KR20170140661A - 그라비올라 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 면역 증강용 약학 조성물 - Google Patents

그라비올라 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 면역 증강용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그라비올라 잎의 열수 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은, 사이토카인 및 MAPK 패밀리의 발현을 증가시키면서도 세포독성은 나타내지 않으므로, 면역 증강을 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

그라비올라 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 면역 증강용 약학 조성물{Method for manufacturing graviola extract and pharmaceutical composition for immune enhancement}
본 발명은 면역 증강용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 그라비올라 잎의 열수 추출물의 제조 방법 및 이를 포함하는 면역 증강용 약학 조성물에 관한 것이다.
주로 식물로부터 유래한 천연물은 건강 유지 및 만성적인 질병에 대한 예방을 위해 사용되어왔다. 전통적으로 천연물의 효능은 환자에게 적용되었고, 생물학적인 관점에 의해 해당 성분에 대한 활성 및 의학적인 이점에 대한 연구가 수행되었다(비특허문헌 1 및 2). 아노나 무리카타 L.(Annona muricata L.)는 이러한 식물이며 일반적으로 그라비올라, 사워솝(soursop) 및 구아바나(guabana)로 알려진 바 있다. 그라비올라는 열대의 상록과수로 포포나무과(Annonaceae)의 패밀리에 속한다(비특허문헌 3 내지 5). 그라비올라 나무의 모든 부위는 암 및 기생충에 의한 감염 등 다양한 질병에 대하여 효과적인 것으로 알려져 있다. 특히, 그라비올라의 잎은 방광염, 당뇨병, 두통, 불면증 및 염증에 대하여 효과적이다(비특허문헌 6 및 7). 남아메리카 및 아프리카에서는, 그라비올라의 잎을 민족의학적인 측면에서 암 및 종양의 완화에 적용하기도 하였다. 게다가 의학적인 용도로서, 그라비올라의 과육은 음료, 캔디 및 시럽을 포함하는 식품 생산물의 개발에 사용되었다(비특허문헌 8).
전통적으로 민족의학적인 용도로서의 그라비올라의 사용은 그 효과적인 성분에 대한 추가적인 해명에 관심이 집중되었다. 그라비올라의 다양한 구성 성분들 중에서, 아세토게닌 계열이 암 치료에 적용가능한 것으로 나타났다. 포포나무과의 아세토게닌 화합물은 폴리케티드(polyketide) 경로에 존재하며 35 또는 37개의 탄소 지방산인 긴 사슬로 이루어져있다. 상기 아세토게닌은 씨, 잎 및 과피가 전립선, 이자 및 유방의 암세포에 대하여 세포독성을 나타낸다(비특허문헌 7, 9 및 10). 항암 효능에도 불구하고, 그라비올라 잎에 함유되어 있는 어떤 아세토게닌 화합물은 높은 세포독성을 나타낸다(비특허문헌 11). 또한 그라비올라의 중요한 속성으로서 항산화 물질의 높은 함량을 들 수 있다. 그라비올라 잎에 함유된 페놀산(phenolic acid) 및 플라보노이드(flavonoid) 배당체(glycoside)는 높은 항산화 활성 가능성으로 잘 알려져 있다(비특허문헌 12). 최근에, 그라비올라 잎의 열수 및 에탄올 추출물이 포함하는 총 페놀산 함량 및 총 플라보노이드 함량이 보고된 바 있다. 이들의 함량은 추출물의 자유 라디칼 소거능과 결부된다(비특허문헌 13). 게다가 그라비올라 잎의 에탄올 추출물은 SOD1(superoxide dismutase 1) 및 NRF2(nuclear factor erythroid2-related factor 2)의 발현을 상향조정하고 반응성 산소종의 제거 활성에도 기여한다.
면역 시스템은 미생물 또는 비자기(non-self)적인 외인성(exogenous) 물질의 침입에 방어하기 위한 적응적인 방어 메커니즘이다. 식물에서 주로 유래한 천연물은 면역 관련 질병을 완화시키기 위해 광범위하게 연구되어왔다(비특허문헌 14). 특히 수술 후와 같이 면역력이 손상된 환자, HIV 감염 환자 및 노인 환자에 있어서, 면역 시스템의 자극은 2차 감염이 일어하는 것을 방어하기 위해 매우 중요하다. 보조성 식품으로뿐만 아니라, 상기 식물 유래 천연물은 암 또는 감염을 포함하는 만성적인 질병의 진행을 방어하기 위한 식물성 약제로서 소비되고 있다.
상기 보고들에 따라 그라비올라 추출물(GE)이 염증성 경로에 의해 일어나는 면역 반응을 조절하는지에 대한 질문을 가질 수 있다. 쥐에 구강섭취시킨 에탄올 GE는 쥐의 발에서 카라기난-유도성 부종을 유의성있게 감소시켜 그 가설을 뒷받침한다(비특허문헌 15). 그러나, 염증성 경로에 관여하는 면역 시스템 조절에 의한 GE의 효과는 설명되지 않았다.
관련 종래기술로서 미국공개특허 제2012-171130호(2012.07.05)는 면역 체계의 증강을 위하여 식물 추출물을 추가로 포함하는 식물 및 동물 질병 치료용 조성물을 개시한 바 있다.
미국공개특허 제2012-171130호(2012.07.05)
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본 발명자들은 그라비올라 추출물에 의한 대식세포의 활성 및 사이토카인 생성의 조절 효과에 대하여 연구하던 중, 그라비올라 잎의 열수 추출물이 MAP 키나아제 경로를 활성화시키고 사이토카인 및 NO의 발현을 상승시킴으로써 면역 시스템 자극에 유용하다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 그라비올라 잎의 열수 추출물을 포함하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, a) 그라비올라 잎을 100 ~ 200 ℃에서 발효시키는 단계; 및 b) 상기 발효된 그라비올라 잎을 열수로 추출하는 단계를 포함하는 그라비올라 열수 추출물의 제조 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 단계 a)의 발효는 5 ~ 10시간 동안 수행될 수 있고, 상기 단계 b)의 추출은 30분 ~ 5시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따라, 상기 그라비올라 열수 추출물을 포함하는 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 태양에 따라, 그라비올라 잎의 열수 추출물을 포함하는 면역 증강용 약학 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 열수 추출물은 TNFα, IL-1β 및 iNOS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있고, pJNK, pERK 및 pp38로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있으며, 세포독성을 나타내지 않을 수 있다.
본 발명에 의해, 그라비올라 잎의 열수 추출물이 사이토카인 및 MAPK 패밀리의 발현을 증가시키면서도 세포독성은 나타내지 않는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 그라비올라 잎의 열수 추출물은 면역 증강을 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 (A) 열수 또는 (B) 에탄올 GE의 농도별 처리 후 Raw 264.7 세포의 변화된 형태를 나타낸다.
도 2는 Raw 264.7 세포에서의 열수 또는 에탄올 GE를 처리한 후 (A) 24시간 또는 (B) 48시간 경과 후에 측정한 세포 생존율을 나타낸다. 결과는 매개체 대조군(vehicle-treated control)과의 상대적인 백분율로 표시하였으며 평균 ± 표준오차로 나타내었다(*p＜0.05 vs. 매개체 대조군).
도 3은 (A) 열수 또는 (B) 에탄올 GE의 농도별 처리 후 사이토카인 및 iNOS의 발현 조절 효과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표시하였다(*p＜0.05 vs. 매개체 대조군; #p＜0.05 vs. GE 처리된 군).
도 4는 (A) 열수 또는 (B) 에탄올 GE의 농도별 처리 후 Raw 264.7 세포에서의 TNFα 생성의 조절 효과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표시하였다(*p＜0.05 vs. 매개체 대조군; #p＜0.05 vs. GE 처리된 군).
도 5는 (A) 열수 또는 (B) 에탄올 GE의 농도별 처리 후 Raw 264.7 세포에서의 아질산염 생성의 조절 효과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표시하였다(*p＜0.05 vs. 매개체 대조군; #p＜0.05 vs. GE 처리된 군).
도 6은 (A) 열수 또는 (B) 에탄올 GE의 농도별 처리 후 Raw 264.7 세포에서의 단백질 추출물에 대한 면역 블로팅 분석 결과를 나타낸다.
본 발명은 a) 그라비올라 잎을 100 ~ 200 ℃에서 발효시키는 단계; 및 b) 상기 발효된 그라비올라 잎을 열수로 추출하는 단계를 포함하는 그라비올라 열수 추출물의 제조 방법을 제공한다. 상기 발효 온도는 141 ℃일 때 바람직하게 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 a)의 발효는 5 ~ 10시간 동안 수행될 수 있고, 6시간 동안 발효시킴으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 단계 b)의 추출은 30분 ~ 5시간 동안 수행될 수 있고, 1시간 동안 가열함으로써 바람직하게 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 그라비올라 열수 추출물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 그라비올라 잎의 열수 추출물을 포함하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 함유되는 그라비올라 열수 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 그라비올라 추출물은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 그라비올라 추출물을 0.001 내지 90 % 중량백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 열수 추출물은 TNFα, IL-1β 및 iNOS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있고, pJNK, pERK 및 pp38로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있으며, 세포독성을 나타내지 않을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 그라비올라 잎 추출물의 준비
필리핀에서 자란 그라비올라 잎(그라비올라앤네이처, Anseong-si, Gyeonggi-Do, Korea)을 준비하였다.
열수 추출물의 제조를 위해, 기건(air-dried)시킨 그라비올라 잎 20 kg을 6시간 동안 141 ℃에서 발효시킨 다음 2 t의 물에 넣고 1시간 동안 부차적으로 가열하였다. 이후 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator)를 이용하여 55 ℃에서 5 ~ 7 rpm의 속도로 분말 농축하였다. 최종 추출된 분말은 분석시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
50 % 에탄올 추출물의 제조를 위해, 건조된 그라비올라 잎 63.7 g을 에탄올:증류수가 1:1(v/v)인 용매 1L와 혼합하고 이후 진탕수조(shaking water bath, BF-30SB, Biofree, Seoul, South Korea)를 이용하여 55 ℃에서 70 rpm의 속도로 24시간 동안 추출하였다. 8.0 ㎛ 여과지(Whatman Ltd., Piscataway, NJ, USA)를 통해 여과한 후 상기 열수 추출물과 동일한 방법을 사용하여 농축하였다. 이를 -80 ℃에서 8시간 동안 유지시킨 후 동결건조기(freeze-drier)로 5일 동안 건조시켰다. 이후 분석시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
2. 세포 배양 및 세포 생존율 분석
Raw 264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 획득하였다. 세포는 10 % FBS(fetal bovine serum), 100 U/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신으로 보충된 고함량 글루코스(glucose)의 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 5 % CO2 조건하의 37 ℃의 습한 기온 조건하에서 6-웰 플레이트에 8×105 cells 접종하여 24시간 동안 배양하여 준비하였다.
3. RNA 분리 및 실시간 RT-PCR 방법
RNA 추출 키트(intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 RAW 264.7 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. iScript cDNA 생합성 키트(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 PCR 열순환기(thermal cycler)로 cDNA(First-strand cDNA)를 합성하였다. PCR 조건은 25 ℃에서 5분, 42 ℃에서 30분, 8 ℃에서 5분 그리고 이후 4 ℃에서 유지하는 것으로 하였다. RT-PCR 분석은 PCR 시스템(Step-One Plus Real-Time PCR System, Applied Biosystems Ins, Carlsbad, CA)에서 프라이머 및 SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR Green Master Mix, TaKaRa, Japan)를 사용하여 수행하였다. RT-PCR의 조건은 초기 95 ℃에서 5분을 유지한 다음 95 ℃에서 5분, 60 ℃에서 15분, 72 ℃에서 45분, 95 ℃에서 15분, 60 ℃에서 1분을 40주기로 하여 수행하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 1에 정리하였다. 상기 유전자들의 발현은 β-actin을 기준으로 정상화하였다.
프라이머 서열
IL-1β 정방향 ATG GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC T
역방향 GTG CTG CCT AAT GTC CCC TTG AAT C
IL-6 정방향 AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA
역방향 CAG AAT TGC CAT TGC ACA AC
COX-2 정방향 CCC CCA CAG TCA AAG ACA CT
역방향 CTC ATC ACC CCA CTC AGG AT
iNOS 정방향 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT
역방향 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC
TNFα 정방향 ACA AGC CTG TAG CCC ACG
역방향 TCC AAA GTA GAC CTG CCC
β-actin 정방향 GAC GTT GAC ATC CGT AAA G
역방향 CAG TAA CAG TCC GCC T
4. 사이토카인 발현량의 측정 방법
TNFα 및 IL-1β의 농도는 ELISA 키트(Enzo Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 측정하였다. 시료는 코팅된 미량정량판(microtiter plate)에서 모노클로날(monoclonal) 항체에 투입하여 500 rpm의 속도로 2시간 동안 흔들었다. 세척 버퍼로 4회 세척한 후 폴리클로날(polyclonal) 항체를 웰에 투입하였다. 상기 공존용액(conjugate solution)을 각 웰에 투입한 후 세척하였다. 반응 30분 경과 후, 종결용액(stop solution)을 투입하고 450 nm에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 사이토카인의 농도는 키트 표준 용액의 희석액을 사용하여 결정하였다.
5. 아질산염 정량 분석 방법
세포의 배양 배지를 분리하여 NO 생합성의 지표인 아질산염 생성을 그리스 시약(Griess reagent, 1 % sulfanilic acid in 5 % phosphoric acid and 0.1 % N-ethylenediamine dihydrochloride; molecular probes, Waltham, MA)을 사용하여 측정하였다. 상기 처리된 세포 배양 배지의 각 상층액을, 150 μl씩을 96 웰 플레이트에서 그리스 시약 20 μl 및 탈이온수 130 μl에 혼합한 후 30분 동안 배양하고 이후 548 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 아질산나트륨의 희석액을 표준으로 사용하여 결정하였다.
6. 웨스턴 블로팅 분석 방법
세포를 10 mM 트리스(Tris, pH 7.8), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 인산가수분해효소 억제제(phosphatase inhibitors) 및 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitors)를 포함하는 용균 버퍼에서 균질화시킨 후 용해물(lysate)을 원심분리하여 세포 파쇄물 및 파쇄되지 않은 세포를 제거하였다. 단백질 분석 키트(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정함으로써 단백질의 농도를 정량하였다. 단백질 30 ㎍을 10 % SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리하였고 상기 겔 내의 단백질은 PDVF 멤브레인으로 이동시켰다. 상기 단백질에 특이적인 1차 항체를 연결시키고, 쥐-특이적 또는 토끼-특이적 2차 항체를 인큐베이션하였다. 상기 단백질에 대한 관점을 강화된 화학발광 키트(BioRad, Hercules, CA) 및 화학발광 영상화 장치(Vilber Lourmat, Sint-Denijs-Westrem, Belgique)를 사용하여 시각화하였다. pJNK, JNK, pERK1/2, ERK1/2, pp38, p38(세포 신호전달, Danvers, MA) 및 튜불린(tubulin, sigma, St. Louis, MO)에 대한 1차 항체가 사용되었다.
7. 통계 처리
모든 결과는 평균 ± 표준오차(SEM)로 표현하였다. 시험은 적어도 세 번씩 독립적으로 수행하였다. 결과는 t 테스트(Student's t-test)를 사용하여 분석하였고 p 값(p value)이 0.05보다 적으면 통계적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
<시험예>
1. 그라비올라 추출물에 의한 세포 형태의 분화 유도 효과
그라비올라 추출물(graviola extract, GE)이 대식세포 분화의 활성에 영향을 미치는지에 대해서는 의문점이 있었다. 대식세포가 LPS와 같은 내독소에 노출되면, 상기 세포의 형태는 세포 분화가 시작되는 것과 같이 변화되는데 이는 염증성 면역반응을 활성화하기 위한 첫 번째 단계이다(비특허문헌 16). Raw 264.7 세포를 0, 100 및 200 μg/mL의 열수 또는 에탄올 GE와 함께 배양하여 형태학적 변화를 관찰하였다. 세포가 배지 안에서만 배양되는 경우, 거의 모든 세포들이 원형의 형태 및 일반적인 증식 양상을 나타냈다. 그러나, 세포에 LPS를 처리하면, 세포의 형태가 연장된 형태로 변화되고 증식이 억제되었다. 열수 GE 또는 에탄올 GE 존재하에서, 상기 세포의 형태는 LPS 처리된 세포와 유사하게 유의성 있게 변화되었다(도 1A 및 B의 화살표 부분).
다음으로, GE의 세포독성을 평가하기 위해 GE가 세포 생존율에 영향을 미치는지를 시험하였다. Raw 264.7 세포를 0, 50, 100 및 200 μg/mL의 열수 또는 에탄올 GE와 함께 24 또는 48시간 동안 배양하였다. 세포 생존율은 세포 증식 분석 키트(Wel gene Inc, Korea)를 사용하여 XTT 분석을 통해 측정하였다. 열수 GE는 세포 생존율에 영향을 주지 않았고 24시간 배양하였을 때 세포의 증식이 증가하였으나(도 2A) 48시간 배양하였을 때는 이러한 양상이 나타나지 않았다(도 2B). 반면에, 에탄올 GE의 처리는 24시간 또는 48시간 배양 후 농도 및 시간 의존적인 방식으로 세포 생존율을 감소시켰다(도 2A 및 B). 이러한 결과로 열수 및 에탄올 GE 모두가 대식세포 활성을 유도한다는 것과 열수 GE만이 Raw264.7 세포에서 세포독성을 전혀 나타내지 않는다는 것을 제시할 수 있다.
2. 그라비올라 추출물의 사이토카인 생성 및 일산화질소 생성 효과
대식세포의 활성 및 형태 변화를 관찰하였으므로, 사이토카인 및 iNOS(inducible nitric oxide synthase, 일산화질소 생성효소)의 발현이 GE에 의해 조절되는지를 확인하고자 하였다. 대식세포가 박테리아 감염 또는 내독소에 노출되면, 세포의 형태를 변화시키고(도 1) 염증성 신호를 활성화시키기 위한 반응에서 사이토카인의 생성을 활성화시킨다. NO(Nitric oxide, 일산화질소)는 대식세포 내에서 iNOS에 의한 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 L-시트룰린(L-citruline)으로의 반응을 통해 합성된다(비특허문헌 17). NO는 세포질의 미생물에 대한 방어적인 메카니즘을 수반하고 혈관을 수축시키는 신호 분자처럼 작용한다(비특허문헌 18).
Raw 264.7 세포를 0, 50, 100 및 200 μg/mL의 열수 또는 에탄올 GE로 24시간 동안 처리한 후 LPS 1 μg/mL를 처리하였다. 이후 RT(real time)-PCR에 의해 mRNA의 발현량을 측정하였다. 열수 GE가 TNFα, IL-1β 및 iNOS의 전사 발현을 증가시켰다(도 3A). 게다가, 에탄올 GE 또한 IL-1β 및 iNOS를 증가시켰고 TNFα는 미세하게 증가하였으나 통계적으로 유의성있는 정도는 아니었다(도 3B). 그러나, 열수 GE에 의해 사이토카인 및 iNOS의 증가한 정도는 LPS에 의한 것보다 적었다. 이를 추가적으로 입증하기 위해, Raw 264.7 세포를 GE로 처리하고 배양 배지를 회수하여 사이토카인 생성을 mRNA 발현량으로서 측정하였다. 전사의 증가는 일관적이었으며, TNFα의 수치(도 4) 및 아질산염 수치는 열수 및 에탄올 GE에 의해 증가하였다(도 5). 그러나, IL-1β는 통상적인 시험 조건에 따라서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 열수 GE가 사이토카인 및 iNOS의 전사의 발현을 활성화하나 에탄올 GE는 상기 유전자들의 발현에 대하여 더 적은 효과를 나타냄을 지칭한다.
3. MAPK 경로의 활성화 효과
동물 세포의 박테리아 및 바이러스성 감염은 염증성 면역반응 및 방어적 메카니즘을 준비하기 위한 신호를 활성화시키는 세포막 표면의 TLR 4(toll-like receptor 4)에 의해 드러난다(비특허문헌 19). 상기 MAPK(mitogen-associated protein kinase)는 인산화에 의한 염증성 신호를 중재하고 대식세포의 활성 및 분화 조절을 제공하는 중간 단백질이다. ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPK의 활성은 전염증성 중개자의 발현 증가와 사이토카인 생성의 활성을 유도한다. 형태의 변화 및 사이토카인과 아질산염의 생성 증가에 의해 나타나는 대식세포 활성이 GE에 의한 MAPK 신호 경로의 활성에 의해 중재되는지를 확인하고자 하였다.
Raw 264.7 세포는 0, 50, 100 및 200 μg/mL의 열수 또는 에탄올 GE와 함께 30분 동안 배양하고 MAPK의 인산화 정도를 웨스턴 블로팅을 통해 검사하였다. 열수 GE는 100 μg/mL에서 pJNK 및 pERK의 수치를, 50 μg/mL에서 pp38의 수치를 증가시켰다(도 6A). 세포에 에탄올 GE를 처리한 경우, pJNK 및 pp38의 수치가 증가하였다(도 6B). 그러나, p44-ERK 인산화는 완전히 차단되었다. 상기 인산화된 MAPK의 수치는 LPS 처리된 세포에서보다 훨씬 높았다. 이러한 결과는 GE가 MAPK 신호를 활성화시키고 GE에 의해 중재된 대식세포 활성이 부분적으로 MAPK 활성에 관여한다는 사실을 제시한다.

Claims (8)

  1. a) 그라비올라 잎을 100 ~ 200 ℃에서 발효시키는 단계; 및
    b) 상기 발효된 그라비올라 잎을 열수로 추출하는 단계
    를 포함하는 그라비올라 열수 추출물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 a)의 발효가 5 ~ 10시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 b)의 추출이 30분 ~ 5시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 그라비올라 열수 추출물을 포함하는 식품 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 그라비올라 잎의 열수 추출물을 포함하는 면역 증강용 약학 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 열수 추출물이 TNFα, IL-1β 및 iNOS로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 열수 추출물이 pJNK, pERK 및 pp38로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 열수 추출물이 세포독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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