JP6516445B2

JP6516445B2 - メイシンを含む免疫増強用医薬組成物

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Publication number: JP6516445B2
Application number: JP2014228645A
Authority: JP
Inventors: ヨンイルパク; ジスンイ
Original assignee: ザカトリックユニバーシティオブコリアインダストリー−アカデミックコーオペレイションファウンデーション
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2014-11-11
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Description

本発明は、メイシンを含む免疫増強用医薬組成物に関し、詳しくは、ＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素であるｉＮＯＳの発現を増加し、免疫増強活性の高いメイシンを含む免疫増強用医薬組成物に関するものである。

免疫反応は、初期免疫反応である先天性免疫反応と後期免疫反応である後天性免疫反応とに分けられる。初期免疫反応では、大食細胞とナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性により病源体を抑制し、宿主を保護するが、このとき、大食細胞は、病源体を貪食しながら活性標識であるＴＮＦ−αを多く生産して分泌し、ＮＫ細胞は活性標識であるパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）を多く生産して分泌することによって、病源体感染細胞を殺害する。次いで、後天性免疫に関与する細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）Ｔリンパ球、ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）Ｔリンパ球、そして、Ｂリンパ球が活性化し、感染細胞を殺害するか、又は抗体を作り、宿主を保護する。細胞毒性Ｔリンパ球は、ＮＫ細胞のようにパーフォリンを多く生産分泌し、病源体感染細胞を殺しており、Ｂリンパ球はヘルパーＴリンパ球の依存又は非依存的に抗体を作り、宿主を保護する。ＩＬ−６及びＴＮＦ−αとして代表される炎症性サイトカインは、免疫反応を媒介する物質であり、特に初期免疫反応に深く関与していることが知られている。また、ＮＯ（酸化窒素）は、ラジカルとして一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）酵素群によって、Ｌ−アルギニンから生成され、重要な細胞の第２次伝達体として作用する。誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）は、炎症があるとき、多量のＮＯを生成し、ペルオキシニトライト等反応性ラジカルを生成し、抗癌、抗菌及び抗寄生虫効果を示す。活性化された大食細胞により生成されたＮＯは、腫瘍細胞の破壊に関与している主要な有効分子として確認されており、しかも非特異的に宿主を防御するか、大食細胞−媒介性死滅、生体外及び生体内で微生物及び腫瘍細胞の増殖抑制にＮＯが関与していることが報告されている。従って、細菌性又は環境的病原菌に対する防御作用において、大食細胞を活性化しうる効果的な免疫調節因子を開発することが非常に重要である。

また、免疫不全症（ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｄｉｓｅａｓｅ）は、臨床免疫学上の難治性疾患、癌、糖尿病、男性不妊症に至るまで深く関与しており、また、その他にも後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ）をはじめとして、各種病原性ウイルス性疾患機会感染、寄生虫感染等もいずれも兔疫不全と関連した疾患と言える。

生体免疫系は、自律神経系及び内分泌系によって調節され、体液性免疫と細胞性免疫を通じて外部から侵入するか、又は内部から発生する非自己（ｎｏｎｅ−ｓｅｌｆ）を排除し、恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持しようとする特性がある。しかし、ある原因により、この体系が非正常的に乱されると、兔疫不全、免疫欠乏等が引き起こされる。このように、非正常的に乱された兔疫体制を正し、回復させ、損傷された免疫機能を復活させるために、一般に免疫機能増強剤、免疫機能賦活剤等が使用される。

免疫機能増強剤は、主に、先天性及び後天性免疫欠乏症候群に使用される薬物であり、特に、腫瘍や後天性免疫欠乏症後群（ＡＩＤＳ）に対する薬物療法の一環として切実に要望されている。現在、使用されている代表的な免疫機能増強剤としては、免疫グロブリン、インターフェロン等がある。この中で、ヒトの免疫グロブリン（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の一つのＩｇＧを濃縮、精製した製剤が麻疹、水痘、Ｂ型肝炎、流行性耳下腺炎等の予防治療として使われているが、注射部位の疼痛と血圧降下によるアナフィラキシー（Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）陽性反応で多量投与は危険であるという短所がある。一方、インターフェロン（ＩＮＦ）は、抗ウイルス因子として発見されたが、その後、細胞増殖抑制作用、免疫機能調節作用等が確認され、抗ウイルス剤及び抗腫瘍剤等として使われているが、β型は発熱、倦怠感、食欲不振、注射局所痛又は脱毛症等の副作用が観察されており、α型は一時的な骨髄機能抑制による白血球減少、ＧＯＴの上昇のような副作用があった。

また、免疫機能賦活剤（ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ）は、生体の免疫応答を増加させ、放射線療法及び抗腫瘍剤や副腎皮質ステロイドの過渡の使用による続発性兔疫不全状態を改善するものであり、弱毒化された結核菌であるＢＣＧ（ＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｒｉｎ）の副作用を改善したＣＷＳ（ＣｅｌｌＷａｌｌＳｋｅｌｔｏｎ）、ＷＳＡ（ＷａｔｅｒＳｏｌｕｂｌｅＡｄｊｕｖａｎｔ）等が使用される。化膿性連鎖状球菌Ａ群３型Ｓｕ株から得られたピシバニール（ｐｉｃｉｂａｎｉｌ）や霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ）から得られた蛋白多糖体であるクレスチン（ｃｒｅｓｔｉｎ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓｅｄｏｄｅｓ）から抽出、精製したレンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）等は、免疫復活機能が認められるが、抗腫瘍活性や抗ＡＩＤＳ効果は期待し難い実状である。

一般に、兔疫不全時には、感染に対する抵抗力が低下され、抗体生成不全の患者は、細菌による感染を防御することができず、言わば、免疫オプソニン（ｏｐｓｏｎｉｎ）効果が減弱されるため、好中球の貪食作用能力も低下される。また、この場合には、補体系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓｙｓｔｅｍ）活性化反応も低下されるため、白血球遊走因子等が生成されず、炎症発生率が高まり、ウイルス血症が生じて、中枢神経や他の部位に拡散されることがあった。

Ｔ細胞系不全時には、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）感染が重症化し、乳児の種痘（ｖａｃｃｉｎｉａ）は、汎発性種痘疹等の致命的な副作用を伴うことなる。結核、チフス、カンジダ症等は、細胞性免疫が主な防御体系であるので、Ｔ細胞系の不全で重症化される。原発性又は続発性兔疫不全では、好中球の機能低下によって化膿菌に対する殺菌能力が低下され、通常、化膿が生じない緑膿菌やクレブシエラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）も化膿の原因になることもある。

体液性兔疫不全は、血清中の免疫グロブリンの欠乏から現われる。Ｂ細胞の障害は、Ｂ細胞が骨髄細胞から分化される過程で生じるか、Ｂ細胞が抗体生成細胞に分化される過程から生じると考えられている。

しかし、このような免疫体系の破壊による兔疫不全や免疫欠乏を増強するか、回復することができる薬剤は、ほとんどないのが実状である。これに対する代案として、特許文献１には、紅参抽出物及び薬草発酵物の健康食品組成物と、これを含む免疫増強剤又は抗酸化剤に関し記載している。しかし、このような天然抽出物の場合、薬剤としての使用には十分でない免疫増強活性を示す問題があった。また、免疫増強活性の高い合成及び／又は天然薬剤があるとしても、副作用等により実際の使用までには難しい問題があった。

韓国公開特許公報１０−２０１１−００８０４７０号（公開日：２０１１年０７月１３日）

本発明は、前記のような問題点を解決するためのものであり、本発明の目的は、ＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現を増加し、免疫増強活性の高いメイシンを含む免疫増強用医薬組成物及び免疫増強用健康機能性食品を提供することにある。

また、本発明の他の目的は、前述のような高い免疫増強活性により腸機能、胃腸病、便泌、胃潰瘍、胃炎、胃癌症状、呼吸器感染、皮膚疾患、鳥類インフルエンザ及び各種癌からなる群から選ばれる１種以上の疾患を予防又は治療する医薬組成物及び健康機能性食品を提供することにある。

本発明は、有効成分として、メイシンを含む免疫増強用医薬組成物を提供する。

本発明の好ましい一実施例によれば、前記医薬組成物は、ＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現を増加させる。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記ＴＮＦ−α分泌の増加とＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現の増加は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦκＢとＭＡＰＫ（ＥＲＫとＪＮＫ）シグナル伝達経路を介して遂行される。

前記メイシンは、トウモロコシのひげに由来するものであってもよい。

本発明の好ましいさらに別の一実施例によれば、前記医薬組成物は、腸機能、胃腸病、便泌、胃潰瘍、胃炎、胃癌症状、呼吸器感染、皮膚疾患、鳥類インフルエンザ及び各種癌からなる群から選ばれる１種以上の疾患を予防又は治療できる。

また、本発明は、メイシンを含む免疫増強用健康機能性食品を提供する。
本発明の好ましい一実施例によれば、前記メイシンは、トウモロコシのひげに由来するものであってもよい。

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記健康機能性食品は、ＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現を増加させる。

本発明の好ましいさらに別の一実施例によれば、前記健康機能性食品は、腸機能、胃腸病、便泌、胃潰瘍、胃炎、胃癌症状、呼吸器感染、皮膚疾患、鳥類インフルエンザ及び各種癌からなる群から選ばれる１種以上の疾患を予防又は改善できる。

本発明の好ましいさらに別の一実施例によれば、前記健康機能性食品は、メイシンを１〜１００μｇ／ｍＬの濃度で含む。

本発明の好ましいさらに別の一実施例によれば、前記医薬組成物及び／又は健康機能性食品は、メイシンを１〜１００μｇ／ｍＬの濃度で含む。前記医薬組成物は、メイシンを５０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で含むとき、ＴＮＦ−αが８００〜１９００ｐｇ／ｍＬで分泌される。

本発明の好ましいさらに別の一実施例によれば、前記医薬組成物及び／又は健康機能性食品は、メイシンを５０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で含むとき、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現が２．５〜４倍増加するものであってもよい。

本発明は、ＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現を増加し、免疫増強活性の高いメイシンを含む免疫増強用医薬組成物及び免疫増強用健康機能性食品を提供する効果がある。

また、前述のような高い免疫増強活性により腸機能、胃腸病、便泌、胃潰瘍、胃炎、胃癌症状、呼吸器感染、皮膚疾患、鳥類インフルエンザ及び各種癌からなる群から選ばれる１種以上の疾患を予防又は治療する医薬組成物及び健康機能性食品を提供する効果がある。

実施例１において、測定したメイシンの濃度による細胞毒性の測定結果である。実施例２において、ＴＮＦ−α測定を通じたメイシンの免疫増強活性の測定結果である。実施例３において、ＮＯ合成酵素であるｉＮＯＳ発現量測定によるメイシンの免疫増強機序を調べた結果である。実施例３において、ＮＯ合成酵素であるｉＮＯＳ発現量測定によるメイシンの免疫増強機序を調べた結果である。実施例４−１において、メイシンのＡｋｔシグナル伝達経路を介した免疫増強機序を測定した結果である。実施例４−１において、メイシンのＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介した免疫増強機序を測定した結果である。実施例４−２において、メイシンのＭＡＰＫシグナル伝達経路を介した免疫増強機序を測定した結果である。実施例４−２において、メイシンのＭＡＰＫシグナル伝達経路を介した免疫増強機序を測定した結果である。実施例５において、シグナル伝達経路遮断を介した作用機序を調べた結果である。実施例５において、シグナル伝達経路遮断を介した作用機序を調べた結果である。

以下、本発明を詳細に説明する。

前述するように、免疫体系の破壊による兔疫不全や免疫欠乏を増強するか、回復させることができる薬剤は、ほとんどない実状であり、たとえ、免疫増強活性の高い合成及び／又は天然薬剤があるとしても副作用等により実際使用には難しい問題がある。

本発明は、メイシンを含む免疫増強用医薬組成物を提供することによって、前述した問題の解決を模索した。これを通じて、ＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現を増加し、免疫増強活性の高いメイシンを含む医薬組成物を提供しており、従来合成医薬組成物より人体に無害で、しかも長期間使用しても副作用がほとんどない免疫増強用医薬組成物を提供する効果がある。

前記メイシン（ｍａｙｓｉｎ）は、トウモロコシ、ブタモロコシ（ｔｅｏｓｉｎｔｅ）及びムカデシバから発見される黄色の植物色素フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）系の物質であり、抗酸化作用と抗癌作用があると知られている。しかし、本発明ではトウモロコシのひげ由来のメイシンに免疫増強の効果を確認した。

本発明のメイシンは、通常的に製造及び／又は購買できるものであれば、特に制限しないが、好ましくは、トウモロコシのひげに由来するものであってもよい。

前記トウモロコシのひげに由来するメイシンの新規な生理活性である免疫増強活性を見出した。

具体的に、実施例２で確認されるように、前記メイシンは、ＴＮＦ−α分泌を増加し、免疫を増加させる活性を確認した。

また、実施例３で確認されるように、前記メイシンは、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現を増加し、免疫を増加させる活性を確認した。

さらに、本発明の免疫増強用医薬組成物は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦ−κＢ及び／又はＭＡＰＫシグナル切断経路を活性化することで、免疫増強活性を示すことができる。

具体的に、実施例４〜５及び図５〜１０で確認されるように、本発明のメイシンは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦ−κＢ及び／又はＭＡＰＫシグナル切断経路を活性化し、免疫増強活性を示すことを確認することができた。

また、前記免疫増強用医薬組成物は、メイシンを含むものであればその含量は特に制限されなく、好ましくは、１〜１００μｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは、１０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で含んでいてもよい。

もし、１μｇ／ｍＬの濃度以下のメイシンを含む場合、医薬組成物の免疫増強活性が低く、薬剤として用いることが困難な問題が生じるおそれがあり、１００μｇ／ｍＬの濃度を超える量のメイシンを含む場合、メイシンの毒性により薬剤として用いることが困難な問題が生じるおそれがある。

本発明に係るメイシンを含む免疫増強用医薬組成物は、それぞれ常法により、散剤、粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾール等の経口型剤形、外用剤、坐剤又は滅菌注射溶液の形態に剤形化して用いてもよい。

詳しくは、製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤又は賦形剤を用いて調製してもよい。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、前記メイシンに少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチン等を混合して調製する。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤等も用いてもよい。

経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が挙げられ、よく使用される単純希釈剤の水、流動パラフィンの他に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が挙げられる。

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステル等が挙げられる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が挙げられる。

本発明に係るメイシンを含む免疫増強用医薬組成物は、患者の年齢、性別、体重に応じて変わるが、一般に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは１〜５０ｍｇ／ｋｇの量を一日、１回〜数回に分けて投与できる。また、メイシンを含む組成物の投与量は、投与経路、疾患の程度、性別、体重、年齢等に応じて増減できる。従って、前記投与量はいかなる場合であっても本発明の範囲を限定するものではない。

前記医薬組成物は、免疫増強が必要な症状が現われる疾患に使用されるものであれば特に制限されなく、好ましくは、腸機能、胃腸病、便泌、胃潰瘍、胃炎、胃癌症状、呼吸器感染、皮膚疾患、鳥類インフルエンザ及び各種癌からなる群から選ばれる１種以上の疾患を予防又は治療できる。

また、本発明は、メイシンを含む免疫増強用健康機能性食品を提供する。

前記メイシン（ｍａｙｓｉｎ）は、トウモロコシ、ブタモロコシ（ｔｅｏｓｉｎｔｅ）及びムカデシバから発見される黄色の植物色素フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）系の物質であり、抗酸化作用と抗癌作用があると知られている。しかし、本発明ではトウモロコシのひげ由来のメイシンが免疫を増強な効果を確認した。

本発明のメイシンは、通常的に製造及び／又は購買できるものであれば、特に制限されなく、好ましくは、トウモロコシのひげに由来したものであってもよい。

前記トウモロコシのひげに由来したメイシンの新規な生理活性である免疫増強活性を見出した。

さらに、本発明の免疫増強用健康機能性食品は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦ−κＢ及び／又はＭＡＰＫシグナル切断経路を活性化することで、免疫増強活性を示すことができる。

前記免疫増強用健康機能性食品は、メイシンを含むものであればその含量を特に制限せず、好ましくは、１〜１００μｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは、１０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で含んでいてもよい。

もし、１μｇ／ｍＬの濃度以下のメイシンを含む場合、健康機能性食品の免疫増強活性が低く、薬剤として用いることが困難な問題が生じるおそれがあり、１００μｇ／ｍＬの濃度を超える量のメイシンを含む場合、メイシンの毒性により健康機能性食品として用いることが困難な問題が生じるおそれがある。

前記健康機能性食品の種類には、特別な制限はない。前記メイシンを添加しうる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤等があり、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセル又は飲料の形態で使用でき、通常的な意味での健康機能性食品を全て含む。

このとき、食品又は飲料中のメイシンの添加量は、一般に、本発明の健康機能性食品組成物の場合、全体食品重量の０．０１〜１５重量％で加えてもよく、健康飲料組成物の場合、１００ｍＬを基準にして０．０２〜２００μｇ、好ましくは１〜１００μｇの比率で添加できる。

本発明の健康飲料組成物は、指示された比率により、必須成分として前記メイシンを含有する他には、液体成分には特別な制限がなく、通常の飲料と共に種々の香味剤又は天然炭水化物等を追加成分として含有してもよい。前述した天然炭水化物の例としては、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖等；二糖類、例えば、マルトース、スクロース等；多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリン；等の通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトール等の糖アルコールである。前述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチン等））及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム等）を使用してもよい。

前記の他に、本発明の健康機能性食品は、種々の営養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び重鎮制（チーズ、チョコレート等）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤等を含有してもよい。

その他に、本発明の健康機能性食品は、天然果物ジュース及び果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。このような成分は、独立に又は組み合わせて使用することができる。

さらに、前記健康機能性食品は、免疫増強が必要な状況に使用されるものであれば特に制限せず、好ましくは、腸機能、胃腸病、便泌、胃潰瘍、胃炎、胃癌症状、呼吸器感染、皮膚疾患、鳥類インフルエンザ及び各種癌からなる群から選ばれる１種以上の疾患を予防又は改善できる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を更に具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：細胞毒性測定（ＭＴＴアッセイ）
マウス由来の大食細胞株であるＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌを１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ＵＳＡ）と１％ペニシリン−ストレプトマイシン（＋５，０００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、＋５，０００μｇ／μＬＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ＵＳＡ）を入れたＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）培養液として５％ＣＯ_２が供給される培養器で、３７℃条件で２４時間培養した。以後、培養したＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌを５×１０^４細胞／ｍＬで９６−ウェルプレート（ＳＰＬ、Ｋｏｒｅａ）に１００μＬずつ添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した後、メイシンを処理する前に、血清のないＲＰＭＩ（ＳＦｍｅｄｉａ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）培養液に代替した後、２時間培養した。その後、メイシン（農村振興庁機能性作物部、キム・ウンスン博士が分離及び精製されたメイシンを、分譲を受けて使用した。）を、それぞれ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬの濃度でＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌに処理した。

前記メイシン処理後、２４時間培養した後、各ウェルに、ＭＴＴ（３−［４−５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）溶液（ＭＴＴを５ｍｇ／ｍＬ濃度でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶かした溶液）を２０μＬずつ添加し、再び４時間培養した。

以後、ホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）形成を確認した後、培地を完全に除去し、ウェル床に形成されたホルマザンを溶かすために、１００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した後、ＥＬＩＳＡリーダを利用して、５７０ｎｍで吸光度を測定した。測定した吸光度は図１に示した。

図１から確認されるように、メイシン１００μｇ／ｍＬ濃度までは細胞に対する毒性がほとんどないことが確認されたが、２００μｇ／ｍＬの濃度では毒性があることを確認した。従って、本実験では、メイシンを１００μｇ／ｍＬ濃度まで用いることにした。

実施例２：ＴＮＦ−αの測定
ＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌを２×１０^５細胞／ｍＬで６０皿に、５ｍＬずつ添加し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した後、メイシンを処理する前に、血清のないＲＰＭＩ（ＳＦｍｅｄｉａ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）培養液に代替した後、２時間培養した。その後、免疫媒介物質であるリポ多糖類（ＬＰＳ）０．１μｇ／ｍＬとメイシンを１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度でＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌに処理した。前記処理後、２４時間培養し、細胞培養液を得た後、細胞培養液に含有されたサイトカインを、ＥＬＩＳＡｋｉｔ（ＭｏｕｓｅＴＮＦ−α ＥＩＡｋｉｔ、ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を利用して測定した。サイトカインの測定結果は図２に示した。

図２から確認されるように、ＴＮＦ−αの場合、何も処理しない対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｏｎ）に比べて、メイシンを各濃度（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬ）で処理したときのＴＮＦ−α分泌量が、処理したメイシン濃度依存的に有意に増加すると見られ、メイシンの免疫増強効果が相当大きいことが分かった。

また、これを通じて、メイシンが、大食細胞に免疫反応媒介サイトカインであるＴＮＦ−αの分泌を増加し、免疫増強を誘発することが分かった。

実施例３：ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現量測定
メイシンの免疫増強機序を調べるために、マウス大食細胞に対してＮＯ合成酵素であるｉＮＯＳのタンパク質発現量をウェスタンブロット法で調べた。

具体的に、マウス大食細胞（ＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌ）を、６−ウェルプレートで、３７℃、２４時間培養し、メイシンを１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度で細胞に２４時間処理した。前記処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１，４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を得た。

得られた細胞は、それぞれ６０μＬの溶解バッファーを添加した後、３０分間、氷上で反応させ、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、タンパク質を得た。以後、得られたタンパク質は、ブラッドフォード分析法でタンパク質を定量し、サンプルローディングバッファーを入れ、９５℃で、５分間変性させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ−ＰｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ゲルで電気泳動した。

前記電気泳動したゲル上のタンパク質を、ニトロセルロース（ＮＣ）膜に伝送した後、５％脱脂粉乳で、室温で１時間、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、第１次抗−ｉＮＯＳ抗体（１：１，０００＝ｖ：ｖ）（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ，ＵＳＡ）を５％脱脂粉乳に、それぞれの比率で希釈した後、４℃で１２時間反応した。前記反応後、ＴＢＳＴ（トリス緩衝食塩水とＴｗｅｅｎ２０の混合液、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で、１０分毎に３回洗浄し、ＨＲＰ（ｈｏｒｅｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−共役第２次抗体を５％脱脂粉乳に１：２０００（ｖ／ｖ）で希釈した後、室温で１時間反応した。前記方法において、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ（ＥｎｃｈａｎｃｅｄＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）基質溶液を膜に１分間反応した後、Ｘ−ｒａｙフィルムに現像した。得られた結果をイメージＪプログラムにより数値化しており、図３〜４に示した。

図３から確認されるように、免疫反応の特徴的な指標であるｉＮＯＳのタンパク質発現量が、何も処理しないものを対照群としたとき、処理したメイシンの濃度が増加するに伴い処理したメイシンの濃度依存的にタンパク質発現量が増加することを確認することができた。

また、図３を定量化した図４においても、処理したメイシンの濃度が高まるほどタンパク質発現量が増加することを確認することができた。

これにより、メイシンは、免疫反応関連酵素であるｉＮＯＳの増加を通じて免疫増強効果を示すことを確認することができた。

実施例４：免疫増強機序照射
４−１：ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦκＢシグナル伝達経路
メイシンのマウス大食細胞（ＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌｓ）に対する免疫増強機序を調べるために、細胞生存に関与する代表的なシグナル伝達経路であるＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３−ｋｉｎａｓｅ）／Ａｋｔ（ＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＢ）／ＮＦκＢシグナル伝達経路を介した免疫増強機序をウェスタンブロット法で調べた。

具体的に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦκＢシグナル経路は、細胞の増殖や分化に関与することが知られており、免疫反応が増加すると、ＡｋｔとＮＦκＢが活性化されることが明らかになっている。

マウス大食細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）に、メイシンを各濃度（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬ）で処理した後、Ａｋｔのリン酸化を実施例３で使用したウェスタンブロットと同じ方法で、Ａｋｔリン酸化を測定しており、測定結果は図５に示した。

図５から確認されるように、何も処理しない対照群とメイシンを各濃度（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬ）で処理した大食細胞を比較したとき、メイシンを処理した大食細胞でＡｋｔのリン酸化が処理したメイシンの濃度依存的に増加されていることを確認することができた。

また、マウス大食細胞に、メイシンを各濃度（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬ）で処理した細胞を核画分と細胞質画分とに分け、タンパク質抽出をした後、ウェスタンブロット法でＮＦ−κＢの細胞質から核への移動を確認した。結果は図６に示した。

図６から確認されるように、細胞質画分でＮＦ−κＢのタンパク質発現量が、処理したメイシンの濃度が増加するに伴い減少する反面、核画分でのＮＦ−κＢ発現量は、処理したメイシンの濃度依存的に増加していることを確認することができた。

これは、メイシンがマウス大食細胞で示す免疫増強活性が免疫反応に関与するＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を活性化することで生じるということを示唆する。

４−２：ＭＡＰＫシグナル伝達経路
メイシンのマウス大食細胞（ＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌｓ）に対する免疫増強機序を調べるために、細胞生存に関与する代表的なシグナル伝達経路であるＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ，ＥＲＫとＪＮＫ）シグナル伝達経路を介した免疫増強機序をウェスタンブロット法で調べた。

具体的に、ＭＡＰＫ（ＥＲＫとＪＮＫ）シグナル経路は、細胞の増殖に関与することが知られており、免疫反応が増加すると、ＭＡＰＫが活性化されることが明らかになっている。

マウス大食細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）に、メイシンを各濃度（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬ）で処理した後、ＭＡＰＫ中のＥＲＫとＪＮＫのリン酸化を実施例３で使用したウェスタンブロットと同じ方法により、Ａｋｔリン酸化を測定し、実施例３と同様にして数値化した。測定結果は図７〜８に示した。

図７から確認されるように、何も処理しない対照群とメイシンを各濃度で処理した大食細胞を比較したとき、ＥＲＫとＪＮＫのリン酸化が、処理したメイシンの濃度依存的に増加されていることを確認することができた。

また、図７を定量化した図８においても、処理したメイシンの濃度が増加するほどＥＲＫとＪＮＫのリン酸化が増加することを確認することができた。

これにより、メイシンがマウス大食細胞で示す免疫増強活性が免疫反応に関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化することで生じるということが分かった。

実施例５：シグナル伝達経路遮断を通じて作用機序の調査
前述したメイシンのマウス大食細胞（ＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌｓ）に対する免疫増強機序が、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦκＢとＭＡＰＫ（ＥＲＫとＪＮＫ）シグナル伝達経路を介して免疫増強因子であるＴＮＦ−αとｉＮＯＳを増加させることによって現れるということをより明らかにするために、それぞれのシグナル伝達経路を遮断する抑制剤を用いて調べた。

マウス大食細胞を６−ウェルプレートで２４時間培養し、ＰＩ３Ｋの抑制剤であるＬＹ２９４００２（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、ＥＲＫの抑制剤でＰＤ９８０５９（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及びＪＮＫの抑制剤であるＳＰ６００１２５（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を、それぞれ２０μＭで処理した後、メイシンを５０μｇ／ｍＬを２４時間処理した。以後、タンパク質を収穫し、実施例３〜４と同様にしてウェスタンブロット法により、Ａｋｔ、ＥＲＫ及びＪＮＫのリン酸化程度とｉＮＯＳのタンパク質発現量を確認した。測定結果は図９に示した。また、この時、培地に分泌されたＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡ方法で測定しており、測定結果は図１０に示した。

図９から確認されるように、メイシンを単独で処理したとき、何も処理しない対照群と比較して、Ａｋｔ、ＥＲＫ及びＪＮＫのリン酸化がいずれも増加することで、ｉＮＯＳの発現が増加した。また、それぞれの抑制剤を一緒に処理した場合、それぞれのリン酸化が減少すると同時に、メイシンにより増加したｉＮＯＳの発現が顕著に減少していることを確認することができた。

これにより、メイシンによるｉＮＯＳの増加は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦκＢとＭＡＰＫ（ＥＲＫとＪＮＫ）シグナル伝達経路に依存的に現われることが分かった。

図１０から確認されるように、メイシンを単独で処理した時、何も処理しない対照群と比較して、培地に分泌されたＴＮＦ−αの量が増加した。また、それぞれの抑制剤を処理した場合、メイシンにより増加したＴＮＦ−αの分泌量が有意に減少していることを確認することができた。

これにより、メイシンによるＴＮＦ−αの増加もまたＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦκＢとＭＡＰＫ（ＥＲＫとＪＮＫ）シグナル伝達経路を通じて生じていることが分かった。

前記実施例を通して確認できるように、本発明のメイシンは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦκＢとＭＡＰＫ（ＥＲＫとＪＮＫ）シグナル伝達経路を介してＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素であるｉＮＯＳの発現を増加し、免疫増強効果を示すことを確認することができた。

Claims

有効成分として、メイシンを５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で含み、
前記メイシンによって、大食細胞のＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現を増加させることを特徴とする、免疫増強用医薬組成物。
前記ＴＮＦ−α分泌の増加及びＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現の増加は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＮＦκＢとＭＡＰＫ（ＥＲＫとＪＮＫ）シグナル伝達経路を通して遂行されることを特徴とする請求項１に記載の免疫増強用医薬組成物。
前記医薬組成物は、メイシンを５０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で含むとき、ＴＮＦ−αが、８００〜１９００ｐｇ／ｍＬで分泌されることを特徴とする請求項１に記載の免疫増強用医薬組成物。
前記医薬組成物は、メイシン５０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で含むとき、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現が、２．５〜４倍増加することを特徴とする請求項１に記載の免疫増強用医薬組成物。
前記メイシンは、トウモロコシのひげに由来することを特徴とする請求項１に記載の免疫増強用医薬組成物。
有効成分として、メイシンを５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で含み、
前記メイシンによって、大食細胞のＴＮＦ−α分泌を増加し、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）発現を増加させることを特徴とする、免疫増強用健康機能性食品。
前記メイシンは、トウモロコシのひげに由来することを特徴とする請求項６に記載の免疫増強用健康機能性食品。