/㎖)용액을 첨가하고 2시간 동안 배양하였다.
그 결과, 도 1B에서 나타낸 바와 같이, 50 μM에서 레스베라트롤은 85%까지 세포생존력이 감소하였으나 다른 스틸벤계 유도체는 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다(도 1B).
<
실시예
3>
스틸벤계
유도체의
NO
생성 억제 효과 확인
LPS로 유도된 NO 생성에 대한 스틸벤계 유도체의 억제효과를 평가하기 위하여, 배지에 있는 니트리트(nitrite) 농도를 그리에스 시약(Griess reagent)을 사용하여 측정하였다.
구체적으로, 1Χ105의 RAW 264.7 세포를 24-웰 플레이트에 깔고 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 도 1B에 나타낸 농도(10, 30 및 50 μM)의 스틸벤계 유도체 또는 비히클로 2시간 전처리한 후, LPS(1 ㎍/㎖)로 18시간 동안 배양하였다. 540 nm에서 EMax® 마이크로 플레이트 리더(EMax® microplate reader(Molecular Devices))를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 2-아미노-5,6-디하이드로-6-메틸-4H-1,3-티아진(2-amino-5,6-dihydro-6-methyl-4H-1,3-thiazine(AMT))는 양성대조군으로 사용되었다.
그 결과, 도 1B에서 나타낸 바와 같이, 데속시라폰티제닌(desoxyrhapontigenin) 및 레스베라트롤(resveratrol)은 농도의존적으로 NO 생성을 감소시키는 것을 확인하였다(도 1B).
<
실시예
4>
스틸벤계
유도체의
NF
-κB 활성 억제 효과 확인
LPS로 유도된 NF-κB 활성에 대한 스틸벤계 유도체의 억제효과를 평가하기 위하여, NF-κB-SEAP-NPT 구조체를 이용하여 NF-κB 활성을 측정하였다.
구체적으로, NF-κB에 SEAP와 NPT가 융합된 발현벡터를 제조하기 위하여, 우선 PCR을 수행하여 SV40 인핸서(enhancer)와 초기 프로모터(early promoter), SV40의 최소 복제근원(minimum origin of replication), NPT의 코딩부위 및 폴리아데닐화 신호서열을 포함하는 전체길이(full-length) 1369 bp의 네오마이신 선별마커클론(neomycin selectable marker clone)을 제조하였다. 상기 PCR 생성물을 제한효소 처리 후 전기영동하여 전장의 네오마이신 선별 마커 클론이 증폭되었음을 확인하였고 이를 pNPT라 명명하였다. 상기에서 제조된 네오마이신 선별 마커 클론 DNA를 전사리포터인 SEAP가 포함된 NF-κB 발현벡터에 클로닝하여 융합 발현벡터를 제조하였고 이를 pNF-κB-SEAP-NPT라 명명하였다. 상기 발현벡터에 네오마이신 선별마커클론 DNA가 클로닝되었음을 벡터 DNA에 제한효소를 처리한 후 전기영동을 수행하여 확인하였다. 또한, 상기 제한효소 처리에 의해 얻은 발현벡터의 삽입부분을 자동 DNA 분석기로 염기서열을 분석한 결과, 발현벡터에 네오마이신 선별 마커 클론 DNA 단편이 올바르게 삽입되었음을 확인하였다.
전사리포터로 사용된 SEAP는 세포 밖으로 분비되기 때문에 전사리포터로서 몇 가지 장점을 가지고 있다. 먼저, SEAP은 세포 밖으로 분비되는 리포터 단백질이므로 상기 효소의 활성을 측정하기 위하여 세포를 용혈(lysis)시킬 필요가 없으며, 감염된 세포가 손상되지 않고 남아있기 때문에 유전자 발현의 동역학(kinetics)이 동일한 배양액에서 반복적으로 측정될 수 있고 상기 세포는 이후의 실험에 계속 사용될 수 있다는 장점을 갖는다(대한민국 공개번호 특2002-0040494).
RAW 264.7 대식세포에 pNF-κB-SEAP-NPT 발현벡터를 형질감염시키기 위하여 RAW 264.7 세포에 NF-κB-SEAP-NPT 발현벡터를 리포펙타민을 이용하여 형질감염시킨 후 형질감염된 RAW 264.7 세포를 선별하고 안정하게 유지하기 위하여 제네티신이 포함된 배지에서 세포를 배양하였다. NF-κB-SEAP-NPT 구조체를 형질감염시킨 RAW 264.7 대식세포에 LPS(1 ㎍/㎖)를 16시간 동안 배양한 후, SEAP 발현이 현저히 증가됨을 관찰함으로써 NF-κB 의존적 전사를 발현시킴을 확인하였고 또한 형질감염이 완성됨을 확인하였다. 상기 형질감염된 세포에 스틸벤계 유도체를 첨가하고 전사리포터 효소인 SEAP이 세포 외로 분비하는지 확인하기 위하여 리포터 효소의 활성도를 측정하였다. 내인성(endogenous) 알칼라인 포스파타제 활성을 제거하기 위하여 배양액을 65℃에서 5분간 가열하였고 이를 즉시 분석에 사용하거나 -20℃에 저장하여 보관하였다. 유전자 리포터 효소의 활성도를 측정하기 위하여, 25 ㎕의 희석 완충용액(dilution buffer), 97 ㎕의 분석 완충용액(assay buffer), 25 ㎕의 세포배양액 시료 및 3 ㎕의 형광기질 4-메틸움벨리페릴인산염(4-methylumbelliferyl phosphate, MUP, 1 mM)을 포함하는 반응 혼합물을 최종부피 150 ㎕로 맞추어 96-웰 플레이트에 첨가한 후 어두운 곳에서 실온으로 60분 동안 반응시켰다. NF-κB의 발현과 동시에 분비되는 SEAP에 의해 형광기질로 첨가된 MUP가 분해되고, 이로부터 생성된 분해물의 형광을 측정하여 NF-κB의 발현변화를 정량적으로 검출하기 위하여 SEAP 형광검출 키트(Great EscApe SEAP System Kit, Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA)를 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, LPS로 유도된 SEAP 발현은 데속시라폰티제닌 및 레스베라트톨에 의해 유의적으로 억제됨을 확인하였다(도 1B).
<
실시예
5>
PGE
2
및
TNF
-α생성에 대한
데속시라폰티제닌의
억제 효과 확인
데속시라폰티제닌의 염증 관련 단백질에 대한 효과를 조사하기 위하여, 활성화된 대식세포로부터 생성된 PGE2 및 TNF-α를 각각 EIA 키트(Cayman Chemival, Arbor, MI) 및 ELISA 키트(ebioscience, Inc.)를 사용하여 측정하였다.
구체적으로, 데속시라폰티제닌 또는 비히클을 다양한 농도로 2시간 동안 RAW 264.7 세포에 전처리한 후, LPS(1 ㎍/㎖)를 16시간 동안 추가적으로 처리하였다. 세포배양 배지를 수집한 후, PGE2 및 TNF-α항체를 이용하여 제조사의 지시에 따라 PGE2 및 TNF-α생성을 확인하였다. 또한, 양성대조군으로 50 μM의 셀레콕시브(celecoxib)(Celebrex®, pfizer) 및 30 μM TPCK를 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, LPS(1 ㎍/㎖)를 세포에 처리하였을 때 높은 PGE2 및 TNF-α가 생성되었으나 데속시라폰티제닌의 전처리는 PGE2 및 TNF-α배출을 농도 의존적으로 감소시켰다(도 2).
<
실시예
6>
iNOS
,
COX
-2,
TNF
-α 및
IL
-6
생성에 대한
데속시라폰티제닌의
억제 효과 확인
데속시라폰티제닌의 염증 관련 단백질에 대한 효과를 조사하기 위하여, iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-6 mRNA 발현에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 정량적 실시간 RT-PCR 분석을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 총 RNA(1 μg)을 아이스크립트 cDNA 합성키트(iScript™ cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD))를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. PCR조건은 5 min 동안 25 ℃, 30분 동안 42℃ 및 5분 동안 85℃이었다. 정량적 실시간 PCR(quantitative RT-PCR)은 0.2 ㎖ PCR 튜브에서 SYBR 그린 용액(SYBR Green working solution (iTaq™ Universal SYBR Green Supermix, BIO-RAD) 및 PCR 마스터 믹스(PCR master mix)을 사용하여 30초 동안 95℃, 15초 동안 95℃ 40 사이클, 20초 동안 55 ℃ 및 35초 동안 72℃에서 실행하였다. 사용한 PCR 프라이머는 iNOS, 5’-TCCTACACCACACCAAAC-3’(서열번호 1) 및 5′-CTCCAATCTCTGCCTATCC-3′(서열번호 2); COX-2, 5′-CCTCTGCGATGCTCTTCC-3′(서열번호 3) 및 5′-TCACACTTATACTGGTCAAATCC-3′(서열번호 4); TNF-α, 5′-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3′(서열번호 5) 및 5′-CTGATGAGAGGGAGGCCATT-3′(서열번호 6); IL-6, 5′-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3′(서열번호 7) 및 5′-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3′(서열번호 8); 및 β-actin, 5′-CCCACTCCTAAGAGGAGGATG-3′(서열번호 9) 및 5′-AGGGAGACCAAAGCCTTCAT-3′(서열번호 10). 각각의 전사체는 β-actin의 증폭수에 표준화하여 상대적 증폭수로 계산하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 염증 관련 단백질(iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-6)의 mRNA 발현이 데속시라폰티제닌 농도 의존적(10, 30 및 50 μM)으로 감소함을 확인하였다(도 3).
<
실시예
7>
MyD88
의 발현, IκBα의 인산화 및 분해, 인산화된
IKK
α/β 발현, 및
Akt
및
MAPK
경로에 대한
데속시라폰티제닌의
효과 확인
다양한 종류의 어댑터(adapters) 및 신호 단백질들이 TLR4 신호 경로에 포함되어 있다. 상기 단백질들에 대한 데속시라폰티제닌의 효과를 조사하기 위하여 각각의 단백질들에 대하여 웨스턴 블랏을 실행하였다.
RAW 264.7 세포에 50 μM의 데속시라폰티제닌을 2시간 동안 전처리하고 시간 의존적(10, 20 및 30분)으로 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리한 후 웨스턴블랏을 실행하였다. 각각의 샘플로부터 10 내지 20 ㎍의 총 단백질 용해물을 8% SDS-PAGE에 의해 분리시키고 전기트랜스퍼(electro-trnsfer;Whatman GmbH)를 실행하였다. 각각의 단백질에 대한 1차 항체(1:1000) 및 해당 2차 항체(1:5000)를 이용하여 블랏하고 WEST-ZOL® PLUS(iNtRON)을 이용하여 검출하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 시간의존적으로 MyD88의 발현정도가 LPS의 자극에 의해 상향조절되었으나, 데속시라폰티제닌의 전처리는 LPS 자극의 5, 10, 20 및 30 분 후에 MyD88 단백질 발현을 감소시켰다(도 4).
또한, 데속시라폰티제닌이 NF-κB 경로를 조절하는지를 알기 위하여 인산화된 IKKα/β(p-IKK)의 단백질 발현을 측정하였다. 인산화된 IKKα/β는 NF-κB 복합체의 p50/p65로부터 IκBα를 인산화 및 유비퀴틴화되도록 함이 알려져 있다. LPS만 처리하였을때는 IKKα/β 및 IκBα 모두가 인산화되었으나, 데속시라폰티제닌은 IKKIα/β의 인산화를 억제하였으며 이는 IκBα의 인산화 및 분해를 억제하는 결과를 나타냄을 확인하였다(도 4).
나아가, 데속시라폰티제닌의 억제 효과를 더욱 알기 위하여, Akt 경로에 대한 효과를 조사하였다. Akt의 인산화 형태(p-AKT)를 상기 방법으로 동일하게 웨스턴블랏으로 측정하였다.
그 결과, p-Akt의 수준은 LPS 유도 30분 후에 증가하였고, 상기 증가는 데속시라폰티제닌에 의해 억제되었다(도 5A).
또한, LPS로 유도된 다양한 MAPK 페밀리 단백질인 p38, JNK1 및 ERK의 인산화를 RAW264.7 세포를 이용하여 측정하였다. 데속시라폰티제닌은 LPS로 자극한 후 30 분에의 p38, JNK1 및 ERK의 활성을 억제하였다(도 5B, 5C 및 5D).
<
실시예
8>
데속시라폰티제닌에
의한
LPS
로 유도된
NF
-κB 및
AP
-1
DNA
결합친화도 확인
데속시라폰티제닌이 NF-κB의 이동을 저해하는지 확인하기 위하여, NF-κB의 DNA-결합 활성을 EMSA에 의해 조사하였다.
상기 EMSA는 Zabel U et al ., DNA binding of purified transcription factor NF-κB. Affinity, specificity, Zn2+ dependence, and differential half-site recognition. J. Biol. Chem. (1991)252-260의 문헌에서 사용한 방법으로 실행하였다. RAW 264.7 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x106 세포로 깔고 24시간 동안 배양한 후, 비히클, 데속시라폰티제닌 및 양성대조군인 파르테놀리드(parthenolide)를 2시간 동안 전처리하고 LPS(1 ㎍/㎖)를 투여하여 1시간 배양하였다. 핵 추출물을 32P-말단-표지된 22-mer 이중가닥 NF-κB 및 AP-1 공통서열로 30분 동안 상온에서 배양하였다. DNA-단백질 결합체를 6% 고유 폴리아크릴아미드 젤(native polyacrylamide gels)에서 분리하였다.
사용된 NF-κB 및 AP-1 프라이머 공통서열은 하기와 같다. NF-κB는 5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′(서열번호 11) 및 3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5′(서열번호 12), 및 AP-1은 5′-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3′(서열번호 13) 및 3′-GCGAACTACTCAGTCGGCCTT-5′(서열번호 14)이었다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, NF-κB의 DNA 결합 활성은 데속시라폰티제닌 또는 20 μM 파르테놀리드(parthenolide)로 처리된 LPS로 활성화된 대식세포로부터 얻은 핵 추출물에서 현저히 감소하였다(도 6A). 또한 데속시라폰티제닌은 AP-1의 DNA-결합 활성을 감소시키는 AP-1 핵 이동에 있어서 농도 의존적인 감소를 나타냈다(도 6B).
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실시예
9>
카라기난으로
유도된 발 부종(
carrageenan
-
induced
paw
edema) 테스트에서
데속시라폰티제닌에
의한 억제 확인
데속시라폰티제닌의 생체내 항염증성 효과를 평가하기 위하여, 마우스에서 카라기난으로 유도된 발 부종(carrageenan-induced paw edema) 테스트를 실행하였다.
상기 부종 테스트는 Choi RJ, et al ., Inhibitory effects of kaurenoic acid from Aralia continentalis on LPS-induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages. Phytomedicine (2011) 677-782의 문헌에서 사용된 방법에 의해서 실행되었다. 6마리의 수컷 ICR 마우스의 오른쪽 뒷 발에 0.05 ㎖의 1% 카라기난을 주사하여 발 부종을 유도하였다. 카라기닌을 주사하기 30분 전에 비히클, 10 mg/kg의 덱사메타존(dexamethasone) 및 5 또는 25 mg/kg의 데속시라폰티제닌을 각각 주사하였다. 발의 두께는 다이알 두께측정기구(dial thickness gauge, No. 2046F, Mitutoyo)를 사용하여 6시간 동안 에데마(edema)유도 전 및 후로 1시간씩 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 데속시라폰티제닌을 이용한 치료는 대조군과 대비하여 5 및 25 mg/kg에서 발의 부기(swelling) 억제를 나타냈다. 데속시라폰티제닌의 치료는 카라기난 주사 후에 1 시간 내지 6 시간 동안 부종의 형성을 억제하였다(도 7).
상기 결과를 종합하면, 데속시라폰티제닌은 LPS로 유도된 대식세포에서 NO 생성, NF-κB 활성, iNOS, COX-2 및 IL-6 발현, 및 PGE2 및 TNF-α 생성을 억제하고 IKKα/β, IκBα, JNK1, ERK, p38 및 Akt의 인산화를 감소시키고 MAPK 페밀리, NF-κB 복합체 및 Akt의 인산화를 억제함으로써 가장 강력한 항염증효과를 나타냈다. 따라서, 데속시라폰티제닌은 항염증제로 사용될 수 있다.
<
실시예
10>
스틸벤계
유도체에 의한
터트
-부틸하이드로퍼옥사이드(
tert
-
butylhydroperoxide(
t
-BHP))로 유도된 세포 생존능력 측정 및
ROS
및
퍼옥시니
트리트(
peroxynitrite)에
대한 효과 확인
ROS 및 퍼옥시니트리트 생성에 대한 스틸벤계 유도체의 효과를 조사하기 위하여, RAW 264.7 세포에서 ROS 및 퍼옥시니트리트 생성을 위하여 t-BHP로 유도하였다.
RAW 264.7 세포를 검은색 96-웰 플레이트에 깔고 24시간 후, 도 8에 나타낸 농도의 스틸벤계 유도체를 첨가하여 2시간 동안 배양한 후 t-BHP(200 μM)을 1시간 동안 추가적으로 첨가하였다. 산화제 민감 형광 탐측인자(oxidant-sensitive fluorescent probe)인 DCFH-DA(20 μM)를 30분 동안 배양하였다. 형광강도를 96-웰 마이크로 플루오로미터(96-well microplate fluorometer)에 의해 485 nm의 여기파장(excitation wavelength) 및 538 nm의 방출파장(emission wavelength)에서 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, t-BHP은 세포내 ROS 및 퍼옥시니트리트 정도를 상승시키고, 데속시라폰티제닌 및 레스베라트롤은 농도 의존적으로 t-BHP로 유도된 ROS 및 퍼옥시니트리트 정도를 억제효과를 나타냈다. ROS 및 퍼옥시니트리트에 대한 데속시라폰티제닌의 반수 최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration(IC50)) 값은 32.83 및 28.22 μM 이였다. 레스베라트롤은 t-BHP로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 ROS 및 퍼옥시니트리트에 대한 IC50 값은 각각 49.07 및 37.82 μM 이였다(도 8).
<
실시예
11> 항산화 효소의
mRNA
발현 및
HO
-1 단백질 발현에 대한
데속시라폰티제닌의
효과 확인
단계 II 효소(phase II enzyme)가 데속시라폰티제닌에 의해 유도되는가를 결정하기 위하여 하기의 프라이머를 이용하여 상기 <실시예 6>에서 사용한 방법과 동일하게 실시간 PCR 분석을 실행하였다(표 2). 정량적 실시간 PCR 분석(Quantitative real-time PCR)은 30초 동안 95℃, 15초 동안 95℃에서 40 사이클, 20초 동안 55, 58 또는 68℃ 및 35초 동안 72℃으로 실행하였다.
Nrf2 경로에 의한 항산화 반응 요소(antioxidant response element(ARE))의 활성화는 단계 Ⅱ 효소, 예를 들면, HO-1, NQO1, GR, SOD, GCLS 및 Prx-1의 유도의 원인이 된다.
HO-1, 수퍼옥사이드 디스뮤타제 3(superoxide dismutase 3(SOD 3), NQO1 및 γ-그루타메이트 시스테인 라이게이즈 사브유닛(GCLS)을 위한 mRNA는 데속시라폰티제닌으로 처리된 RAW 264.7 세포에서 증가된 반면, SOD2, 글루타티온 리덕테이즈(GR) 및 Prx-1의 mRNA 정도는 변하지 않았다(도 9A).
또한, 데속시라폰티제닌에 의한 HO-1 단백질 발현의 유도를 확인하기 위하여 웨스턴블랏 분석을 수행하였고 데속시라폰티제닌(50 μM)의 처리시간이 길어짐에 따라 HO-1은 증가함을 확인하였다(도 9B).
| 유전자 | 전진 프라이머 (Forward Primer) |
후진 프라이머 (Reverse Primer) |
℃ |
| HO-1 | CACGCATATACCCGCTACCT (서열번호 15) |
CCAGAGTGTTCATTCGAGA (서열번호 16) |
58 |
| SOD2 | GCGGTCGTGTAAACCTCAT (서열번호 17) |
CCAGAGCCTCGTGGTACTTC (서열번호 18) |
58 |
| SOD3 | CTGAGGACTTCCCAGTGAC (서열번호 19) |
GGTGAGGGTGTCAGAGTGT (서열번호 20) |
58 |
| NQO1 | TTCTCTGGCCGATTCAGAGT (서열번호 21) |
GGCTGCTTGGAGCAAAATG (서열번호 22) |
58 |
| GR | CAACACAGTGGCCATTCAC (서열번호 23) |
TTGTTTCTCATGGACCACCA (서열번호 24) |
58 |
| GCLS | TGGAGCAGCTGTATCAGTG (서열번호 25) |
AGAGCAGTTCTTTCGGGT (서열번호 26) |
58 |
| Prx-1 | CACTGACAAACATGGGGAAGT (서열번호 27) |
TTTGCTCTTTTGGACATCAGG (서열번호 28) |
68 |
<
실시예
12>
데속시라폰티제닌에
의한
Nrf
전사인자의 발현 증가 및 Keap1의 발현 감소 확인
단계 II 해독성(detoxifying) 및 항산화 효소를 암호화하는 유전자는 프로모터 부위에 ARE 서열을 가진다. Nrf2는 HO-1 및 다른 단계 II 효소와 같은 ARE로 유도된 단백질 발현을 조절하는 중요한 전사인자이다. 데속시라폰티제닌에 의한 Nrf2의 발현정도의 효과를 조사하기 위하여, 상기 <실시예 7> 및 <실시예 8>에서 수행한 동일한 방법으로 웨스턴블랏 및 EMSA를 측정하였다.
데속시라폰티제닌을 1 내지 24시간 동안 처리한 후, RAW 264.7 세포로부터 핵 및 사이토졸 추출물을 분리하고 N-Nrf2, C-Nrf2 , N-pNrf2 및 Keap1 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 10A 및 도 10B에 나타낸 바와 같이 데속시라폰티제닌(50 μM)이 처리된 핵 추출물에서 웨스턴 블랏을 실행한 결과는 인산화된 Nrf2(N-pNrf2) 및 Nrf2(N-Nrf2) 축적 모두를 시간 의존적으로 증가시켰다(도 10A). 또한 데속시라폰티제닌은 Nrf2의 억제제인 Keap1의 단백질 발현을 농도 의존적으로 하향조절했다(도 10B).
또한, ARE의 전사활성에서 Nrf2의 역할을 결정하기 위하여, EMSA를 실행하였다. EMSA에서 사용된 32P가 말단에 표지된 22-mer 이중가닥 Nrf2 공통 올리고뉴클레오티드는 5′-TGG GGA ACC TGT GCT GAG TCA CTG GAG-3′(서열번호 29) 및 3′-ACC CCT TGG ACA CGA CTC AGT GAC CTC-5′(서열번호 30)이고, 핵 추출물과 30분 동안 상온에서 반응시켰다. DNA-단백질 결합체를 6% 고유 폴리아크릴아미드 젤(native polyacrylamide gels)에서 분리하였다.
그 결과, 도 10C에 나타낸 바와 같이, 데속시라폰티제닌은 ARE 서열에 대한 Nrf2 결합을 시간 의존적으로 증가시켰다(도 10C).
<
실시예
13>
데속시라폰티제닌에
의한
PI3K
/
Akt
를 경유한
HO
-1 및
Nrf
-2의 유도 확인
데속시라폰티제닌이 매개된 Nrf-2 활성 및 HO-1 유도에 관여하는 상위 신호경로를 증명하기 위하여, HO-1의 단백질 발현을 측정하였다.
PI3K/Akt, p38, JNK 및 ERK에 대한 각각의 특정 억제제인 LY294002, SB202190, SP600125 및 U0126을 사용하였다. 상기 <실시예 6>에서 사용한 동일한 방법으로 단백질 추출물을 10% SDS-PAGE에 의해 분리시키고 니트로셀룰로오스 멤브린(Whatman GmbH)으로 전기트랜스퍼(electro-transfer)하였다.
그 결과, 도 11A에 나타낸 바와 같이, Akt 경로의 억제는 HO-1 단백질 정도의 증가를 유도하는 데속시라폰티제닌의 용량을 감소시켰다(도 11A).
상기 결과를 더욱 확인하기 위하여, 세포를 siNrf2 또는 siAkt로 형질감염시키고 데속시라폰티제닌을 처리하였다. RAW 264.7 세포를 6-웰 플레이트에 3x105 (cells/well)로 깔고 리포펙타민 RNAiMAX(lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen))을 사용하여 50 nM의 siRNA, Nrf2 SiRNA 또는 AKT siRNA를 형질감염시켰다. 4시간 동안 배양 후, 배지를 FBS가 있는 배지로 대체시켰다.
그 결과, 도 11B에 나타낸 바와 같이, 데속시라폰티제닌에 의한 Nrf2의 활성은 siAkt 또는 siNrf-형질감염된 세포에서 억제되고 HO-1 유도는 siNrf2-형질감염된 세포에서 억제됨을 확인하였다(도 11B).
<
실시예
14> 마우스 모델에서
LPS
-유도된 염증성
폐손상에
대한
데속시라폰티제닌의
효과
데속시라폰티제닌에 의한 염증손상에 관한 효과를 동물에서 조사하기 위하여, Weng, T. I. et al., Honokiol rescues sepsis-associated acute lung injury and lethality via the inhibition of oxidative stress and inflammation. Intensive Care Med. (2011) 37:533-541의 문헌에 있는 방법과 같이 실행하였다.
각 그룹당 5마리의 ICR 수컷 마우스를 급성 폐 염증 분석에 사용하였다. 데속시라폰티제닌(2.5 및 10 mg/kg)을 일주일 동안 2일 간격으로 마우스에 복강내 투여하였고, 7일째에 5 mg/kg의 LPS(Sigma)를 복강내 투여하였다. 24시간 후에 마우스를 희생시키고 폐 조직을 떼어내어 10% 포르말린으로 고정시키고 에탄올로 탈수화시킨 후, 파리핀으로 포매(embedded)시켰다. 4 ㎛ 두께의 조직 절편을 재수화(rehydrate)하여 H&E 염색하여 분석하였다. Nrf2, HO-1 및 p65의 면역침전법 분석을 위하여, 절편을 1% 과산화수소(hydrogen peroxide)로 10분 동안 처리하고 PBS로 세척하였다. 절편을 2% 혈청으로 블라킹(blocking)하고 Nrf2, HO-1 또는 p65 항체로 배양시킨 후 역상 현미경으로 관찰하였다(Olympus CKX41).
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 염증은 H & E 염색에서 나타난 바와 같이 데속시라폰티제닌 처리에 의해 감소되었다. LPS로 유도된 두꺼운 폐포 중격벽(alveolar septal wall)은 데속시라폰티제닌이 처리된 군에서 감소되었다. 또한 데속시라폰티제닌은 중성구 침윤(neutrophil infiltration) 및 폐포출혈(alveolar hemorrhage)을 감소시켰다(도 12A). Nrf2 및 HO-1의 면역조직화학 분석은 데속시라폰티제닌으로 유도된 Nrf2(도 12C) 및 HO-1(도 12B)의 발현을 확인하기 위하여 수행되었다. Nrf2 또는 HO-1 단백질은 데속시라폰티제닌이 처리된 폐조직에 분포되어 있고, 갈색 과립(granules) 또는 점으로 염색되었다. 그러나, NF-κB p65 면역염색된 폐 절단에서는 LPS로 유도된 군과 비교하여 데속시라폰티제닌은 p65 발현을 억제함을 확인하였다(도 12D).
<
실시예
15> 분자 도킹 연구(
Molecular
docking
study
) 확인
리간드피트(LigandFit;Accelrys Inc.)는 활성 부위 형태와 일치하는 포즈를 생성하기 위한 형태 비교 필터(shape comparison filter) 및 몬테 칼로 형태분석(Monte Carlo conformational analysis)을 사용하였다. 결합 친화도는 리그스코어 스코링 기능(LigScore scoring function)으로 계산되어 데속시라폰티제닌을 위한 50.715의 도크_스코어(DOCK_SCORE) 값을 산출하였으나, 리간드피트는 부위 또는 임의의 포즈에 레스베라트롤을 매치할 수 없다. 데속시라폰티제닌은 Arg415, Val418, Cys368 및 Val606에 하이드로젠 결합(hydrogen bonds)을 형성함을 확인하였다(도 13).
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제조예
1> 약제의 제조
1.
산제의
제조
본 발명의 데속시라폰티제닌 500 ng
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
본 발명의 데속시라폰티제닌 500 ng
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
본 발명의 데속시라폰티제닌 500 ng
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 주사제의 제조
본 발명의 데속시라폰티제닌 500 ng
만니톨 180 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
증류수 2974 mg
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.
<
제조예
2> 건강기능식품의 제조
1. 건강식품의 제조
본 발명의 데속시라폰티제닌 500 ng
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 mg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
2. 건강 음료의 제조
본 발명의 데속시라폰티제닌 500 ng
구연산 1000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ml
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
<110> SNU R&DB Foundation
<120> Compositions comprising stilbene compounds or pharmaceutically
acceptable salts thereof as an active ingredient for the
prevention or treatment of inflammation
<130> 14p-02-50
<160> 30
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS-F
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<220>
<223> iNOS-R
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<212> DNA
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ccagagcctc gtggtacttc 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> GR-R
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ttgtttctca tggaccacca 20
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<223> GCLS-R
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<212> DNA
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<223> Prx-1-F
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cactgacaaa catggggaag t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Prx-1-R
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nrf2-R
<400> 30
accccttgga cacgactcag tgacctc 27
Claims (9)
- 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐렴, 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome;ARDS), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐형성 장애(bronchopulmonary dysplasia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
1) (E)-2-(3-하이드록시-5-(3-하이드록시-4-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
2) (E)-5-(3-하이드록시-4-메톡시스티릴)벤젠-1,3-디올;
3) (E)-2-(3-하이드록시-5-(4-하이드록시-3-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
4) (E)-2-(3-하이드록시-5-(4-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
5) (E)-5-(4-메톡시스티릴)벤젠-1,3-디올; 및
6) (E)-5-(4-하이드록시스티릴)벤젠-1,3-디올.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 종대황(Rheum undulatim)으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 폐렴, 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome;ARDS), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐형성 장애(bronchopulmonary dysplasia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 중성구침윤(neutrophil infiltration) 또는 폐포출혈(alveolar hemorrhage)을 감소시키는 것을 특징으로 하는 폐렴, 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome;ARDS), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐형성 장애(bronchopulmonary dysplasia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐렴, 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome;ARDS), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐형성 장애(bronchopulmonary dysplasia)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품:
1) (E)-2-(3-하이드록시-5-(3-하이드록시-4-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
2) (E)-5-(3-하이드록시-4-메톡시스티릴)벤젠-1,3-디올;
3) (E)-2-(3-하이드록시-5-(4-하이드록시-3-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
4) (E)-2-(3-하이드록시-5-(4-메톡시스티릴)페녹시)-6-(하이드록시메틸)-테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;
5) (E)-5-(4-메톡시스티릴)벤젠-1,3-디올; 및
6) (E)-5-(4-하이드록시스티릴)벤젠-1,3-디올.
- 삭제
- 삭제
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| KR1020140043978A KR101624586B1 (ko) | 2014-04-14 | 2014-04-14 | 스틸벤계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물 |
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| KR1020140043978A KR101624586B1 (ko) | 2014-04-14 | 2014-04-14 | 스틸벤계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물 |
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-
2014
- 2014-04-14 KR KR1020140043978A patent/KR101624586B1/ko active IP Right Grant
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