KR102109145B1 - 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인이 항암제 내성 폐암 세포주인 A549/ADR의 세포사멸을 효과적으로 유도할 수 있고, 상기 유효성분은 식물 유래의 안전한 물질이므로, 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암제 내성 폐암의 치료제 또는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품의 소재로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating anti-cancer drug-resistant lung cancer comprising Pavetta indica extract, its fraction or 5,6-dehydrokawain isolated from the extract as effective component}
본 발명은 파베타 인디카(Pavetta indica) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인(5,6-Dehydrokawain)을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현대인의 주요 질환 중에서, 암의 치료방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등을 중심으로 진행되고 있다. 폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 말하며, 크게 암세포가 기관지, 세기관지, 폐포 등 폐를 구성하는 조직에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 증식하는 전이성 폐암으로 나눌 수 있다.
폐암은 현미경적으로 암세포의 크기와 형태에 따라 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC)과 소세포 폐암(small cell lung cancer: SCLC)으로 구분된다. 이렇게 비소세포 폐암과 소세포 폐암을 구분하는 것은 임상적 경과와 치료가 다르기 때문인데, 전체 폐암의 80~85%를 차지하는 비소세포 폐암은 조기에 진단할 경우 수술적 요법으로 치료할 수 있으나, 조기 발견이 어려운 폐암의 특성상 늦게 발견되어 치료가 어려운 경우가 많다. 비소세포 폐암은 40%의 선암(adenocarcinoma), 40%의 편평상피세포암(squamous cell carcinoma) 및 20%의 대세포암(large cell carcinoma)의 총 3종류의 서브 타입으로 구성된다.
일반적으로 전이가 이루어지지 않은 폐암은 외과적 수술을 통하여 제거하는 방법으로 치료를 한다. 그러나 폐암 제거 수술 후의 재발율은 20 내지 50%로 높다. 특히 비소세포성 폐암은 치료 후 재발률이 높고, 높은 발병률에 비하여 기존의 항암제를 이용한 화학적 치료에 대한 내성이 쉽게 발생하여 효과적인 치료가 어려운 것으로 알려져 있다.
항암제 내성 세포의 발생은 항암제 등을 이용한 암치료에 있어서 큰 장애가 된다. 대부분의 암세포들은 유전자 변이 억제와 관련된 기능이 이미 상실된 상태에 있으므로, 하나의 암 덩어리 안에 있는 세포들 각각도 다양한 유전자 발현패턴을 가지게 된다. 항암제를 이용한 화학적 치료시 대부분의 경우 유전적 다양성으로 인한 항암제 내성을 가진 세포가 선별적으로 살아남게 되며, 살아남은 항암제 내성 세포가 증식을 거듭하여 결국 대부분의 암 덩어리의 세포가 항암제 내성을 가지게 된다. 유전적 다양성 내지 돌연변이로 인한 항암제 내성 외에도, 환자의 부작용이 너무 심하여 충분한 양의 항암제를 투여하지 못한 경우, 경구 투여시 약물 흡수가 비정상적으로 저하된 경우, 또는 생리학적으로 혈관과 암조직 사이에 세포로 이루어진 장벽이 있어 제대로 약물이 침투하지 못한 경우 등에도 항암제 내성 현상을 보일 수 있다.
상기 비소세포성 폐암의 경우, 최근의 암 치료법의 발달에도 불구하고 10년 생존률이 10% 이하로 매우 낮다. 따라서 이러한 비소세포성 폐암에 대한 치료제 개발이 매우 중요하다.
한편, 파베타 인디카(Pavetta indica L.)는 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하는 관목성 식물로 인도차이나반도(베트남, 라오스, 캄보디아), 인도네시아, 방글라데시 및 인도 등에 분포한다. 파베타 인디카는 전통적으로 이뇨제, 염증, 류마티스, 황달, 궤양 및 치질에 사용되었으며, 이화학적 활성에 대한 연구는 항균, 항바이러스, 항말라리아 및 진통 활성에 대해 보고된 바가 있고, 본 발명자들이 파베타 인디카(Pavetta indica) 추출물을 유효성분으로 하는 미백효능에 대한 특허를 출원한 바 있으나 항암효능에 대한 보고는 전무한 실정이다.
한편, 한국등록특허 제1794080호에는 삼백초, 황금 등의 혼합 추출물을 이용한 폐암에 대한 항암제 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 파베타 인디카(Pavetta indica) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 파베타 인디카(Pavetta indica) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인이 항암제 내성 폐암 세포의 세포사멸을 촉진하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 파베타 인디카(Pavetta indica) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인(5,6-Dehydrokawain)을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 파베타 인디카(Pavetta indica) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인(5,6-Dehydrokawain)을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인은 식물 유래의 안전한 물질로, 상기 유효성분이 아드리아마이신(adriamycin) 약제 내성 폐암 세포주인 A549/ADR의 세포사멸을 효과적으로 유도하므로, 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 기능성 소재로 사용할 수 있다.
도 1은 파베타 인디카 추출물 및 이의 분획물 처리에 의한 항암제 내성 폐암 세포의 세포 생존율을 확인한 결과이다. (A)는 항암제를 처리하여 항암제 내성 폐암 세포주가 정상적으로 구축되었다는 것을 확인한 결과이고, (B)는 파베타 인디카 메탄올 추출물(ME-PI)을 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과이며, (C)는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 분획물을 항암제 내성 폐암 세포주에 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과이다. A549는 정상 폐암 세포주이고, A549/ADR은 항암제 내성 폐암 세포주이다. HF는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 헥산(n-hexane) 분획물이고, CF는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 클로로포름(chloroform) 분획물이고, EF는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획물이고, BF는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 부탄올(n-butanol) 분획물이고, WF는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 물 분획물이다.
도 2는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 클로로포름 분획물(CF-PI) 처리에 의한 A549/ADR 세포주의 세포사멸효과를 확인한 결과이다. (A)는 호크스트 33342를 처리하여 염색된 사멸체(apoptotic body)를 형광현미경으로 관찰한 결과이고, (B)는 CF-PI 처리 농도별 세포사멸 관련 단백질 발현을 확인한 결과이고, (C)는 미토콘드리아 막 전위를 JC-1을 이용하여 확인한 결과이며, (D)는 CF-PI 처리 농도별 세포 주기를 확인한 결과이다. Control은 음성대조군이다.
도 3은 파베타 인디카 메탄올 추출물의 클로로포름 분획물(CF-PI) 처리에 의한 A549/ADR 세포주의 ROS 수준을 확인한 결과이다. (A)는 FACS 캘리버 유세포 분석기를 이용하여 A549/ADR 세포 내 ROS 양을 측정한 결과이고, (B)는 A549 및 A549/ADR 세포의 GPx1 및 GPx2의 단백질 발현을 확인한 결과이며, (C)는 CF-PI 처리 농도별 A549/ADR 세포주의 GPx1 및 GPx2의 단백질 발현변화를 확인한 결과이다. Control은 음성대조군이다.
도 4는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 클로로포름 분획물(CF-PI) 처리에 의한 A549/ADR 세포주의 자식작용(autophagy)을 확인한 결과이다. (A)는 아크리딘 오렌지 염색을 통해 CF-PI 처리 농도별 A549/ADR 세포의 자식작용을 확인한 결과이고, (B)는 CF-PI 처리 농도별 A549/ADR 세포의 자식작용 관련 인자들의 단백질 발현을 확인한 결과이다. Control은 음성대조군이다.
도 5는 파베타 인디카 메탄올 추출물의 클로로포름 분획물(CF-PI) 및 자식작용 억제제인 클로로퀸(chloroquine, CQ)을 A549/ADR 세포주에 혼합처리하였을 때의 세포 생존율(A), 세포주기(B) 및 세포사멸 인자의 단백질 발현(C) 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 5,6-디하이드로카와인을 A549/ADR 세포주에 처리하였을 때 세포 생존율(A) 및 콜로니 형성 억제효과(B)를 확인한 결과이다. Control은 음성대조군이다.
본 발명은 파베타 인디카(Pavetta indica) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인(5,6-Dehydrokawain)을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 파베타 인디카는 파베타 인디카의 잎, 가지 또는 이들의 혼합물을 사용하여 추출할 수 있고, 바람직하게는 잎과 가지의 혼합물을 이용하여 추출하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 파베타 인디카는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 추출하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 메탄올을 이용하여 추출하는 것이지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들면, 상기 파베타 인디카 추출물은
1) 파베타 인디카의 잎 및 가지의 혼합물 1 중량부에 대하여 45~55 부피부의 메탄올을 첨가하고, 상온에서 5~30분 동안 초음파(sonication)를 처리하여 2~4일간 20~40회 반복하여 추출하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 추출하여 획득한 파베타 인디카 추출물을 여과 및 감압농축한 후 동결건조하는 단계;를 포함하여 제조한 것일 수 있으며,
바람직하게는,
1) 파베타 인디카의 잎 및 가지 혼합물 1 중량부에 대하여 50 부피부의 100% 메탄올을 첨가하고, 상온에서 15분 동안 초음파(sonication)를 처리하여 하루 10회 씩 총 3일간 30회 반복하여 추출하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 추출하여 획득한 파베타 인디카 추출물을 여과 및 감압농축한 후 동결건조하는 단계;를 포함하여 제조한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 파베타 인디카 분획물은 메탄올 추출물의 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트 분획물이며, 바람직하게는 헥산 또는 클로로포름 분획물이고, 가장 바람직하게는 클로로포름 분획물이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 5,6-디하이드로카와인(5,6-Dehydrokawain)은 파베타 인디카 추출물의 클로로포름 분획으로부터 분리된 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 항암제 내성은 안트라사이클린계 약물에 대한 약제 내성이며, 더욱 바람직하게는 다우노마이신, 아드리아마이신, 독소루비신 및 아클라시노마이신 A에서 선택된 하나 이상의 약물에 대한 항암제 내성이고, 가장 바람직하게는 아드리아마이신에 대한 항암제 내성인 것이지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 조성물은 암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 파베타 인디카(Pavetta indica) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 파베타 인디카 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인(5,6-Dehydrokawain)을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 또는 음료의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 파베타 인디카 추출물 및 분획물의 제조
1) 파베타 인디카 추출물의 제조
파베타 인디카(Pavetta indica)는 생명공학연구원 해외생물소재센터로부터 제공받아 본 발명에 사용하였으며, 파베타 인디카의 잎 및 가지를 혼합한 혼합물 320g에 100%(v/v) 메탄올 16ℓ를 첨가하고 상온에서 15분 동안 초음파(sonication)를 처리하여 하루 10회씩 3일간 총 30회 반복하여 추출한 후, 무형광 솜을 사용하여 여과한 다음 45℃에서 감압농축한 후, -70℃에서 건조시켜 제조하였다.
2) 파베타 인디카 분획물의 제조
상기 파베타 인디카 메탄올 추출물 33.85g을 얻어 10.58%의 수율을 확인하였으며, 이 중 30g을 이용하여 순차적으로 헥산(n-hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(n-butanol), 물로 추출하여 각 용매별 분획물을 획득하였다.
파베타 인디카 각 용매별 추출 수율은 추출 또는 분획 전 시료의 건조중량 대비 메탄올 추출물 10.58%(33.85g), 헥산 분획물 5.67%(1.7g), 클로로포름 분획물 44.57%(13.37g), 에틸아세테이트 분획물 5.2%(1.56g), 부탄올 분획물 6.43%(1.93g) 및 물 분획물 28.8%(8.64g)였다.
실시예 1. 파베타 인디카 추출물 및 이의 분획물에 의한 항암제 내성 폐암 세포의 사멸효과
파베타 인디카 추출물 및 이의 분획물에 의한 폐암 세포 및 항암제 내성 폐암 세포의 사멸효과를 확인하기 위해 A549(비소세포성 폐암 세포주)를 제주대학교 김민영 교수로부터 분양받아 사용하였으며, A549/ADR(약제내성 폐암 세포주)은 A549에 아드리아마이신을 지속적으로 처리하여 구축하였다. 각각의 세포주는 10%(w/v) FBS(fetal bovine serum), 100units/㎖의 페니실린 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신이 첨가된 F-12K 배지를 이용하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
A549 및 A549/ADR 세포주의 세포 성장율은 MTT 분석을 실시하여 측정하였다. A549 및 A549/ADR 세포주를 1㎖ 당 5×104개의 세포수가 되도록 96웰 플레이트에 분주한 후 37℃의 5% CO2 배양기에서 16시간 동안 전배양하였다. 그 후, 제조예 1의 파베타 인디카 추출물 및 추출물의 분획물을 각각의 농도별로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 MTT 용액(5㎎/㎖, Ameresco Inc.)을 4시간 동안 처리한 후 150㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 분광 광도계(Sunrise, Tecan)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 제조예 1의 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
그 결과, 인간 폐암 세포인 A549로부터 지속적인 항암제 처리에 따라 유도한 항암제 내성 폐암 세포주인 A549/ADR 세포주가 구축된 것을 확인하였고(도 1(A)), 상기 A549 및 A549/ADR 세포주에 제조예 1의 파베타 인티카 메탄올 추출물을 처리하였을 때 세포 성장 억제효과가 있음을 MTT 분석을 통해 확인하였다(도 1(B)). 또한, 제조예 1의 파베타 인티카 메탄올 추출물의 용매 분획물을 처리하였을 때, 에틸아세테이트, 헥산 및 클로로포름 분획물에서 세포 성장 억제효과가 나타났으며, 특히 클로로포름 분획물에서 가장 우수한 세포 성장 억제효과를 확인하였다(도 1(C)). 따라서 이후 실험에서는 파베타 인티카 메탄올 추출물의 클로로포름 분획물(이하 CF-PI)을 사용하여 A549/ADR에 대한 사멸효과를 분석하였다.
실시예 2. 파베타 인디카 클로로포름 분획물(CF-PI)에 의해 유도되는 세포사멸(apoptosis) 효과
CF-PI에 의한 세포사멸(apoptosis) 효과는 A549/ADR 세포주를 1㎖ 당 5×104개의 세포수가 되도록 60mm 배양접시에 분주하고, 그 후 CF-PI를 농도별로 처리하여 16시간 동안 배양한 후 10μM의 호크스트 33342(Hoechst 33342)를 처리한 다음 형광현미경(Olympus, Essex, UK)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 2(A)에 나타난 바와 같이 CF-PI 농도 의존적으로 사멸체(apoptotic body)가 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 웨스턴 블랏을 통한 단백질 발현변화를 확인하기 위해 A549/ADR 세포를 100mm 조직배양접시(tissue culture dish)에 1㎖ 당 5.0×105개의 세포수가 되도록 분주하여 16시간 동안 배양시킨 후, 각 웰에 CF-PI(10, 20 및 40㎍/㎖)를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 분해 완충용액(Lysis buffer)을 첨가하여 세포를 용해시키고, 원심분리하여 세포막 성분들을 제거한 다음, 획득된 단백질을 BSA(bovine serum albumin)로 정량하여 사용하였다. 정량 후 단백질을 SDS-PAGE(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel)를 이용하여 전기영동한 후, 항체(antibody)의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 PVDF 멤브레인(polyvinyl difluoride membrane)에 옮긴 다음 트랜스퍼(transfer)하였다. 트랜스퍼(transfer)가 끝난 후, 5%(w/v) 탈지분유(skim milk)로 16시간 동안(overnight) 반응시켜 백그라운드(background)를 제거시켰다. 그 후 멤브레인을 T-TBS로 3회 세척하고, 1차 항체를 16시간 동안(overnight) 붙인 후 다시 2차 항체를 붙이고 ECL 키트를 이용하여 엑스-레이 필름(X-ray film)에 감광시켜 밴드를 확인하였다.
그 결과, 도 2(B)에 나타난 바와 같이 CF-PI 처리에 의해 Caspase-3의 활성화(cleaved Cas3)와 PARP의 절편화(cleaved PARP) 및 항 세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)인 Bcl-2와 Bcl-xL의 감소를 확인할 수 있었다.
상기 웨스턴 블랏 결과를 바탕으로 미토콘드리아에 의해 매개되는 세포사멸을 확인하기 위해 미토콘드리아 막 전위를 측정하였다. 미토콘드리아 막 전위(Mitochondria membrane potential, ΔΨ)를 측정하기 위해 60mm 배양접시에 A549/ADR 세포를 1㎖ 당 5.0×105개의 세포수가 되도록 분주하여 16시간 동안 배양시킨 후, CF-PI를 농도별로 24시간 동안 처리하고, 그 후 PBS로 세척하고 JC-1이 혼합된 바인딩(binding) 버퍼를 이용하여 37℃ 배양기에서 15분 동안 염색시킨 다음, 염색된 세포를 FACS 캘리버 유세포 분석기(BD biosciences)를 이용하여 ΔΨ이 감소된 세포들을 측정하였다.
그 결과, 도 2(C)에 나타난 바와 같이 CF-PI 처리 농도 의존적으로 미토콘드리아 막 전위가 감소하는 것을 확인하였다.
세포주기분석(Cell cycle analysis)을 위해 60mm 배양접시에 A549/ADR 세포를 1㎖ 당 5.0×105개의 세포수가 되도록 분주하여 16시간 동안 배양시킨 후, CF-PI를 농도별로 24시간 동안 처리하고, 그 후 PBS로 세척하고, 70%(v/v) 에탄올을 이용하여 세포를 고정시킨 뒤, PI(Propidium iodide) 40㎍/㎖, RNase A 25ng/㎖이 혼합된 2mM EDTA-PBS로 20분 동안 37℃에서 염색시킨 다음, FACS 캘리버 유세포 분석기(BD biosciences)를 이용하여 세포주기를 측정하였다.
그 결과, 도 2(D)에 나타난 바와 같이 CF-PI를 10㎍/㎖로 처리하였을 때에도 G1기 정지(arrest) 유도가 일어나고, 처리 농도가 증가할수록 세포사멸 과정에 있는 세포주기인 Sub-G1기가 증가되는 것을 확인하였다.
이를 통해 CF-PI는 항암제 내성 폐암 세포의 세포사멸을 촉진시킨다는 것을 확인하였다.
실시예 3. 파베타 인디카 클로로포름 분획물(CF-PI)에 의한 GPx2 발현 감소효과
항암제 내성 세포인 A549/ADR은 A549 세포와 비교하여 활성산소(reactive oxygen species, ROS)가 낮게 유지되는 특징이 있다. CF-PI 처리 후 A549/ADR 세포 내 ROS 변화를 측정하기 위해 60mm 배양접시에 A549/ADR 세포를 1㎖ 당 5.0×105개의 세포수가 되도록 분주하여 16시간 동안 배양시킨 후, CF-PI를 농도별로 24시간 동안 처리하고, 그 후 10μM의 H2DCF-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 처리하여 15분간 37℃ 배양기에서 배양시켰다. 그 후, 염색된 세포를 모은 뒤 PBS로 세척하고 FACS 캘리버 유세포 분석기(BD biosciences)를 이용하여 세포내 ROS 양을 측정하였다.
그 결과, 도 3(A)에 나타난바와 같이 CF-PI 처리 농도 의존적으로 세포 내 ROS의 농도가 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 웨스턴 블랏을 통해 단백질 발현변화를 확인해보았을 때, 도 3(B) 및 (C)에 나타난 바와 같이 A549/ADR 세포에서 A549 세포에 비해 증가되어 있던 GPx2 단백질이 CF-PI 처리시 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, CF-PI는 GPx2의 발현 감소를 유도하여 A549/ADR 세포 내의 ROS 농도를 증가시킴으로써 세포사멸을 유도한다고 판단하였다.
실시예 4. 파베타 인디카 클로로포름 분획물(CF-PI)에 의한 자식작용(autophagy) 유도
CF-PI 처리 후 발생하는 A549/ADR 세포의 자식작용은 60mm 배양접시에 A549/ADR 세포를 1㎖ 당 5.0×104개의 세포수가 되도록 분주하고, CF-PI를 농도별로 24시간 동안 처리한 후, 10μM의 아크리딘 오렌지(Acridine Orange)를 처리한 다음 형광현미경(Olympus, Essex, UK)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 4(A)에 나타난 바와 같이 CF-PI 처리시 농도 의존적으로 AVO(acidic vesicular organelles)가 증가되어 자식작용이 강하게 유도되는 것을 확인하였고, 웨스턴 블랏을 통해 단백질 발현을 확인하였을 때, 도 4(B)에 나타낸 바와 같이 Akt/mTOR의 인산화 감소를 통한 LC3B의 증가 및 p62의 감소를 확인할 수 있었다.
한편, 자식작용 억제제인 클로로퀸(Chloroquine, CQ)을 CF-PI와 함께 처리하여 CF-PI에 의해 유도되는 자식작용을 억제하였을 경우, 세포 생존율이 더욱 감소하였으며(도 5(A)), 세포주기에서도 역시 sub-G1기의 증가를 확인하였다(도 5(B)).
이와 같은 결과로부터, CF-PI에 의해 유도된 자식작용은 세포 사멸시 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 판단하였으며, 또한, 웨스턴 블랏을 통해 CQ와 CF-PI 단독 처리와 비교하여 혼합처리하였을 때 caspase-3의 활성화와 Bax 및 PARP의 절편화가 현저하게 증가하는 것을 통해 확인하였다.
실시예 5. 파베타 인디카 클로로포름 분획물(CF-PI)의 성분분석
항암제 내성 폐암 세포에서 항암효능을 나타내는 CF-PI의 성분을 기체 크로마토그래피-질량분석법(Gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS)을 통해 분석하였다.
GC/MS 분석은 시마쯔 GC-MS(Model QP-2010, Shimadzu Co., Japan)/EI(electron impact) 모드를 사용하여 수행하였다. 이온화 전압은 70eV, 주입기의 온도 및 인터페이스의 온도는 각각 250℃ 및 280℃로 설정하였다. GC 컬럼(30m 길이, 0.25mm 내부 지름 및 0.25μM 필름 두께)으로는 Rtx-5MS를 사용하였다. 오븐 온도는 80℃에서 2분간 머문 후 150℃까지 분당 7℃씩 상승시킨 다음 1분간 머물고, 다시 220℃까지 분당 14℃씩 상승한 뒤 1분간 머물고, 다시 260℃까지 분당 4℃씩 상승한뒤 30초간 머물고, 마지막으로 310℃까지 분당 5℃씩 상승하도록 설정하였다. 운반 기체 헬륨은 57.4kPa 압력에서 분당 1㎖의 유속으로 1:10 분할 비율(split ratio)로 1㎕씩 주입하였으며, 질량(mass) 범위는 m/z 45~800amu로 설정하였다. MS 스펙트럼 데이터는 WILEY9와 NIST05 라이브러리 내에서 비교하였다.
GC/MS 분석결과는 하기 표 1과 같다. 주 화합물로는 5,6-디하이드로카와인이 66.5 면적(area)%를 나타냈으며, 그 다음으로 누트카톤(nootkatone)이 21.7 면적(area)%로 측정되었다.
Figure 112018019518041-pat00001
실시예 6. 5,6- 디하이드로카와인 (5,6- Dehydrokawain )에 의한 항암제 내성 폐암 세포의 사멸효과
CF-PI의 주 화합물인 5,6-디하이드로카와인(dehydrokawain)에 의한 A549/ADR 세포 성장 억제효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 5,6-디하이드로카와인을 100μM 처리하였을 때 59.6%의 세포 생존율을 보였으며, 콜로니 형성 억제효과를 집락형성 분석법(clonogenic assay)을 통해 확인한 결과, 12.5μM 농도에서부터 농도 의존적으로 콜로니 형성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 파베타 인디카(Pavetta indica) 잎, 가지 또는 이들의 혼합물의 메탄올 추출물 또는 이의 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 아드리아마이신에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 파베타 인디카(Pavetta indica) 잎, 가지 또는 이들의 혼합물의 메탄올 추출물 또는 이의 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 아드리아마이신에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 아드리아마이신에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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In vitro antiprotozoal, antimicrobial and antitumor activity of Pavetta crassipes K. Schum leaf extracts, Journal of Ethnopharmacology, 130(3), 529-535(2010.05.31.) 1부.*
International Journal of ChemTech Research, Volume10, Issue13, Pages145-152, 2017.12.31
Journal of Ethnopharmacology, Volume 130, Issue 3, Pages 529-535, 2010.05.31
Natural Product Research, pp.1-4, 2017.10.20
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