KR101810041B1 - 에모딘 3-o-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역 증강용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)을 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기
에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)가 TNF-?와 IL-6의 분비량, iNOS의 발현 및 Nitric oxide의 발생량을 현저히 증가시키고 MAPK 신호전달경로를 조절함으로써 면역증강 활성이 우수한 조성물에 관한 것이다.

Description

에모딘 3-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역 증강용 조성물{Composition comprising Emodin 3-O-glucoside having immunostimulating activity}
에모딘 3-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
식물 유래의 천연물인 플라보노이드 (flavonoid) 및 안트라퀴논 (anthraquinone) 등 식물계 페놀릭 화합물들은 유용한 생리활성을 바탕으로 이미 항혈전제, 항위궤양, 항위암 전문치료제, 치매 예방 및 치료제 등 이들을 이용한 다양한 전문 의약품이 개발되어 있으며, 의약품 및 건강기능성 식품 시장에 있어서 페놀릭 화합물에 대한 수요는 계속 증가하고 있어 관련물질의 발굴 및 개발에 대한 필요성이 지속적으로 요구되고 있음 (비특허문헌 1-3). 안트라퀴논 화합물 중 하나인 에모딘 (Emodin; 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)은 식물유래의 천연물질로서 전통 동양의학에서 오랫동안 사용되어 왔으며, 람누스 (Rhamnus, Buckthorn)속의 수많은 식물의 뿌리와 껍질에서 자연 상태로 발견할 수 있다. 또한, 에모딘은 중국의 약초 의학요법 중에서 가장 오래되고 잘 알려진 대황 (Rheum palmatum)의 뿌리에 람노사이드 상태로 존재하고, 차풀이나 알로에의 뿌리, 잎, 껍질에서도 관찰되며, 야생버섯 (Dermocybe sanguinea)이나 다양한 곰팡이에서도 볼 수 있다. 종래, 에모딘은 천연물로부터 유래되어 인체 내에 대한 세포독성이 현저히 낮아 비만, 당뇨병 등의 대사성 질환의 개선 및 치료에 사용되어 오고 있다. 최근에는 에모딘의 암 억제 메카니즘이 알려지면서 항암제로서의 연구 또한 활발히 진행되고 있다 (비특허문헌 4). 그 예는 다음과 같다.
먼저, 암 치료와 함께 암을 예방할 수 있는 항돌연변이 효과를 갖는 산모근 유래의 에모딘을 유효성분으로 하는 약제학적 조성물이 발표된 바 있다 (특허문헌 1). 다음으로, 에모딘(emodin)은 카제인 단백질 인산화 효소 Ⅱ의 강력한 억제제로서 자궁암 세포의 성장억제효과가 있다는 결과가 발표된 바 있다 (특허문헌 2). 또한, 에모딘을 난소암 치료제인 카보플라틴과 함께 난소암 세포와 반응시키면 암세포 저해효과는 증강되지 않았으나, 에토포사이드나 노보비오신과 함께 사용했을 경우에는 암세포 저해효과가 향상된다는 결과가 발표된 바 있으며 (비특허문헌 5), 에모딘을 단독으로 처리한 경우, 유방암 세포의 성장을 저해하는 효과가 있는 것으로 알려진 바 있다 (비특허문헌 6). 또한, 에모딘은 자외선과 항암제인 cisplatin에 의해 유도되는 인간세포의 DNA 손상을 증가시키고 백혈병 세포주인 HL-60 세포아 폐암 세포의 아포토시스를 유도한다 (비특허문헌 7-9). 그러나 이때까지의 대부분의 에모딘에 대한 연구는 종양세포생물학에 집중되어왔을 뿐만 아니라, 이의 당 유도체에 대한 면역증강 효과는 아직 보고되고 있지 않다. 또한, 플라보노이드 및 안트라퀴논의 배당체가 생물학적 이용성이 더 유리함에도 불구하고, 이들 생리효능에 대한 세포 및 인체 내에서의 작용기전이나 보다 다양한 생리 기능성에 대한 연구는 우리나라 뿐만아니라 전 세계적으로도 많이 이루어지지 않고 있는 상태이다. 특히, 에모딘의 배당체인 에모딘 3-O-글루코시드의 면역증강 활성에 대하여 현재까지 연구되거나 보고된바가 없다. 이에, 본 발명자들은 에모딘에 글리코시드를 도입하여 제조된 에모딘 3-O-글루코시드의 면역증강 효능을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
면역반응은 초기 면역반응인 선천성 면역반응과 후기 면역반응인 후천성 면역반응으로 구분될 수 있다. 초기 면역반응에서는 대식세포와 자연살해세포 (natural killer cell, NK 세포)의 활성에 의해 병원체를 억제하여 숙주를 보호하는데, 이때 대식세포는 병원체를 탐식하면서 활성표지인 TNF-α를 많이 생산해 분비하고 NK 세포는 활성표지인 퍼포린 (perforin)을 많이 생산하여 분비함으로써 병원체 감염세포를 살해한다. 이어서 후천성 면역에 관여하는 세포독성 (cytotoxic) T 림프구, 헬퍼 (helper) T 림프구 그리고 B 림프구가 활성화 해 감염세포를 살해하거나 항체를 만들어 숙주를 보호한다. 세포독성 T 림프구는 NK 세포처럼 퍼포린을 많이 생산 분비해 병원체 감염세포를 죽이고 B 림프구는 헬퍼 T 림프구의 의존 또는 비의존적으로 항체를 만들어 숙주를 보호한다 (10-11). IL-6 및 TNF-α로 대표되는 염증성 사이토카인은 면역반응을 매개하는 물질로 특히 초기면역반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다 (12). 또한, NO (산화질소)는 라디칼로서 nitric oxide synthases (NOS) 효소군에 의하여 L-arginine으로부터 생성되며, 세포의 중요한 2차 전달체로 작용한다 (13). 유도성 NOS (inducible NOS; iNOS)는 염증이 있을 때 다량의 NO를 생성하며 peroxynitrite 등 반응성 라디칼을 생성하여 항암, 항균 및 항기생충 효과를 나타낸다 (14). 활성화된 대식세포에 의해 생성된 NO는 종양세포의 파괴에 관여하고 있는 주요한 유효분자로 확인되고 있으며 더욱이, 비특이적으로 숙주를 방어하거나, 대식세포-매개성 사멸, 생체외 및 생체내에서 미생물 및 종양세포의 증식억제에 NO가 관여하고 있음이 보고 된 바 있다 (15-16). 따라서 세균성 또는 환경적 병원균에 대한 방어작용에 있어서 대식세포를 활성화시킬 수 있는 효과적인 면역조절인자를 개발하는 것이 매우 중요하다.
또한, 면역부전증 (immunodeficiency disease)은 임상면역학상의 난치성 질환, 암, 당뇨병, 남성불임증에 이르기까지 깊이 관여되어 있으며, 또한 그밖에도 후천성 면역결핍증 (AIDS)를 비롯하여 각종 병원성 바이러스성 질환 기회감염, 기생충감염 등도 모두 면역부전과 관련된 질환이라고 할 수 있다.
생체면역계는 자율신경계 및 내분비계에 의해서 조절되며 체액성 면역과 세포성 면역을 통해 외부로부터 침입하거나 또는 내부에서 생기는 비자기 (none-self)를 배제하여 항상성 (homeostasis)을 유지하려는 특성이 있다. 그러나 어떤 원인에 의해 이 체계가 비정상적으로 흐트러지면 면역부전, 면역결핍 등이 야기되는 것이다. 이와 같이 비정상적으로 흐트러진 면역체제를 바로잡아 회복시키고 손상된 면역기능을 부활시키기 위해서 일반적으로 면역기능 증강제, 면역기능 부활제 (immunopotentiators)등이 사용된다.
면역기능 증강제는 주로 선천성 및 후천성 면역결핍 증후군에 사용되는 약물로서, 특히 종양이나 후천성 면역 결핍증후군 (AIDS)에 대한 약물요법의 일환으로 절실하게 요구되고 있다. 현재 사용되고 있는 대표적인 면역기능 증강제로는 면역글로부린, 인테페론 등이 있다. 이들 중에서, 인간의 면역글로블린 (human immunoglobulin)의 하나인 IgG를 농축, 정제한 제제가 홍역, 수두, B형 간염, 유행성 이하선염 등의 예방치료에 사용되고 있으나, 주사 부위의 동통과 혈압강하로 인한 아나필락시스 (Anaphylaxis) 양성반응으로 다량 투여는 위험하다는 단점이 있다. 한편, 인터페론 (interferon, INF)은 항바이러스 인자로서 발견되었으나, 그 후에 세포증식 억제작용, 면역기능 조절작용 등이 확인되어, 항바이러스제 및 항종양제 등으로 사용되고 있으나, β형은 발열, 권태감, 식욕부진, 주사국소통 또는 탈모증 등의 부작용이 관찰되고, α형은 일시적인 골수기능 억제에 의한 백혈구 감소, GOT의 상승과 같은 부작용을 나타낸다.
또한 면역기능 부활제 (immunopotentiators)는 생체의 면역응답을 증가시켜 방사선요법 및 항종양제나 부신피질 스테로이드의 과다한 사용에 의한 속발성 면역부전상태를 개선하는 것으로, 약독화된 결핵균인 BCG (Bacillus Calmette-Gurin)의 부작용을 개선한 CWS (Cell Wall Skelton), WSA (Water Soluble Adjuvant) 등이 사용된다. 화농성 연쇄상구균 A군 3형 Su 주에서 얻은 피시바닐 (picibanil)이나 영지버섯 (Ganoderma lucidum)에서 얻은 단백다당체인 크레스틴 (crestin), 렌티누스 에도데스 (Lentinus edodes)에서 추출, 정제한 렌티난 (lentinan)등은 면역부활 기능은 인정되지만 항종양 활성이나 항 AIDS 효과는 기대하기 어려운 실정이다.
일반적으로, 면역부전시에는 감염에 대한 저항력이 저하되고, 항체생성 부전인 환자는 세균에 의한 감염을 방어할 수 없으며, 소위 면역 옵소닌 (opsonin) 효과가 감약됨으로, 호중구의 탐식작용 능력도 떨어지게 된다. 또한 이 경우에는 보체계 (complement system) 활성화 반응도 저하되기 때문에 백혈구 유주인자 등이 생성되지 않아, 염증발생율이 높아지고, 바이러스혈증이 일어나 중추신경이나 다른 곳으로 확산되기도 한다. 또한, 암환자의 경우, 화학요법이나 방사선치료과정 중에서 암세포뿐만 아니라 정상세포까지 영향을 줌으로써 환자의 면역력이 급격히 저하되는 부작용이 동반되는 것으로 알려져 있다.
T 세포계 부전시에는 수두 (varicella) 감염이 중증화되고, 유아의 종두 (vaccinia)는 범발성 종두진 등의 치명적인 부작용을 수반하게 된다. 결핵, 티프스, 칸디다증 등은 세포성 면역이 주된 방어체계이므로 T 세포계의 부전으로 중증화된다. 원발성 또는 속발성 면역부전에서는 호중구의 기능저하로 인하여 화농균에 대한 살균능력이 저하되고, 통상 화농을 일으키지 않는 녹농균이나 크렙시엘라 (klebsiella)도 화농의 원인이 되기도 한다.
체액성 면역부전은 혈청중의 면역글로블린이 결핍되어 나타난다. B 세포의 장해는 B 세포가 골수세포로부터 분화되는 과정에서 일어나거나 B 세포가 항체생성세포로 분화되는 과정에서 일어나는 것으로 생각되고 있다.
그러나 이러한 면역체계의 파괴로 인한 면역부전이나 면역결핍을 증강시키거나 회복시킬 수 있는 약제는 거의 드문 실정이다. 이에 대한 대안으로, 공개특허 10-2011-0080470 (공개일자: 2011년07월13일) (특허문헌 3)에는 홍삼 추출물 및 약초 발효물의 건강식품 조성물과 이를 포함하는 면역 증강제 또는 항산화제에 관해 기재하고 있다. 그러나, 이러한 천연 추출물의 경우, 약제로 사용하기에 충분하지 않은 면역증강 활성을 나타내는 문제점이 있었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 등록특허 제10-0623436호. 대한민국 등록특허 제10-0221762호. 대한민국 공개특허 제10-2011-0080470호.
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이에 본 발명자들은 약제로서 사용하기에 충분한 면역증강 활성을 나타내는 천연물을 밝혀내고자 노력하였다. 그 결과, 배당체 안트라퀴논 중의 하나인 에모딘 3-O-글루코시드가 면역세포, 특히 대식세포에 대하여 면역증강활성을 세포레벨(in vitro)에서 밝히고, 그에 대한 기작을 규명하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112016098482271-pat00001
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016098482271-pat00002
상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 증가시키는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 NO 합성효소(iNOS)의 발현량 및 NO(nitric Oxide)의 발생량을 증가시키는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 MAPK 신호전달경로를 조절하는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 상기 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)을 0.1~1000㎍/㎖의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 장기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병에 사용되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 증가시키고 NO 합성효소(iNOS)의 발현량 및 NO(nitric Oxide)의 발생량을 증가시키며, MAPK 신호전달경로를 조절함으로써 면역증강 활성을 갖는 에모딘 3-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 종래 합성 조성물보다 인체에 무해하며, 정상세포에는 부작용을 유발하지 않아 장기간 사용하는데 인체에 무리가 없는 조성물을 제공하는데 효과가 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 약품이나 식품, 음료 등에 산업적으로 응용될 가능성이 높다.
도 1은 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드의 구조를 나타내는 것이다.
도 2는 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드를 마우스유래 대식세포 (RAW264.7 cells)에 처리하여 배양하고, MTT assay법으로 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드의 세포독성을 확인한 그래프를 나타내는 것이다.
도 3는 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드를 마우스유래 대식세포 (RAW264.7 cells)에 농도별로 처리한 후, 배지로 분비된 TNF-α와 IL-6의 농도를 ELISA 방법으로 측정한 결과이다.
도 4는 에모딘 3-O-글루코시드를 마우스유래 대식세포 (RAW264.7 cells)에 처리한 후 RT-PCR 방법을 이용하여 iNOS의 mRNA 발현량 변화 (도 4A)와 이를 정량화한 그래프 (도 4B)를 측정한 결과이다.
도 5는 에모딘 3-O-글루코시드를 마우스유래 대식세포 (RAW264.7 cells)에 처리한 후 및 이에 따른 NO의 생성량을 측정한 결과이다.
도 6는 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드를 마우스유래 대식세포 (RAW264.7 cells)에 농도별로 처리 한 후, 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 Phospho-p38과 Phospho-JNK의 변화를 나타내는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 면역체계의 파괴로 인한 면역부전이나 면역결핍을 증강시키거나 회복시킬 수 있는 약제는 거의 드문 실정으로, 설사 면역증강 활성이 높은 합성 및/또는 천연 약제가 있다고 하더라도 부작용 등으로 인해 실제로 사용하기에는 어려운 문제들이 있다.
본 발명은 에모딘 3-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 면역세포의 염증성 사이토카인의 분비를 증가시키고, 면역반응을 매개하는 물질의 생성을 증가시키는 활성을 가지는 면역조절 또는 면역증강용 조성물을 제공하며, 종래 합성 약학적 조성물보다 인체에 무해하고 정상세포에는 부작용을 유발하지 않아 장기간 사용하는데 인체에 무리가 없는 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)를 유효성분으로 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016098482271-pat00003
상기 에모딘 3-O-글루코시드는 에모딘의 당유도체 안트라퀴논으로서, 에모딘 (Emodin; 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)은 식물유래의 천연물질로 전통 동양의학에서 오랫동안 사용되어 왔으며, 람누스 (Rhamnus, Buckthorn)속의 수많은 식물의 뿌리와 껍질에서 자연 상태에서 발견할 수 있다. 또한, 에모딘은 중국의 약초 의학요법 중에서 가장 오래되고 잘 알려진 대황 (Rheum palmatum)의 뿌리에 람노사이드 상태로 존재하고, 차풀이나 알로에의 뿌리, 잎, 껍질에서도 관찰되며, 야생버섯 (Dermocybe sanguinea)이나 다양한 곰팡이에서도 볼 수 있다. 종래, 에모딘은 천연물로부터 유래되어 인체 내에 대한 세포독성이 현저히 낮아 비만, 당뇨병 등의 대사성 질환의 개선 및 치료에 사용되어 오고 있으며, 항세균, 항비루스, 면역억제제, 간기능보호, 그리고 항염증 효과 등 다양한 생물학적 활성을 가지고 있는 저분자 천연물로 알려져 왔다. (비특허문헌 1-4) 최근에는 에모딘의 암 억제 메카니즘이 알려지면서 항암제로서의 연구 또한 활발히 진행되고 있다 (비특허문헌 5). 그러나 이때까지의 대부분의 에모딘에 대한 연구는 종양세포생물학에 집중되어왔을 뿐만 아니라, 이의 당 유도체에 대한 면역증강 효과는 아직 보고되고 있지 않다. 또한, 플라보노이드 및 안트라퀴논의 배당체가 생물학적 이용성이 더 유리함에도 불구하고, 이들 생리효능에 대한 세포 및 인체 내에서의 작용기전이나 보다 다양한 생리 기능성에 대한 연구는 우리나라 뿐만아니라 전 세계적으로도 많이 이루어지지 않고 있는 상태이다. 특히, 에모딘의 배당체인 에모딘 3-O-글루코시드에 대한 면역증강 활성에 대하여 현재까지 연구되거나 보고된 바가 없다.
따라서 본 발명자들은 에모딘에 글루코시드를 도입하여 제조된 에모딘 3-O-글루코시드의 신규한 생리활성인 면역증강 활성을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.
한편, 본 발명의 용어 "면역조절"이란, 생체가 항진한 면역응답능은 억제하고 저하한 면역응답능은 부활증강하여 정상적인 면역응답능에는 아무런 영향을 주지 않는 작용을 하는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로 유효성분인 에모딘 3-O-글루코시드는 농도 의존적으로 TNF-α 및 IL-6의 분비를 증가시켜 면역 활성을 증대시킬 수 있다. 본 발명의 실시예 2에서 나타난 바와 같이, 마우스 유래 대식세포에 에모딘 3-O-글루코시드를 처리함으로써 염증성 사이토카인의 분비량이 증가하였고, 이는 에모딘을 처리한 군과 비교하였을 때 약 1.5배 내지 3배 정도 더 증대됨을 확인할 수 있었다(실시예 2 및 도 3 참조).
또한, 본 발명의 조성물은 NO 합성효소(iNOS)의 발현량 및 NO(nitric Oxide)의 발생량을 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로 유효성분인 에모딘 3-O-글루코시드는 농도 의존적으로 NO 합성효소(iNOS)의 발현량 및 NO(nitric Oxide)의 발생량을 증가시키며, 본 발명의 실시예 3에서 나타난 바와 같이, 마우스 유래 대식세포에 에모딘 3-O-글루코시드를 처리함으로써 20μM의 농도에서 NO 합성효소(iNO)의 mRNA 발현량이 대조군과 비교하였을 때, 3.2배 증가하는 것을 확인할 수 있었다(실시예 3 및 도 4 참조). NO 합성효소(iNO)의 mRNA 발현이 증가함에 따라 NO의 발생량도 증가시켰으며, 이를 통해 본 발명의 에모딘 3-O-글루코시드가 면역증강 효과가 증대됨을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 MAPK 신호전달경로를 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로 유효성분인 에모딘 3-O-글루코시드는 농도 의존적으로 p38과 JNK의 인산화를 증가시켜 마우스 유래 대식세포의 면역증강 활성을 촉진할 수 있다. 이를 통해, 에모딘 3-O-글루코시드가 면역조절 또는 면역증강용 조성물로써 사용될 수 있음을 알 수 있다(실시예 5 및 도 6 참조).
더불어, 상기 면역조절 또는 면역증강용 약학적 조성물은 에모딘 3-O-글루코시드를 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 0.1 ~ 1000㎍/㎖ 의 농도로 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 1.0 ~ 100㎍/㎖ 의 농도를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 ~ 50㎍/㎖ 의 농도를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 에모딘 3-O-글루코시드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 크림제, 로션제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸, 비강 흡입제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
에모딘 3-O-글루코시드를 포함하는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로오즈, 수크로오즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오즈 (sucrose) 또는 락토오즈 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 에모딘 3-O-글루코시드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경 구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 설하, 골수내, 비강내, 경막내 또는 경피투여일 수 있다. 상기에서 '경피투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 에모딘 3-O-글루코시드를 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다. 상기 에모딘 3-O-글루코시드의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 건강 기능성 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 에모딘 3-O-글루코시드를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강 기능성 식품을 모두 포함한다.
이 때, 식품 또는 음료 중 에모딘 3-O-글루코시드 첨가량은, 일반적으로 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기준으로 0.02 내지 500㎍, 바람직하게는 1 내지 200㎍의 비율로 첨가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 에모딘 3-O-글루코시드를 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로오즈 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강 기능성 식품은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 건강 기능성 식품들은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1. 세포 독성 측정 ( MTT assay)
마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 cell을 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL, USA)과 1% Penicillin-Streptomycin (+5,000 Units/ml Penicillin, +5,000 μg/μl Streptomycin, Gibco-BRL, USA)을 넣은 DMEM 배양액으로 5% CO2 가 공급되는 배양기에서 37℃ 조건으로 배양하였다. RAW264.7 cell을 5×104 cells/ml로 96-well plates (SPL, Korea) 에 100 μl씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드를 각각 1, 2.5, 5, 10, 20 μM의 농도로 제조하여 RAW264.7 cell에 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충액에 녹인 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, 5 mg/ml) 용액을 20 μl씩 첨가하여 다시 4시간동안 배양시켰다. Formazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, well 바닥에 형성된 formazan을 녹이기 위해 100 μl의 DMSO를 첨가한 후, ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드 20 μM농도까지는 세포에 대한 독성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 따라서 본 실험에서는 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드을 20 μM농도까지 사용하기로 정하였다 (도 2).
실시예 2. 사이토카인 측정
RAW264.7 cell을 2×105 cells/ml로 60φ dish에 5 ml씩 첨가하여 24시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, 에모딘과 에모딘 3-O-글루코시드를 1, 2.5, 5, 10, 20 μM의 농도로 제조하여 RAW264.7 cell에 처리하였다. 24시간 배양한 후 세포배양액을 얻은 다음 배양액에 함유된 사이토카인인 TNF-α (Mouse TNF-α EIA kit, Enzo Life Sciences, USA)과 IL-6 (Mouse IL-6 EIA kit, Enzo Life Sciences, USA)를 각각의 ELISA kit 를 이용하여 측정하였다.
TNF-α의 경우, 아무것도 처리하지 않은 control (Con)에 비해 에모딘 3-O-글루코시드를 농도별로 처리했을 때의 TNF-α와 IL-6의 분비량이 농도 의존적으로 유의하게 증가하는 반면, 에모딘은 TNF-α와 IL-6의 분비량에 아무런 영향을 주지 않은 것으로 보아 에모딘 3-O-글루코시드의 면역증강 효과가 에모딘보다 상당히 크다는 것을 알 수 있었다 (도 3). 이것으로 보았을 때, 에모딘 3-O-글루코시드가 대식세포로 하여금 면역반응매개 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 분비를 증가시켜 면역증강 효과를 가져다주는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. RT- PCR 법에 의한 NO 합성효소 ( iNOS ) mRNA 발현량 측정
3-1. RAW264 .7 대식세포에서의 RNA 분리
RAW264.7 세포를 60 mm 디쉬 (dish)에 배양한 후, 에모딘 3-O-글루코시드를 농도별 (1, 2.5, 5, 10, 20 μM)로 처리하였다. 이후 인산완충식염수로 씻어낸 후 트리졸 (Trizol)을 1 ㎖씩 처리하여 세포를 잘 모아서 에펜도르프 튜브 (EP tube, eppendorf tube)에 옮겼다. 이후 RNA 추출용 (Korea, Intron biotechnology, Total RNA Extraction Kit)인 클로로포름 (chloroform)을 Trizol 1 ㎖당 200 μl씩 넣고 섞은 후 원심분리 (13,000 rpm, 10 분, 4℃)하여 제일 윗부분의 상등액에서 RNA을 회수하였다. 회수한 RNA에 바인딩 버퍼 (Binding Buffer) 400 μl씩 넣고 약 1분간 손으로 섞어주었다. 이후 RNA만 회수하기 위해 RNA 전용 컬럼 (column)과 워싱버퍼 (Wahing Buffer) 1 (700 μl) 및 2 (700 μl)를 사용해 클로로포름을 제거한 후 RNA만 남은 컬럼을 빼서 새로운 EP tube에 옮기고 일루션 버퍼 (Elution Buffer)로 RNA을 녹여 column 밑으로 빠지게 해서 RNA만 회수하였다.
3-2. RAW264 .7 대식세포에서의 cDNA 합성
상기 실시예 4-1에서 회수한 RNA를 microplate reader (Bio-Tek, USA)기로 정량하여 정량한 RNA를 준비하고, 디에틸 피로칼보네이트 워터 (DEPC water; dimethyl pyrocarbonate water)를 준비하였다. PCR 전용 튜브에 정량한 RNA와 DEPC water를 넣어준 후 역전사효소와 Oligo(dT)15를 1 μl씩 넣어주었다. 이후 PCR 기계를 이용하여 75℃에서 5분 동안 반응시키고 cDNA 합성 kit (Intronbio, Korea)를 잘 혼합하여 넣어주었다. 이후 스핀다운하여 침전시킨 후 42℃에서 1시간 반응시킨다. 이후 75℃에서 5분간 반응시켜 획득한 cDNA에 DEPC water를 50 μl씩 넣어서 합성하여 최종적으로 RT-PCR에 사용하였다.
3-3. cDNA를 이용한 RAW264 .7 대식세포의 mRNA 발현량 조사
상기 실시예 4-2에서 합성한 cDNA 1 μl, 하기 표 1에 나타낸 프라이머 2 μl를 마스터 믹스 솔루션 (Master Mix Solution; iNtRON, i-StatTaq, Korea)에 넣은 후 DEPC water 17 μl를 넣고 PCR 방법으로 증폭시켰다. 이후 PCR 반응 산물은 2% 아가로즈 겔 (agarose gel)에서 전기영동 후 브롬화에티듐 (ethidium bromide)으로 염색하여, UV 램프에서 확인하였다. 상기 PCR 이후 iNOS의 농도를 Gel Doc EZ imager (Bio-Rad, USA) 장치를 이용하여 값을 도출한 후 엑셀 파일로 옮겨 계산하여 각각 도면 4A와 도면 4B에 나타냈다.
도 4에서 확인되는 바와 같이, 에모딘 3-O-글루코시드를 1, 2.5, 5, 10, 20 μM의 농도로 처리하였을 때 iNOS의 mRNA발현량이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 에모딘 3-O-글루코시드 20 μM의 농도에서 대조군과 비교했을 때, iNOS의 mRNA발현량이 3.2배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 에모딘 3-O-글루코시드는 iNOS의 발현을 증가시켜 면역증강 효과를 가져다주는 것을 알 수 있었다. 본 실시예에서 사용된 primer의 염기서열을 하기 표 1에 나타냈다.
염기서열
센스(Sense) 안티센스 ( Antisence )
iNOS 5'-CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG-3' 5'-GGGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA-3'
β-actin 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3' 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'
실시예 4. Griess Reagent를 이용한 Nitric Oxide (NO)의 발생량 측정
RAW264.7 cell을 2×105 cells/ml로 60φ dish에 5 ml씩 첨가하여 24시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, 에모딘 3-O-글루코시드를 1, 2.5, 5, 10, 20 μM의 농도로 제조하여 RAW264.7 cell에 처리하였다. 24시간 배양한 후 세포배양액을 얻은 다음 동량의 Griess reagent (Sigma, St. Louis, MO)를 넣고 잘 섞은 후 흡광도 540 nm에서 배양액에 함유된 NO의 발생량을 측정하였다. 표준용액으로는 아질산나트륨 (Sodium nitrite, NaNO2, Sigma, St. Louis, MO)을 사용하였다.
도 5에서 확인되는 바와 같이, 에모딘 3-O-글루코시드를 1, 2.5, 5, 10, 20 μM의 농도로 처리하였을 때 NO의 발생량이 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 대조군과 비교하였을 때, 각각의 농도에서 113, 254, 538, 946 nM의 증가량을 나타내었다. 이를 통해, 본 발명의 에모딘 3-O-글루코시드는 iNOS의 발현이 증가함에 따라 NO의 발생량도 증가시켜 면역증강 효과를 가져다 주는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. MAPK ( mitogen activated protein kinases , p38과 JNK ) 신호전달경로을 통한 면역증강 기전 조사
에모딘 3-O-글루코시드의 마우스 대식세포 (RAW264.7 cells)에 대한 면역증강 기전을 조사하기 위해 MAPK 신호전달경로를 통한 면역증강 기전을 웨스턴 블럿 방법으로 조사하였다. MAPK (p38과 JNK) 신호전달경로는 세포 생존에 관여하는 대표적인 신호전달 경로로 알려져 있다. 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)를 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하고, 에모딘 3-O-글루코시드를 1, 2.5, 5, 10, 20 μM의 농도로 제조하여 세포에 24시간동안 처리하였다. 24시간 후 PBS 세척하고 1400 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 세포를 수득하였다. 각각 60 μl의 용해 버퍼를 첨가한 후에 30분 동안 얼음 상에서 반응시키고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 단백질을 수확하였다. 브래드포드 분석법을 이용하여 단백질을 정량하고 샘플 로딩 버퍼를 넣고 95℃에서 5분 동안 변성 시킨 뒤에 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 겔을 이용하여 전기영동 하였다. 니트로셀룰로즈 (Nitrocellulose; NC) 막에 전송 한 뒤 5% 탈지분유로 실온에서 1시간 동안 블로킹 (blocking) 한 후 1차 항체 (1:1000)를 5% 탈지분유에 각각의 비율로 희석한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBST (TBS, 0.1% Tween 20)로 10분마다 3번 세척하고 HRP (horeseradish peroxidase)-컨쥬게이티드 2차 항체를 5% 탈지분유에 1:2000으로 희석한 후 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 TBST로 3차례 세척한 후 ECL (Enchanced Chemiluminescence) 기질 용액을 막에 1분 동안 반응시킨 후에 X-ray 필름에 현상하였다.
그 결과, 에모딘 3-O-글루코시드를 농도별로 처리한 후, MAPK중 p38과 JNK의 인산화를 측정한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 p38 및 JNK의 인산화가 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였다 (도 6).
따라서, 에모딘 3-O-글루코시드가 마우스 대식세포에서 나타내는 면역증강 활성이 면역반응에 관여하는 MAPKs 신호전달경로를 활성화시킴으로써 일어난다는 것을 알 수 있었다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112017077238111-pat00004
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 증가시키는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 NO 합성효소(iNOS)의 발현량 및 NO(Nitric Oxide)의 발생량을 증가시키는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 MAPK 신호전달경로를 조절하는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)을 0.1~1000㎍/㎖의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 장기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병에 사용되는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 약학적 조성물.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)를 유효성분으로 포함하는 면역증강용 건강기능성 식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112017077238111-pat00005
    .
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 증가시키는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 건강기능성 식품 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 NO 합성효소(iNOS)의 발현량 및 NO(Nitric Oxide)의 발생량을 증가시키는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 건강기능성 식품 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 MAPK 신호전달경로를 조절하는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 건강기능성 식품 조성물.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 에모딘 3-O-글루코시드(Emodin 3-O-glucoside)을 0.1~1000㎍/㎖의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 건강기능성 식품 조성물.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 장기능, 위장병, 변비, 위궤양, 위염, 위암, 호흡기 감염, 피부질환, 조류독감 및 각종 암으로 이루어진 군 중 1종 이상의 질병에 사용되는 것을 특징으로 하는
    면역증강용 건강기능성 식품 조성물.

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KR20190040705A (ko) * 2017-10-11 2019-04-19 가톨릭대학교 산학협력단 알로에 에모딘-3-o-글루코사이드를 포함하는 암 개선, 예방 또는 치료용 조성물
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