KR20220051526A

KR20220051526A - 갯메꽃 추출물을 포함하는 항암 조성물

Info

Publication number: KR20220051526A
Application number: KR1020200135039A
Authority: KR
Inventors: 박신형
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2022-04-26

Abstract

본 발명은 갯메꽃 추출물을 포함하는 항암 조성물 및 건강기능성 식품, 상기 항암 조성물을 이용한 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

갯메꽃 추출물을 포함하는 항암 조성물{ANTICANCER COMPOSITION CONTAINING CALYSTEGIA SOLDANELLA EXTRACT}

본 발명은 갯메꽃 추출물을 포함하는 항암 조성물 및 건강기능성 식품에 대한 것이다.

세계적으로 폐암은 전체 암종 중에서 2018년 기준 발생율 1위(11.6%)와 사망률 1위(18.4%)를 차지하였다. 여성의 폐암 발생율도 지속적으로 증가하여 유방암, 대장암에 이어 3위, 사망률은 유방암에 이어 2위를 차지하였다. 현재 수술적 절제, 항암요법, 방사선요법 등이 폐암의 주요 치료법으로 활용되고 있지만, 폐암은 초기 진단이 어려워 타 장기로의 전이가 이루어진 말기 단계에 진단되는 경우가 많으며, 항암제 내성 출현 등으로 5년 생존율이 20% 미만인 실정이다. 따라서 암으로 인한 사망의 핵심원인인 폐암의 치료율을 높이기 위한 새로운 치료대책이 요구된다.

전체 폐암의 85%에 해당하는 비소세포암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 환자 중 epithelial growth factor receptor (EGFR, 상피성장인자 수용체) 변이를 가지고 있는 비율은 약 35%로서 아시아 지역, 비흡연자, 여성에게 다빈도로 나타난다고 보고되어 있다. 특히 아시아 지역 비흡연자와 여성의 경우 50% 이상이 EGFR 변이를 가지고 있다고 알려져 있다. 비흡연자와 여성의폐암 발병율이 증가하는 반면 이들에 대한 적절한 예방대책이 부족하므로 EGFR 변이 폐암에 대한 효과적인 치료방안이 필요하다.

폐암의 EGFR 변이는 대부분 exon 19 deletion과 exon 21 L858R로서 EGFR tyrosine kinase의 과활성화를 일으킨다고 알려져 있다. 활성화된 EGFR은 downstream인 RAS/RAF/MEK/ERK MAPK 경로나 PI3K/AKT/mTOR 경로를 통해 암의 성장과 증식, 전이 및 혈관신생을 촉진하고 세포사멸에 저항하게 된다.

EGFR을 표적으로 하는 erlotinib, gefitinib을 포함한 1세대 EGFR tyrosine kinase inhibitor (TKI)는 EGFR 변이 폐암에 대해 기존 항암제보다 훨씬 탁월한 overall survival rate과 종양크기 감소 효과를 보였다. 따라서 EGFR 경로에 addiction 되어있는 EGFR 변이 폐암 치료에 EGFR 활성을 억제하는 것이 효과적인 전략임을 알 수 있다. 이에 1세대 EGFR TKI는 EGFR 변이 비소세포암의 4기 치료에 first line therapy로 활용되고 있으나, 우수한 효과에도 불구하고 대부분의 환자에게 1년 이내 내성이 발생하는 문제점이 있다. 내성획득 기전으로서 EGFR T790M 돌연변이(60%)이 대표적이며, 그 외에 MET amplification, PI3K, STAT3 등 보상경로 활성화(20%), epithelial-mesenchymal transition (EMT)를 포함한 조직학적 변성 및 세포사멸 경로 불활성화 등이 알려져 있다[Chong and Jonne, 2013]. 내성 출현 문제를 극복하기 위해 EGFR TK domain과 비가역적으로 결합하는 2세대 EGFR TKI(afatinib) 및 EGFR T790M 돌연변이를 가진 내성 폐암을 타겟팅하는 3세대 EGFR TKI(osimertinib)까지 개발되었으나, 또다른 내성 출현이 보고되고 있다. 따라서 EGFR TKI 내성 폐암을 효과적으로 치료하기 위한 새로운 약물개발이 시급하다.

우리나라는 3면이 바다로 둘러싸여 있어 해양 천연물 자원을 풍부하게 갖추고 있다. 이에 해양 천연물을 활용하여 새로운 항암물질을 개발하는 것은 매우 경쟁력 있고 유망한 전략이라고 할 수 있다. 갯메꽃(Calystegia soldanella )은 메꽃과(Convolvulaceae )에 속하는 다년생 초본으로서 우리나라 각처의 해안가에 서식한다. 갯메꽃의 성분으로서 flavonoids, calysolins I-XVII, caffeic acids, coumaric acids 등이 보고되어 있다. 갯메꽃의 약리작용으로서 항염증, 항바이러스, 혈당강하 작용 등이 보고되었으며[Lee et al., PTP1B inhibitory effect of alkyl p-coumarates from C. soldanella. Nat Prod Commun. 2014, 9:1585-1588; Ono et al,. Antiviral Activity of Four New Resin Glycosides Calysolins XIV-XVII from C. soldanella against Herpes Simplex Virus. Chem Pharm Bull. 2014, 63:641-648], 최근 HepG2 간암 세포주에서 갯메꽃 추출물이 G1기 및 S기 arrest를 통해 세포증식을 억제함을 보고하였다[Lee et al.,Crude extract and solvent fractions of Calystegia soldanella induce G1 and S phase arrest of the cell cycle in HepG2 cells. Int J Oncol. 2017, 50:414-420]. 그러나 갯메꽃이 폐암 세포 증식에 미치는 영향은 현재까지 연구된 바가 없으며, EGFR 변이나 EGFR TKI 내성을 가지고 있는 폐암 세포에 대한 영향은 전혀 밝혀진 바가 없다.

본 발명의 발명자들은 갯메꽃이 EGFR 야생형 폐암세포주 뿐만 아니라 EGFR 변이 폐암세포주 및 EGFR TKI 내성 폐암세포주의 세포사멸에 미치는 영향을 조사하고 이의 유의한 결과를 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 갯메꽃 추출물을 포함하는 항암 조성물 및 건강기능성 식품, 상기 항암 조성물을 이용한 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갯메꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 갯메꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 건강기능성 식품을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 항암 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 갯메꽃 추출물은 천연물 유래 성분으로서 생체친화적이고 부작용이 없으며, EGFR 야생형 폐암세포주 뿐만 아니라 EGFR 변이 폐암세포주 및 EGFR TKI 내성 폐암세포주의 세포사멸을 유도할 수 있어 새로운 항암제의 개발에 기여할 수 있다.

도 1은 10종의 해양생물의 추출물을 H1975 인체 폐암세포주에 처리한 후 MTT 검정을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다. * P < 0.05, ** P < 0.01 및 *** P < 0.001 vs. 비처리 대조군.
도 2는 갯메꽃 추출물(CSE)을 처리한 인간 폐암세포주의 생존률을 나타낸 것이다: (A)PC9, (B) H1299 및 (C) H1975 세포. * P < 0.05, ** P < 0.01 및 *** P < 0.001 vs. 비처리 대조군.
도 3은 인간 폐암세포주의 sub-G1 DNA 비율에 대한 갯메꽃 추출물(CSE)의 효과를 나타낸 것이다: (A) H1299, (B) PC9, 및 (C) H1975 세포. * P < 0.05, ** P < 0.01 및 *** P < 0.001 vs. 비처리 대조군.
도 4는 갯메꽃 추출물(CSE)을 처리한 인간 폐암세포주 H1299, PC9, 및 H1975 세포의 형태를 나타낸 것이다.
도 5는 갯메꽃 추출물(CSE)을 처리한 인간 폐암세포주 H1299, PC9, 및 H1975 세포의 caspase-2의 절단 효과를 나타낸 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 갯메꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 및 건강기능성 식품에 관한 것이다.

상기 갯메꽃 추출물은 갯메꽃을 적절한 용매로 추출한 것으로, 상기 추출하기 위한 적절한 용매는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 추출 용매로서 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 클로로포름, 디에틸 에테르, 디클로로 메탄, 헥산, 에테르, 벤젠, 메틸렌 클로라이드, 및 시클로헥산 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으며, 예를 들어 에탄올을 용매로 사용하여 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 금은화 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

상기 항암 조성물은 폐암, 대장암, 간암, 전립선암, 직장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 피부암 등의 암에 대해 항암 효과를 나타낼 수 있으며, 예를 들어, 폐암에 대해 항암 효과를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폐암은 EGFR 야생형 폐암 또는 EGFR 내성 폐암을 포함할 수 있으며, 상기 EGFR 내성 폐암은 EGFR TKI 내성 폐암을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 갯메꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물은 약학적으로 유효한 양의 갯메꽃 추출물 이외에 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

나아가 본 발명에 따른 조성물은 상기 기술한 바와 같이 약학적 조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 건강기능식품으로도 사용할 수 있다. 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스낵류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”또는 “건강기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

상기 건강보조식품의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태 일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항암 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

상기 환자는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

시료준비 및 재료

본 실험에 사용된 10종의 해양자원은 넓패(Ishige sinicola), 모래지치(Argusia sibirica), 두켜부채(Distromium decumbens), 청각(Codium fragile), 유령멍게(Ciona intestinalis), 줄의관말(Carpomitra costata), 잎꼬시래기(Gracilaria textorii), 퉁퉁마디(Salicornia europaea), 큰잎모자반(Sargassum coreanum), 갯메꽃(Calystegia soldanella)으로서 각 해양추출물들은 국립해양생물자원관(충남 서천군)에서 분양받은 것으로 80% 에탄올로 추출된 것이다. 분양받은 추출분말을 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 100 ㎎/㎖ 농도로 용해시켜 사용하였다.

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT)는 Duchefa (Haarlem, Netherlands)에서 구입하였고, 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), paraformaldehyde 및 propidium iodide (PI)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 단백질 발현 분석을 위한 cleaved-caspase 3 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. Goat anti-mouse 2차 항체와 goat anti-rabbit 2차 항체는 Bethyl Laboratories (Montgomery, TX)와 Enzo Life Sciences (Farmingdale, USA)에서 각각 구입하였다.

세포주 및 세포 배양

본 연구에 사용된 H1299 (EGFR wildtype), H1975 (EGFR L358R/T790M double 돌연변이; EGFR TKI-resistant) 인체 폐암세포주는 서울대학교 약학대학 이호영 교수님으로부터, PC9 (EGFR delE746-A750 돌연변이; EGFR TKI-sensitive) 인체 폐암세포주는 서울대 학교병원 김동완 교수님으로부터 제공받았다. 모든 세포는 RPMI 1640 (WelGENE, Seoul, Korea) 90%에 fatal bovine serum (FBS; WelGENE) 10%와 antibiotics (WelGENE) 1%를 첨가한 세포배양액에 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.

MTT 분석

seeding한 후 24 h 안정화를 거쳐 시료를 다양한 농도 및 시간으로 처리하였다. 그 후 배양액에 MTT 시약을 0.5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 분주하고 2 h 동안 반응시켰다. 그 다음 상층액을 모두 제거하고 DMSO 100 ㎕를 넣어 각 웰의 formazin을 완전히 녹인 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.

유세포 분석을 통한 세포주기 분석

6 웰 플레이트에 H1299, PC9, H1975 세포를 5×10⁴개 seeding한 후 24 h 안정화를 거쳐 갯메꽃 추출물을 50 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖로 72 h 동안 처리하였다. 그 후 세포들을 모아 80% 에탄올로 -20 ℃에서 밤새 고정하였다. 다음 날 고정된 세포들을 원심분리시킨 후 phosphate buffered saline (PBS)에 PI (50 ㎍/㎖)와 RNase A (30 ㎍/㎖)를 첨가하여 만든 PI 용액 500 ㎕에 현탁하여 30분간 핵을 염색하였다. 그 후 원심분리시켜 상층액을 제거한 후 500 ㎕ PBS에 현탁하여 DNA flow cytometer (FACS Caliber, Becton Dickinson)를 통해 세포주기를 분석하였다. Sub-G1 기의 세포들을 아폽토시스가 일어난 세포로 판단하였다.

DAPI 염색

갯메꽃 추출물을 50 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖ 농도로 72 h 처리한 H1299, PC9, H1975 세포들을 모아서 3.7% paraformaldehyde로 상온에서 30분 동안 고정 후 PBS로 세척하였다. 고정된 세포를 cytospin으로 슬라이드 글라스 위에 부착시키고, PBS와 증류수(DW)에 번갈아 세척한 후 DAPI 용액(2.5 ㎍/㎖)으로 20분간 암실에서 염색하였다. 다시 PBS와 DW에 번갈아 세척한 후 mounting solution (crystal/mount; Biomeda, CA, USA)으로 mounting하여 형광현미경(Carl Zeiss, Germany) 아래에서 200배의 배율로 핵의 형태를 관찰하였다.

웨스턴 블롯

H1299, PC9, H1975 세포에 갯메꽃 추출물을 50 ㎍/㎖과 100 ㎍/㎖ 농도로 72 h 처리하였다. 그 후 세포들을 모아 차가운 radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer (Thermo Scientific, IL, USA)에 protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific)과 phosphatase inhibitor (1 mM Na3VO4 and 100 mM NaF)를 첨가한 lysis buffer에 4℃에서 1 h 동안 용출시켰다. 다음으로 biochinconinic acid (BCA) protein assay kit (Pierce Biotechnology, IL, USA)를 사용하여 단백질을 정량한 후 20 ㎍의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동시키고, electroblotting을 통해 polyvinyl difluoride (PVDF) membrane (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA)으로 옮겼다. 그 후 상온에서 3% bovine serum albumin (BSA, GenDEPOT, TX, USA)으로 1 h 동안 차단하고, 타겟 단백질에 대한 1차 항체를 붙여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후 TBST [Tris-buffered saline (TBS) containing 0.1% Tween 20]로 수차례 세척하고, 상온에서 1 h 동안 2차 항체를 붙인 후 다시 TBST로 세척하여 D-Plus ECL Femto System (Donginbio, Seoul, Korea)을 통해 단백질 발현을 확인하였다

통계 분석

모든 실험 결과는 mean±SD으로 표시하였으며, 통계적 유의성 검증은 Student’s t-test를 이용하여 P < 0.05인 것을 유의성 있다고 판단하였다.

실시예 2

수종 해양자원 추출물의 폐암세포주에 대한 세포증식억제 효과 조사

국립해양자원관에서 분양받은 총 10종의 해양추출물 중 폐암 세포주에 유의한 세포증식억제 효과를 보이는 종을 조사하기 위해 각 추출물을 H1975 인체 폐암세포주에 다양한 농도로 처리 한 후 MTT 분석을 시행하였다. 그 결과 도 1에 나타난 바와 같이 넓패, 모래지치, 청각, 유령멍게, 줄의관말, 잎꼬시래기, 큰잎모자반, 갯메꽃 100 ㎍/㎖ 처리군에서 세포생존율이 각각 72.6±1.89%, 70.1±2.9%, 80.3±0.53%, 72.35±2.88%, 78.7±10.2%, 74.4±3.26%, 77.8±1.96%, 18.8±0.41%로 나타나 대조군에 비해 유의한 세포생존율 감소를 보였다(도 1).

그 중 갯메꽃의 세포증식 억제 효과가 가장 탁월하여, 이후 실험에서는 갯메꽃 추출물(Calystegia soldanella extract, CSE)만을 대상으로 추가실험을 진행하였다.

갯메꽃 추출물의 폐암세포주에 대한 세포증식억제 효과 조사

갯메꽃 추출물이 다양한 EGFR 변이 상태를 가진 폐암세포주에서 세포증식억제 효과를 보이는지 확인하기 위하여 EGFR 야생형인 H1299 세포, EGFR delE746-A750 돌연변이를 가져 EGFR TKI에 높은 감수성을 보이는 PC9 세포, EGFR L358R/T790M 변이를 가져 EGFR TKI에 저항성을 가지는 처리한 후 MTT 분석을 통해 세포생존율을 조사하였다. 그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 갯메꽃 추출물은 농도 및 시간 의존적으로 H1299, PC9, H1975 세포의 생존율을 감소시켰다(도 2). 특히 갯메꽃 추출물 48 h 처리군에 비해 72 h 처리군에서 현저한 세포증식억제 효과를 보여 이후 실험은 72 h 처리조건으로 시행하였다. 이러한 결과는 갯메꽃 추출물이 EGFR 변이 상태에 상관없이 폐암세포의 증식을 일관되게 억제할 수 있으며, 특히 EGFR TKI 저항성 세포주의 증식도 저해할 수 있음을 보여주었다.

유세포 분석을 통한 갯메꽃 추출물의 폐암세포주에 대한 아폽토시스 유발 효과 조사

갯메꽃 추출물에 의한 폐암세포주의 증식억제가 세포주기 억제 혹은 아폽토시스 유발에 의한 것인지 확인하기 위하여 H1299, PC9, H1975 세포에 갯메꽃 추출물을 농도별로 72 h 동안 처리한 후 유세포 분석를 통해 세포주기를 분석하였다. 일반적으로 아폽토시스가 일어나는 세포에서 sub-G1기 세포 비율이 증가하는 것으로 알려져 있다. 세포 주기 분석 결과 도 3에 나타난 바와 같이 3개의 세포주 모두 갯메꽃 추출물에 의해 농도 의존적으로 sub-G1기의 세포 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 갯메꽃 추출물 0 ㎍/㎖ 처리군, 50 ㎍/㎖ 처리군, 100 ㎍/㎖ 처리군의 sub-G1기 세포 비율은 H1299 세포에서 각각 5.23±0.23%, 16.5±2.58%, 65.3±7.06%로 나타났으며(도 3A), PC9 세포에서 각각 0.97±0.06%, 3.33±0.77%, 29.7±0.68%로 나타났고(도 3B), H1975 세포에서 각각 4.24±0.23%, 7.68±0.91%, 61.00±0.59%로 나타나(도 3C), 대조군에 비해 갯메꽃 처리군에서 모두 유의한 증가를 보였다. 따라서 갯메꽃 추출물에 의한 폐암세포주의 생존율 감소(도 2)는 아폽토시스 유발로 인한 것임을 알 수 있으며, 이는 폐암세포의 EGFR 변이 상태나 EGFR TKI 저항성 여부에 상관없이 나타남을 확인하였다. 그러나 sub-G1기 이외에 G1기, S기, G2/M기에서는 특별한 세포비율 증가가 나타나지 않아 갯메꽃 추출물이 cell cycle arrest를 일으키지는 않는 것으로 판단된다.

DAPI 염색을 통한 갯메꽃 추출물의 폐암세포주에 대한 아폽토시스 유발 효과 조사

기존 연구에 따르면 sub-G1기의 세포비율은 아폽토시스 뿐만 아니라 괴사(necrosis) 등 다른 죽음의 형태에 의해서도 증가할 수 있다[Darzynkiewicz et al., 1998]. 따라서 갯메꽃 추출물이 폐암세포에 유발하는 죽음의 형태가 아폽토시스임을 뒷받침하는 추가 실험이 필요하다. 일반적으로 아폽토시스가 일어날 때 염색질 응축과 DNA 단편화로 인해 핵이 작은 조각으로 나눠지게 된다. 이를 근거로 H1299, PC9, H1975 세포에 갯메꽃 추출물을 농도별로 72 h 동안 처리한 후 DAPI 염색을 통해 핵을 관찰하였다. 그 결과 세 종류의 폐암세포주 모두에서 농도 의존적으로 염색질 응축과 핵의 단편화가 증가하는 것을 확인하였다(도 4). 이를 통해 갯메꽃이 폐암세포주에 일으키는 죽음의 형태가 아폽토시스임을 재확인하였다.

웨스턴블롯을 통한 갯메꽃 추출물의 폐암세포주에 대한 아폽토시스 유발 효과 조사

마지막으로 아폽토시스의 핵심적인 마커 단백질에 해당하는 caspase-3의 단편화를 웨스턴블롯으로 확인하였다. Caspase-3는 아폽토시스 유발 시 활성화되는 caspase cascade의 최종 단백질로서 외인성경로(death receptor pathway)를 통해 활성화되는 caspase-8과 내인성경로(mitochondrial pathway)를 통해 활성화되는 caspase-9과 모두 결합하여 실질적으로 아폽토시스를 일으키는 역할을 한다. 도 5에 나타난 바와 같이 H1299, PC9, H1975 세포에 갯메꽃 추출물을 농도별로 72 h 동안 처리한 결과 세 개의 세포주에서 모두 농도 의존적으로 caspase-3의 cleavage가 증가하는 것을 확인하였다(도 5). 이러한 결과는 갯메꽃 추출물에 의해 유발되는 세포 죽음의 형태가 아폽토시스이며, 폐암세포의 EGFR 변이 상태나 EGFR TKI 저항성 여부에 상관없이 나타남을 명백히 보여준다.

결 론

EGFR 변이는 EGFR TKI에 대한 감수성을 증가시키지만, 추가로 발생하는 T790M 변이는 EGFR TKI에 대한 내성을 일으키는 가장 주요한 원인이 된다. 본 발명에서는 갯메꽃 추출물이 EGFR 야생형 및 변이 폐암세포주의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 갯메꽃 추출물이 EGFR 변이 여부에 상관없이 폐암세포주의 증식을 억제하고 아폽토시스를 일으키는 것을 확인하였다. 또한 갯메꽃 추출물은 EGFR TKI 내성세포주에도 효과적으로 아폽토시스를 유발하였다. 비록 추가적인 연구가 이루어져야 하겠지만, 본 발명의 결과는 EGFR TKI naive 폐암과 저항성 폐암에 공히 갯메꽃 추출물의 적용 가능성을 시사하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

갯메꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 갯메꽃 추출물은 물 또는 유기용매에 의해 추출된 것인 항암 조성물
제 2 항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 항암 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 폐암, 대장암, 간암, 전립선암, 직장암, 유방암, 난소암, 피부암 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 예방 및 치료 효과를 갖는 것인 항암 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 폐암의 예방 및 치료 효과를 갖는 것인 항암 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 폐암은 EGFR 야생형 폐암 또는 EGFR 변이 폐암을 포함하는 것인 항암 조성물.
갯메꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 건강기능성 식품.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항암 조성물을 인간을 제외한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.