KR20150061117A - 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물에 관한 것으로서, TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소인 iNOS의 발현을 증가시켜 면역증강 활성이 높은 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물에 관한 것으로서, TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소인 iNOS의 발현을 증가시켜 면역증강 활성이 높은 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물에 관한 것이다.
면역반응은 초기 면역반응인 선천성 면역반응과 후기 면역반응인 후천성 면역반응으로 구분될 수 있다. 초기 면역반응에서는 대식세포와 자연살해세포(natural killer cell; NK 세포)의 활성에 의해 병원체를 억제하여 숙주를 보호하는데, 이때 대식세포는 병원체를 탐식하면서 활성표지인 TNF-α를 많이 생산해 분비하고 NK 세포는 활성표지인 퍼포린(perforin)을 많이 생산하여 분비함으로써 병원체 감염세포를 살해한다. 이어서 후천성 면역에 관여하는 세포독성(cytotoxic) T 림프구, 헬퍼(helper) T 림프구 그리고 B 림프구가 활성화해 감염세포를 살해하거나 항체를 만들어 숙주를 보호한다. 세포독성 T 림프구는 NK 세포처럼 퍼포린을 많이 생산분비해 병원체 감염세포를 죽이고 B 림프구는 헬퍼 T 림프구의 의존 또는 비의존적으로 항체를 만들어 숙주를 보호한다. IL-6 및 TNF-α로 대표되는 염증성 사이토카인은 면역반응을 매개하는 물질로 특히 초기면역반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, NO (산화질소)는 라디칼로서 nitric oxide synthases(NOS) 효소군에 의하여 L-arginine으로부터 생성되며, 중요한 세포의 2차 전달체로 작용한다. 유도성 NOS(inducible NOS; iNOS)는 염증이 있을 때 다량의 NO를 생성하며 peroxynitrite 등 반응성 라디칼을 생성하여 항암, 항균 및 항기생충 효과를 나타낸다. 활성화된 대식세포에 의해 생성된 NO는 종양세포의 파괴에 관여하고 있는 주요한 유효분자로 확인되고 있으며 더욱이, 비특이적으로 숙주를 방어하거나, 대식세포-매개성 사멸, 생체외 및 생체 내에서 미생물 및 종양세포의 증식억제에 NO가 관여하고 있음이 보고된 바 있다. 따라서 세균성 또는 환경적 병원균에 대한 방어작용에 있어서 대식세포를 활성화시킬 수 있는 효과적인 면역조절인자를 개발하는 것이 매우 중요하다.
또한, 면역부전증(immunodeficiency disease)은 임상면역학상의 난치성 질환, 암, 당뇨병, 남성불임증에 이르기까지 깊이 관여되어 있으며, 또한 그밖에도 후천성 면역결핍증(AIDS)를 비롯하여 각종 병원성 바이러스성 질환 기회감염, 기생충감염 등도 모두 면역부전과 관련된 질환이라고 할 수 있다.
생체면역계는 자율신경계 및 내분비계에 의해서 조절되며 체액성 면역과 세포성 면역을 통해 외부로부터 침입하거나 또는 내부에서 생기는 비자기(none-self)를 배제하여 항상성(homeostasis)을 유지하려는 특성이 있다. 그러나 어떤 원인에 의해 이 체계가 비정상적으로 흐트러지면 면역부전, 면역결핍 등이 야기되는 것이다. 이와 같이 비정상적으로 흐트러진 면역체제를 바로잡아 회복시키고 손상된 면역기능을 부활시키기 위해서 일반적으로 면역기능 증강제, 면역기능 부활제 등이 사용된다.
면역기능 증강제는 주로 선천성 및 후천성 면역결핍 증후군에 사용되는 약물로서, 특히 종양이나 후천성 면역 결핍증후군(AIDS)에 대한 약물요법의 일환으로 절실하게 요구되고 있다. 현재 사용되고 있는 대표적인 면역기능 증강제로는 면역글로부린, 인테페론 등이 있다. 이들 중에서, 인간의 면역글로블린(human immunoglobulin)의 하나의 IgG를 농축, 정제한 제제가 홍역, 수두, B형 간염, 유행성 이하선염 등의 예방치료에 사용되고 있으나, 주사 부위의 동통과 혈압강하로 인한 아나필락시스(Anaphylaxis) 양성반응으로 다량 투여는 위험하다는 단점이 있다. 한편, 인터페론(interferon, INF)은 항바이러스 인자로서 발견되었으나, 그 후에 세포증식 억제작용, 면역기능 조절작용 등이 확인되어, 항바이러스제 및 항종양제 등으로 사용되고 있으나, β형은 발열, 권태감, 식욕부진, 주사국소통 또는 탈모증 등의 부작용이 관찰되고, α형은 일시적인 골수기능 억제에 의한 백혈구 감소, GOT의 상승과 같은 부작용을 나타낸다.
또한 면역기능 부활제(immunopotentiators)는 생체의 면역응답을 증가시켜 방사선요법 및 항종양제나 부신피질 스테로이드의 과다한 사용에 의한 속발성 면역부전상태를 개선하는 것으로, 약독화된 결핵균인 BCG(Bacillus Calmette-Gurin)의 부작용을 개선한 CWS(Cell Wall Skelton), WSA(Water Soluble Adjuvant) 등이 사용된다. 화농성 연쇄상구균 A군 3형 Su 주에서 얻은 피시바닐(picibanil)이나 영지버섯(Ganoderma lucidum)에서 얻은 단백다당체인 크레스틴(crestin), 렌티누스 에도데스(Lentinus edodes)에서 추출, 정제한 렌티난(lentinan)등은 면역부활 기능은 인정되지만 항종양활성이나 항 AIDS 효과는 기대하기 어려운 실정이다.
일반적으로, 면역부전시에는 감염에 대한 저항력이 저하되고, 항체생성 부전인 환자는 세균에 의한 감염을 방어할 수 없으며, 소위 면역 옵소닌(opsonin) 효과가 감약됨으로, 호중구의 탐식작용 능력도 떨어지게 된다. 또한 이 경우에는 보체계(complement system) 활성화 반응도 저하되기 때문에 백혈구 유주인자 등이 생성되지 않아, 염증발생율이 높아지고, 바이러스혈증이 일어나 중추신경이나 다른 곳으로 확산되기도 한다.
T 세포계 부전시에는 수두(varicella) 감염이 중증화되고, 유아의 종두(vaccinia)는 범발성 종두진 등의 치명적인 부작용을 수반하게 된다. 결핵, 티프스, 칸디다증 등은 세포성 면역이 주된 방어체계이므로 T 세포계의 부전으로 중증화된다. 원발성 또는 속발성 면역부전에서는 호중구의 기능저하로 인하여 화농균에 대한 살균능력이 저하되고, 통상 화농을 일으키지 않는 녹농균이나 크렙시엘라(klebsiella)도 화농의 원인이 되기도 한다.
체액성 면역부전은 혈청중의 면역글로블린이 결핍되어 나타난다. B 세포의 장해는 B 세포가 골수세포로부터 분화되는 과정에서 일어나거나 B 세포가 항체생성세포로 분화되는 과정에서 일어나는 것으로 생각되고 있다.
그러나 이러한 면역체계의 파괴로 인한 면역부전이나 면역결핍을 증강시키거나 회복시킬 수 있는 약제는 거의 드문 실정이다. 이에 대한 대안으로, 공개특허 10-2011-0080470(공개일자: 2011년07월13일)에는 홍삼 추출물 및 약초 발효물의 건강식품 조성물과 이를 포함하는 면역 증강제 또는 항산화제에 관해 기재하고 있다. 그러나, 이러한 천연 추출물의 경우, 약제로 사용하기에 충분하지 않은 면역증강 활성을 나타내는 문제점이 있었다. 또한, 면역증강 활성이 높은 합성 및/또는 천연 약제가 있다고 하더라도 부작용 등으로 인해 실제로 사용하기에는 어려운 문제들이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명은 TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소(iNOS) 발현을 증가시켜 면역증강 활성이 높은 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물 및 면역증강용 건강기능성 식품을 제공하고자 한다.
또한, 상술한 바와 같은 높은 면역증강활성으로 인해 장 기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암 증상, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품을 제공하고자 한다.
본 발명은 메이신을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소(iNOS) 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 TNF-α 분비의 증가와 NO 합성효소(iNOS) 발현의 증가는 PI3K/Akt/NFκB와 MAPK (ERK와 JNK) 신호전달경로를 통해 수행되는 것일 수 있다.
상기 메이신은 옥수수수염으로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 장 기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암 증상, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명은 메이신을 포함하는 면역증강용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 메이신은 옥수수수염으로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소(iNOS) 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 장 기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암 증상, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병을 예방 또는 개선할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품은 메이신 1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물 및/또는 건강기능성 식품은 메이신 1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다.상기 약학적 조성물은 메이신 50 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 때, TNF-α가 800 ~ 1900 pg/㎖로 분비될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물 및/또는 건강기능성 식품은 메이신 50 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 때, NO 합성효소(iNOS) 발현이 2.5 ~ 4배 증가하는 것일 수 있다.
본 발명은 TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소(iNOS) 발현을 증가시켜 면역증강 활성이 높은 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물 및 면역증강용 건강기능성 식품을 제공하는 효과가 있다.
또한, 상술한 바와 같은 높은 면역증강활성으로 인해 장 기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암 증상, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 실시예 1에서 측정한 메이신의 농도에 따른 세포독성 측정 결과이다.
도 2는 실시예 2에서 TNF-α측정을 통한 메이신의 면역증강 활성 측정 결과이다.
도 3은 실시예 3에서 NO합성효소인 iNOS 발현량 측정에 따른 메이신의 면역증강 기전을 조사한 결과이다.
도 4는 실시예 3에서 NO합성효소인 iNOS 발현량 측정에 따른 메이신의 면역증강 기전을 조사한 결과이다.
도 5는 실시예 4-1에서 메이신의 Akt 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 측정한 결과이다.
도 6은 실시예 4-1에서 메이신의 NF-κB 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 측정한 결과이다.
도 7은 실시예 4-2에서 메이신의 MAPK 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 측정한 결과이다.
도 8은 실시예 4-2에서 메이신의 MAPK 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 측정한 결과이다.
도 9는 실시예 5에서 신호전달경로 차단을 통한 작용기전을 조사한 결과이다.
도 10은 실시예 5에서 신호전달경로 차단을 통한 작용기전을 조사한 결과이다.
도 2는 실시예 2에서 TNF-α측정을 통한 메이신의 면역증강 활성 측정 결과이다.
도 3은 실시예 3에서 NO합성효소인 iNOS 발현량 측정에 따른 메이신의 면역증강 기전을 조사한 결과이다.
도 4는 실시예 3에서 NO합성효소인 iNOS 발현량 측정에 따른 메이신의 면역증강 기전을 조사한 결과이다.
도 5는 실시예 4-1에서 메이신의 Akt 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 측정한 결과이다.
도 6은 실시예 4-1에서 메이신의 NF-κB 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 측정한 결과이다.
도 7은 실시예 4-2에서 메이신의 MAPK 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 측정한 결과이다.
도 8은 실시예 4-2에서 메이신의 MAPK 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 측정한 결과이다.
도 9는 실시예 5에서 신호전달경로 차단을 통한 작용기전을 조사한 결과이다.
도 10은 실시예 5에서 신호전달경로 차단을 통한 작용기전을 조사한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 면역체계의 파괴로 인한 면역부전이나 면역결핍을 증강시키거나 회복시킬 수 있는 약제는 거의 드문 실정으로, 설사 면역증강 활성이 높은 합성 및/또는 천연 약제가 있다고 하더라도 부작용 등으로 인해 실제로 사용하기에는 어려운 문제들이 있다.
본 발명은 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소(iNOS) 발현을 증가시켜 면역증강 활성이 높은 메이신을 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 종래 합성 약학적 조성물보다 인체에 무해하며, 장기간 사용하여도 부작용이 거의 없는 면역증강용 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 메이신을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 메이신(maysin)은 옥수수, 테오신테(teosinte) 및 센티페드그라스에서 발견되는 황색의 식물 색소 플라보노이드(flavonoid) 계열의 물질로서 항산화작용과 항암작용이 있다고 알려져 있다. 그런데 본 발명에서는 옥수수수염 유래의 메이신이 면역을 증강하는 효과를 확인하였다.
본 발명의 메이신은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 옥수수수염으로부터 유래한 것일 수 있다.
상기 옥수수수염에서 유래된 메이신의 신규한 생리활성인 면역증강 활성을 발견하였다.
구체적으로 실시예 2에서 확인되는 바와 같이, 상기 메이신은 TNF-α 분비를 증가시키 면역을 증가시키는 활성을 확인하였다.
또한, 실시예 3에서 확인되는 바와 같이, 상기 메이신은 NO 합성효소(iNOS) 발현을 증가시켜 면역을 증가시키는 활성을 확인하였다.
나아가, 본 발명의 면역증강용 약학적 조성물은 PI3K/Akt/NF-κB 및/또는 MAPK 신호절단경로를 활성화함으로써 면역증강 활성을 나타낼 수 있다.
구체적으로, 실시예 4 내지 5 및 도면 5 내지 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 메이신은 PI3K/Akt/NF-κB 및/또는 MAPK 신호절단경로를 활성화하여 면역증강 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
더불어, 상기 면역증강용 약학적 조성물은 메이신을 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다.
만약, 1 ㎍/㎖의 농도 이하의 메이신을 포함할 경우, 약학적 조성물의 면역증강 활성이 낮아 약제로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있으며, 100 ㎍/㎖의 농도를 초과하는 양의 메이신을 포함할 경우, 메이신의 독성으로 인해 약제로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 메이신에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 메이신을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.1 내지 100 ㎎/㎏의 양, 바람직하게는 1 내지 50 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 메이신을 포함하는 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
나아가, 상기 약학적 조성물은 면역증강이 필요한 증상이 나타나는 질병에 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 장 기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암 증상, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.
더불어, 본 발명은 메이신을 포함하는 면역증강용 건강기능성 식품을 제공한다.
상기 메이신(maysin)은 옥수수, 테오신테(teosinte) 및 센티페드그라스에서 발견되는 황색의 식물 색소 플라보노이드(flavonoid) 계열의 물질로서 항산화작용과 항암작용이 있다고 알려져 있다. 그런데 본 발명에서는 옥수수수염 유래의 메이신이 면역을 증강하는 효과를 확인하였다.
본 발명의 메이신은 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 옥수수수염으로부터 유래한 것일 수 있다.
상기 옥수수수염에서 유래된 메이신의 신규한 생리활성인 면역증강 활성을 발견하였다.
구체적으로 실시예 2에서 확인되는 바와 같이, 상기 메이신은 TNF-α 분비를 증가시켜 면역을 증가시키는 활성을 확인하였다.
또한, 실시예 3에서 확인되는 바와 같이, 상기 메이신은 NO 합성효소(iNOS) 발현을 증가시켜 면역을 증가시키는 활성을 확인하였다.
나아가, 본 발명의 면역증강용 건강기능성 식품은 PI3K/Akt/NF-κB 및/또는 MAPK 신호절단경로를 활성화함으로써 면역증강 활성을 나타낼 수 있다.
구체적으로, 실시예 4 내지 5 및 도면 5 내지 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 메이신은 PI3K/Akt/NF-κB 및/또는 MAPK 신호절단경로를 활성화하여 면역증강 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
더불어, 상기 면역증강용 건강기능성 식품은 메이신을 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다.
만약, 1 ㎍/㎖의 농도 이하의 메이신을 포함할 경우, 건강기능성 식품의 면역증강 활성이 낮아 약제로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있으며, 100 ㎍/㎖의 농도를 초과하는 양의 메이신을 포함할 경우, 메이신의 독성으로 인해 건강기능성 식품으로 사용하기 힘든 문제가 발생할 수 있다.
상기 건강 기능성 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 메이신을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강 기능성 식품을 모두 포함한다.
이때, 식품 또는 음료 중 메이신의 첨가량은, 일반적으로 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 200 ㎍, 바람직하게는 1 내지 100 ㎍의 비율로 첨가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 메이신을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 건강 기능성 식품들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
게다가, 상기 건강기능성 식품은 면역증강이 필요한 상황에 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 장 기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암 증상, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병을 예방 또는 개선할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1. 세포 독성 측정 (
MTT
assay
)
마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 cell을 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco-BRL, USA)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin; +5,000 Units/㎖ Penicillin, +5,000 ㎍/㎕ Streptomycin, Gibco-BRL, USA)을 넣은 RPMI1640 (Thermo Scientific, USA) 배양액으로 5% CO2 가 공급되는 배양기에서 37℃ 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양한 RAW264.7 cell을 5×104 cells/㎖로 96-웰 플레이트(96-well plates; SPL, Korea) 에 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37?, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후, 메이신을 처리하기 전에 혈청이 없는 RPMI(SF media, Thermo Scientific, USA) 배양액으로 갈아준 뒤 2시간 동안 배양하였다. 그 뒤 메이신(농촌진흥청 식량과학원 김선림박사님께서 분리 및 정제하신 메이신을 분양받아 사용)을 각각 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 또는 200 ㎍/㎖ 의 농도로 RAW264.7 cell에 처리하였다.
상기 메이신 처리 이후 24시간 동안 배양한 후, 각 웰(well)에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액(MTT를 5 ㎎/㎖ 농도로 인산완충식염수(PBS; phosphate buffered saline)에 녹인 용액)을 20 ㎕씩 첨가하여 다시 4시간 동안 배양시켰다.
이후 포르마잔(Formazan)형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, 웰 바닥에 형성된 포르마잔을 녹이기 위해 100 ㎕의 디메틸 설폭사이드(DMSO; dimethyl sulfoxide)를 첨가한 후, ELISA reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도는 도면 1에 나타냈다.
도 1에서 확인되는 바와 같이, 메이신 100 ㎍/㎖농도까지는 세포에 대한 독성이 거의 없는 것으로 확인되었으나, 200 ㎍/㎖의 농도에서는 독성이 있는 것을 확인하였다. 따라서 본 실험에서는 메이신을 100 ㎍/㎖농도까지 사용하기로 하였다.
실시예
2.
TNF
-α측정
RAW264.7 cell을 2×105 cells/㎖로 60 디쉬(dish)에 5 ㎖씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후, 메이신을 처리하기 전에 혈청이 없는 RPMI(SF media, Thermo Scientific, USA) 배양액으로 갈아준 뒤 2시간 동안 배양하였다. 그 뒤 면역매개물질인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 0.1 ㎍/㎖와 메이신을 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖의 농도로 RAW264.7 cell에 처리하였다. 상기 처리 이후 24시간 배양하여 세포배양액을 얻은 다음 세포배양액에 함유된 사이토카인을 ELISA kit (Mouse TNF-α EIA kit, Enzo Life Sciences, USA)를 이용하여 측정하였다. 사이토카인의 측정 결과는 도면 2에 나타냈다.
도 2에서 확인되는 바와 같이, TNF-α의 경우, 아무것도 처리하지 않은 대조군(Control, Con)에 비해 메이신을 농도별(1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖)로 처리했을 때의 TNF-α 분비량이 처리한 메이신 농도 의존적으로 유의하게 증가하는 것으로 보아 메이신의 면역증강 효과가 상당히 크다는 것을 알 수 있었다.
또한 이를 통해, 메이신이 대식세포로 하여금 면역반응매개 사이토카인인 TNF-α의 분비를 증가시켜 면역증강을 유발하는 것을 알 수 있었다.
실시예
3.
NO
합성효소 (
iNOS
) 발현량 측정
메이신의 면역증강 기전을 조사하기 위해 마우스 대식세포에 대해 NO 합성효소인 iNOS의 단백질 발현양을 웨스턴 블럿 방법으로 조사하였다.
구체적으로, 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)를 6-웰 플레이트에서 37℃에서 24시간 동안 배양하고 메이신 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖의 농도로 세포에 24시간 동안 처리하였다. 상기 처리 후 세포를 PBS로 세척하고 1400 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 세포를 수득하였다.
수득한 세포는 각각 60 ㎕의 용해 버퍼를 첨가한 후에 30분 동안 얼음 상에서 반응시키고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 단백질을 수득하였다. 이후 수득한 단백질은 브래드포드 분석법을 이용하여 단백질을 정량하고 샘플 로딩 버퍼를 넣고 95 ℃에서 5분 동안 변성시킨 뒤에 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 겔을 이용하여 전기영동 하였다.
상기 전기영동한 겔 상의 단백질을 니트로셀룰로즈(Nitrocellulose; NC) 막에 전송 한 뒤 5% 탈지분유로 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 한 후 1차 항-iNOS 항체 (1:1000=v:v)(Cell Signaling, USA)를 5% 탈지분유에 각각의 비율로 희석한 후 4 ℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 이후 TBST(Tris-Buffered Saline와 Tween 20의 혼합액, 0.1% Tween 20)로 10분마다 3번 세척하고 HRP(horeseradish peroxidase)-컨쥬게이티드 2차 항체를 5% 탈지분유에 1:2000(v/v)으로 희석한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 TBST로 3차례 세척한 후 ECL (Enchanced Chemiluminescence) 기질 용액을 막에 1분 동안 반응시킨 후에 X-ray 필름에 현상하였다. 얻어진 결과를 이미지 J 프로그램을 이용하여 수치화하였고, 도면 3 내지 4에 나타냈다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 면역반응의 특징적인 지표인 iNOS의 단백질 발현량이 아무것도 처리하지 않은 것을 대조군으로 하였을 때, 처리한 메이신의 농도가 증가함에 따라 처리한 메이신의 농도 의존적으로 단백질 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 3을 정량화한 도 4에서도 처리한 메이신의 농도가 높아질수록 단백질 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 메이신은 면역반응관련 효소인 iNOS의 증가를 통해 면역증강효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예
4. 면역증강 기전 조사
4-1:
PI3K
/
Akt
/
NF
κB 신호전달경로
메이신의 마우스 대식세포 (RAW264.7 cells)에 대한 면역증강 기전을 조사하기 위해 세포 생존에 관여하는 대표적인 신호전달 경로인 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)/Akt(Protein Kinase B)/NFκB 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 웨스턴 블럿 방법으로 조사하였다.
구체적으로, PI3K/Akt/NFκB 신호경로는 세포의 증식이나 분화에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 면역반응이 증가하면 Akt와 NFκB가 활성화되는 것으로 밝혀져 있다.
마우스 대식세포(RAW264.7 cells)에 메이신을 농도별(1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖)로 처리한 후, Akt의 인산화를 실시예 3에서 사용한 웨스턴 블럿과 동일한 방법을 통해 Akt 인산화를 측정하였고, 측정 결과는 도면 5에 나타냈다.
도 5에서 확인되는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 메이신을 농도별(1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖)로 처리한 대식세포를 비교하였을 때, 메이신을 처리한 대식세포에서 Akt의 인산화가 처리한 메이신의 농도 의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다.
또한, 마우스 대식세포에 메이신을 농도별(1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖)로 처리한 세포를 핵분획과 세포질분획으로 나누어 단백질 추출을 한 후 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동을 확인하였다. 결과는 도면 6에 나타냈다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, 세포질분획에서 NF-κB의 단백질 발현량이 처리한 메이신의 농도가 증가함에 따라 감소하는 반면, 핵분획에서의 NF-κB 발현량은 처리한 메이신의 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
이는 메이신이 마우스 대식세포에서 나타내는 면역증강 활성이 면역반응에 관여하는 PI3K/Akt/NF-κB 신호전달경로를 활성화함으로써 일어난다는 것을 시사한다.
4-2:
MAPK
신호전달경로
메이신의 마우스 대식세포 (RAW264.7 cells)에 대한 면역증강 기전을 조사하기 위해 세포 생존에 관여하는 대표적인 신호전달 경로인 MAPK (mitogen activated protein kinases, ERK와 JNK) 신호전달경로을 통한 면역증강 기전을 웨스턴 블럿 방법으로 조사하였다.
구체적으로, MAPK (ERK와 JNK) 신호경로는 세포의 증식에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 면역반응이 증가하면 MAPK가 활성화되는 것으로 밝혀져 있다.
마우스 대식세포 (RAW264.7 cells)에 메이신을 농도별(1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖)로 처리한 후, MAPK중 ERK와 JNK의 인산화를 실시예 3에서 사용한 웨스턴 블럿과 동일한 방법을 통해 Akt 인산화를 측정하였고, 실시예 3에서와 동일한 방법으로 수치화하였다. 측정 결과는 도면 7 내지 8에 나타냈다.
도 7에서 확인되는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 메이신을 농도별로 처리한 대식세포를 비교하였을 때, ERK와 JNK의 인산화가 처리한 메이신의 농도 의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7을 정량화한 도 8에서도 처리한 메이신의 농도가 증가할수록 ERK와 JNK의 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 메이신이 마우스 대식세포에서 나타내는 면역증강 활성이 면역반응에 관여하는 MAPK신호전달경로를 활성화함으로써 일어난다는 것을 알 수 있었다.
실시예
5. 신호전달경로 차단을 통한 작용기전 조사
앞서 나타난 메이신의 마우스 대식세포(RAW264.7 cells)에 대한 면역증강 기전이 PI3K/Akt/NFκB와 MAPK (ERK와 JNK) 신호전달경로를 통해 면역증강인자인 TNF-α와 iNOS를 증가시킴으로써 나타난다는 것을 보다 명확하게 규명하기 위해 각각의 신호전달경로를 차단하는 억제제를 이용하여 조사하였다.
마우스 대식세포를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고, PI3K의 억제제인 LY294002 (Sigma, USA), ERK의 억제제인 PD98059 (Sigma, USA) 및 JNK의 억제제인 SP600125 (Sigma, USA)를 각각 20 μM로 처리한 후, 메이신 50 ㎍/㎖을 24시간 동안 처리하였다. 이후 단백질을 수확하여 실시예 3내지 4와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 통해 Akt, ERK 및 JNK의 인산화 정도와 iNOS의 단백질 발현량을 확인하였다. 측정 결과는 도면 9에 나타냈다. 또한, 이때 배지로 분비된 TNF-α의 농도를 ELISA방법으로 측정하였고, 측정 결과는 도면 10에 나타냈다.
도 9에서 확인되는 바와 같이, 메이신을 단독으로 처리 하였을 때 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Akt, ERK 및 JNK의 인산화가 모두 증가함으로써 iNOS의 발현이 증가하였다. 또한, 각각의 억제제를 함께 처리한 경우, 각각의 인산화가 감소함과 동시에 메이신에 의해 증가했던 iNOS의 발현이 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 메이신에 의한 iNOS의 증가는 PI3K/Akt/NFκB와 MAPK (ERK와 JNK) 신호전달경로에 의존적으로 나타남을 알 수 있었다.
도 10에서 확인되는 바와 같이, 메이신을 단독으로 처리 하였을 때 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 배지로 분비된 TNF-α의 양이 증가하였다. 나아가, 각각의 억제제를 처리한 경우, 메이신에 의해 증가했던 TNF-α의 분비량이 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 메이신에 의한 TNF-α의 증가 또한 PI3K/Akt/NFκB와 MAPK (ERK와 JNK) 신호전달경로를 통해 일어남을 알 수 있었다.
상기 실시예를 통해 확인할 수 있는 것과 같이, 본 발명의 메이신은 PI3K/Akt/NFκB와 MAPK (ERK와 JNK) 신호전달경로를 통해 TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소인 iNOS의 발현을 증가시켜 면역증강 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (12)
- 메이신을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 TNF-α 분비를 증가시키고, NO 합성효소(iNOS) 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 TNF-α 분비의 증가 및 NO 합성효소(iNOS) 발현의 증가는 PI3K/Akt/NFκB와 MAPK (ERK와 JNK) 신호전달경로를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 약학적 조성물
- 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 메이신 1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 메이신 50 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 때, TNF-α가 800 ~ 1900 pg/㎖로 분비되는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 메이신 50 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 때, NO 합성효소(iNOS) 발현이 2.5 ~ 4배 증가하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 장 기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암 증상, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 메이신은 옥수수수염으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 면역 증강용 약학적 조성물.
- 메이신을 포함하는 면역증강용 건강기능성 식품.
- 제9항에 있어서, 상기 메이신은 옥수수수염으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능성 식품.
- 제9항에 있어서, 상기 건강기능성 식품은 장 기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암 증상, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병을 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능성 식품.
- 제9항에 있어서, 상기 건강기능성 식품은 메이신 1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능성 식품.
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