KR102043454B1 - 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102043454B1
KR102043454B1 KR1020180033002A KR20180033002A KR102043454B1 KR 102043454 B1 KR102043454 B1 KR 102043454B1 KR 1020180033002 A KR1020180033002 A KR 1020180033002A KR 20180033002 A KR20180033002 A KR 20180033002A KR 102043454 B1 KR102043454 B1 KR 102043454B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lung cancer
drug
composition
cancer
treatment
Prior art date
Application number
KR1020180033002A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190111199A (ko
Inventor
김소미
Original Assignee
제주대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제주대학교 산학협력단 filed Critical 제주대학교 산학협력단
Priority to KR1020180033002A priority Critical patent/KR102043454B1/ko
Publication of KR20190111199A publication Critical patent/KR20190111199A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102043454B1 publication Critical patent/KR102043454B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/548—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame having two or more sulfur atoms in the same ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 유효성분이 아드리아마이신(adriamycin) 약제 내성을 나타내는 폐암 세포주인 A549/ADR의 세포사멸을 효과적으로 유도하며, 글리오톡신에 아드리아마이신을 추가로 처리한 경우 더욱 현저한 세포사멸을 유도하므로, 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 기능성 소재로 사용할 수 있다.

Description

글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating anti-cancer drug-resistant lung cancer comprising gliotoxin as effective component}
본 발명은 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현대인의 주요 질환 중에서, 암의 치료방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등을 중심으로 진행되고 있다. 그 중 폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 말하며, 크게 암세포가 기관지, 세기관지, 폐포 등 폐를 구성하는 조직에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 증식하는 전이성 폐암으로 나눌 수 있다.
폐암은 현미경적으로 암세포의 크기와 형태에 따라 비소세포성폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC)과 소세포폐암(small cell lung cancer: SCLC)으로 구분된다. 이렇게 비소세포성폐암과 소세포폐암을 구분하는 것은 임상적 경과와 치료가 다르기 때문인데, 전체 폐암의 80~85%를 차지하는 비소세포성폐암은 조기에 진단할 경우 수술적 요법으로 치료할 수 있으나, 조기 발견이 어려운 폐암의 특성상 늦게 발견되어 치료가 어려운 경우가 많다. 비소세포성폐암은 40%의 선암(adenocarcinoma), 40%의 편평상피세포암(squamous cell carcinoma) 및 20%의 대세포암(large cell carcinoma)의 총 3종류의 서브 타입으로 구성된다.
일반적으로 전이가 이루어지지 않은 폐암은 외과적 수술을 통하여 제거하는 방법으로 치료를 한다. 그러나 폐암 제거 수술 후의 재발율은 20 내지 50%로 높다. 특히 비소세포성폐암은 치료 후 재발률이 높고, 높은 발병률에 비하여 기존의 항암제를 이용한 화학적 치료에 대한 내성이 쉽게 발생하여 효과적인 치료가 어려운 것으로 알려져 있다.
항암제 내성 세포의 발생은 항암제 등을 이용한 암치료에 있어서 큰 장애가 된다. 대부분의 암세포들은 유전자 변이 억제와 관련된 기능이 이미 상실된 상태에 있으므로, 하나의 암 덩어리 안에 있는 세포들 각각도 다양한 유전자 발현패턴을 가지게 된다. 항암제를 이용한 화학적 치료시 대부분의 경우 유전적 다양성으로 인한 항암제 내성을 가진 세포가 선별적으로 살아남게 되며, 살아남은 항암제 내성 세포가 증식을 거듭하여 결국 대부분의 암 덩어리의 세포가 항암제 내성을 가지게 된다. 유전적 다양성 내지 돌연변이로 인한 항암제 내성 외에도, 환자의 부작용이 너무 심하여 충분한 양의 항암제를 투여하지 못한 경우, 경구 투여시 약물 흡수가 비정상적으로 저하된 경우, 또는 생리학적으로 혈관과 암조직 사이에 세포로 이루어진 장벽이 있어 제대로 약물이 침투하지 못한 경우 등에도 항암제 내성 현상을 보일 수 있다.
상기 비소세포성폐암의 경우, 최근의 암 치료법의 발달에도 불구하고 10년 생존률이 10% 이하로 매우 낮다. 따라서 비소세포성폐암에 대한 효과적인 치료제 개발이 매우 중요하다.
한편, 천연 원료로부터 항암제를 개발하는 것은 암 치료법을 찾는 가장 중요한 전략 중 하나이다. 해양 생물은 광범위한 생물 다양성으로 인해 생물 활성 화합물을 위한 엄청난 라이브러리를 제공한다. 한국 해양 조류 큰열매모자반(Sargassum macrocarpum)으로부터 분리된 투베라토리드 B(tuberatolide B)가 STAT 3 신호 전달 경로를 방해함으로써 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암, 자궁경부암 세포의 증식을 억제할 수 있는 항암제로 보고되었고, 플로리다키스(Florida Keys)의 해양 시아노 박테리아에서 분리된 켐포펩틴 C(kempopeptin C)는 세린 단백질 분해효소 억제제(serin protease inhibitor)로 작용하여 침윤성 유방암의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다.
해양 유래 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 종에서 유래한 2차 대사 산물인 글리오톡신(gliotoxin, GTX)은 피페라진(piperazine) 고리를 가로지르는 이황화물다리(disulfide bridge)를 특징으로 하는 에피폴리티오디옥소피페라진(epipolythiodioxopiperazines)이다. 지금까지 GTX는 다른 세포주에서 항진균제, 항바이러스제 및 항염증제 등 여러 가지 생물학적 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 그러나 약제 내성 폐암에서 항암 화학 요법에 대한 GTX의 효과는 아직 밝혀지지 않고 있다.
한편, 한국등록특허 제1794080호에는 삼백초, 황금, 하고초, 자근, 청피 및 쇠비름 혼합물의 추출물을 이용한 폐암에 대한 항암제 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 글리오톡신이 항암제 내성 폐암 세포의 세포사멸을 촉진하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 유효성분이 아드리아마이신(adriamycin) 약제 내성을 나타내는 폐암 세포주인 A549/ADR의 세포사멸을 효과적으로 유도하고, 글리오톡신에 아드리아마이신을 추가로 처리한 경우 더욱 현저한 세포사멸을 유도하므로, 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 기능성 소재로 사용할 수 있다.
도 1은 A549 및 A549/ADR 세포의 현미경 사진(a) 및 아드리아마이신 처리에 의한 세포 생존율(b)을 확인하여 아드리아마이신 내성 폐암 세포주의 형성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 글리오톡신의 구조식(a) 및 글리오톡신 처리에 의한 A549 및 A549/ADR 세포의 세포 생존율(b)을 확인한 결과이다. *은 A549 세포 생존율에 비해 A549/ADR 세포의 세포 생존율이 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05이다.
도 3은 글리오톡신(GTX)을 처리한 A549/ADR 세포의 세포주기 분석(a) 및 A549/ADR 세포에 농도별 GTX 처리 후 유세포 분석기를 통해 annexin Ⅴ/PI 염색 정도를 분석(b)한 결과를 통해 GTX 처리에 의한 A549/ADR 세포의 세포사멸(apoptosis) 유도 효과를 확인한 것이다. *은 글리오톡신 처리 전에 비해 처리 후 값이 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05이다.
도 4는 A549/ADR 세포에 농도별 GTX 처리 후 미토콘드리아 막 전위 변화를 JC1-FITC로 염색한 결과이다. *은 글리오톡신 처리 전에 비해 처리 후 값이 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, *은 p<0.05이다.
도 5는 글리오톡신(GTX) 처리 후 A549/ADR 세포의 미토콘드리아 의존 세포사멸 관련 인자의 발현을 확인한 결과이다.
도 6은 글리오톡신(GTX)과 아드리아마이신(ADR) 혼합처리에 의한 A549/ADR 세포의 세포사멸효과를 세포 생존율(a), 세포주기 분석(b) 및 세포사멸 인자의 발현(c)을 통해 확인한 결과이다.
본 발명은 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 폐암은 비소세포성폐암(non-small cell lung cancer)인 것이 바람직하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 항암제 내성은 안트라사이클린계 약물에 대한 약제 내성이며, 더욱 바람직하게는 다우노마이신, 아드리아마이신, 독소루비신 및 아클라시노마이신 A에서 선택된 하나 이상의 약물에 대한 항암제 내성이고, 가장 바람직하게는 아드리아마이신에 대한 항암제 내성인 것이지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 약학 조성물은 글리오톡신에 안트라사이클린계 약물을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 조성물은 암의 증식을 억제하고, 세포사멸을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 또는 음료의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
재료 및 방법
1. 시약 및 화합물
DMSO(dimethyl sulfoxide), MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), 프로피디움 요오드화물(propidium iodide), 리보헥산분해효소 A(RNase A) 및 β-actin 항체는 Sigma Chemical Co.(미국)으로부터 구매하였고, 쪼개진 PARP(cleaved-PARP, c-PARP), PARP, Bax, Puma, 쪼개진 caspase-9(cleaved caspase-9, c-caspase-9), p21, p53, 인산화-p53(phosphorylated-p53) 항체는 Cell Signaling(미국)에서 구입하였다. 웨스턴 블랏을 위한 PVDF 멤브레인(polyvinylidene fluoride membrane)은 Millipore(미국)에서 구입했다. 미토콘드리아의 막 전위 검출용 JC1 키트 및 FITC Annexin V 세포사멸(apoptosis) 검출 키트는 BD Biosciences(미국)에서 구입했다.
2. 세포 배양
인간 비소세포성폐암 세포주인 A549 및 아드리아마이신 내성 비소세포성폐암 세포주인 A549/ADR은 F-12K 배지에서 배양하였다. A549/ADR은 A549에 아드리아마이신을 3개월에 걸쳐 지속적으로 처리하여 구축하였다.
세포 배양에 사용한 F-12K 배지, BSA(bovine serum albumin), 트립신/EDTA(trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid), 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 항생-항균제(antibiotic-antimycotic 100X)는 Invitrogen(미국)에서 구입하였다. 모든 세포는 90%의 군집(confluence)에 도달하면 계대하였으며, 37℃, 5% CO2의 가습 배양기에서 배양하였다.
3. MTT 분석
A549 및 A549/ADR 세포주의 세포 성장율은 MTT 분석을 실시하여 측정하였다. A549 및 A549/ADR 세포주를 1㎖ 당 5×104개의 세포 수가 되도록 96-웰 플레이트에 분주한 후 37℃의 5% CO2 배양기에서 16시간 동안 전배양하였다. 그 후, 시료를 첨가하고, 48시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 MTT 용액(5㎎/㎖, Ameresco Inc.)을 4시간 동안 처리한 후 150㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 분광 광도계(Sunrise, Tecan)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존 세포의 백분율은 하기 식 1에 기초하여 계산하였으며, 모든 결과는 3회 반복하였다.
[식 1]
세포 생존율(%)=(대조군 흡광도-처리군 흡광도/대조군 흡광도의 평균값)×100
4. 유세포 분석
세포주기는 60mm 배양접시에 A549/ADR 세포를 1㎖ 당 5.0×105개의 세포 수가 되도록 분주하여 16시간 동안 배양시킨 후, 글리오톡신을 24시간 동안 처리하고, 그 후 PBS로 세척하였으며, 70%(v/v) 에탄올을 이용하여 세포를 고정시킨 뒤, PI(Propidium iodide) 40㎍/㎖, RNase A 25ng/㎖이 혼합된 2mM EDTA-PBS로 20분 동안 37℃에서 염색시킨 다음, FACS 캘리버 유세포 분석기(BD biosciences)를 이용하여 분석하였다.
미토콘드리아 막 전위(Mitochondria membrane potential, ΔΨ m)를 측정하기 위해 60mm 배양접시에 A549/ADR 세포를 1㎖ 당 5.0×105개의 세포 수가 되도록 분주하여 16시간 동안 배양시킨 후, 글리오톡신을 24시간 동안 처리하고, 그 후 PBS로 세척하고 JC-1이 혼합된 바인딩(binding) 버퍼를 이용하여 37℃ 배양기에서 15분 동안 염색시킨 다음, 염색된 세포를 FACS 캘리버 유세포 분석기(BD biosciences)를 이용하여 측정하였다.
샘플 당 10,000개 세포의 데이터를 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(BD Biosciences)로 분석하였으며, 각 실험은 세 번 이상 반복하였다.
5. 웨스턴 블랏 ( Wstern blot )
웨스턴 블랏을 통한 단백질 발현변화를 확인하기 위해 A549/ADR 세포를 100mm 조직배양접시(tissue culture dish)에 1㎖ 당 5.0×105개의 세포 수가 되도록 분주하여 16시간 동안 배양시킨 후, 각 웰에 글리오톡신을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 분해 완충용액(lysis buffer)을 첨가하여 세포를 용해시켰고, 용해물을 원심분리하여 세포막 성분들을 제거한 다음, 획득된 단백질을 BSA(bovine serum albumin)로 정량하여 사용하였다. 정량 후 단백질을 SDS-PAGE(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel)를 이용하여 전기영동한 후, PVDF 멤브레인(polyvinyl difluoride membrane)에 옮긴 후 트랜스퍼(transfer)하였다. 트랜스퍼(transfer)가 끝난 후, 5%(w/v) 탈지분유(skim milk)로 16시간 동안(overnight) 반응시켜 백그라운드(background)를 제거시켰다. 그 후 멤브레인을 T-TBS로 3회 세척하고, 1차 항체를 16시간 동안(overnight) 붙인 후 다시 2차 항체를 붙이고 BS ECL 플러스 키트(Biosesang, 한국)를 이용하여 엑스-레이 필름(X-ray film)에 감광시켜 밴드를 확인하였다.
6. 통계 분석
집단 비교는 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences software) v.20.0을 사용하여 Student's t-검정 및 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었다. p <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1. 아드리아마이신 내성 폐암 세포주(A549/ADR)의 확립
A549에 아드리아마이신을 처리하여 구축된 A549/ADR 세포주는 A549와 비교하였을 때, 상피세포와 같은 모세포의 모양에서 타원형 모양을 획득한 것을 현미경으로 확인하였으며(도 1a), MTT 분석 결과, 아드리아마이신 0.5μM 처리농도까지는 A549/ADR의 증식을 감소시키지 않았고, 고농도의 아드리아마이신 처리시에도 A549에 비해 세포 생존율이 우수하였으므로(도 1b), 본 발명에서 구축된 A549/ADR 세포주는 아드리아마이신 내성을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 2. 글리오톡신(gliotoxin, GTX)에 의해 유도되는 세포사멸( apoptosis ) 효과
1) 세포 생존율
본 발명의 글리오톡신을 농도별로 처리하여 A549 및 A549/ADR의 세포 생존율을 MTT 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과, 글리오톡신은 A549 뿐만 아니라 항암제 내성을 가지는 A549/ADR의 세포 생존율을 효과적으로 감소시켰으며(도 2b), A549에 비해 더욱 현저한 A549/ADR 세포 생존율 감소효과를 나타냈다.
2) 세포 주기변화 확인
세포주기 중 sub-G1기는 세포가 세포사멸하고 있음을 나타낸다. A549/ADR에 GTX를 농도별로 24시간 동안 처리한 후 PI 염색으로 핵을 염색하였고, 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 세포주기를 분석하였다. 그 결과, GTX를 처리하지 않은 음성대조군의 sub-G1기가 전체 세포주기 중 1.13%를 차지하는데 반해 GTX를 0.5μM 처리하였을 경우 sub-G1기가 53.66%로 증가하는 것을 확인하였다(도 3a).
3) 세포사멸 관련 인자 변화
A549/ADR에 GTX를 농도별로 24시간 동안 처리한 후 annexin Ⅴ-FITC 및 PI 용액으로 이중 염색하여 유세포 분석을 실시하였다. 그 결과, GTX 처리전 3.73%였던 annexin Ⅴ 양성 세포의 수가 GTX를 0.5μM 처리하였을 경우 약 45%로 현저히 증진되었으며, GTX 농도 의존적으로 초기 세포사멸을 확인할 수 있는 annexin Ⅴ 양성 세포의 수가 증가하였다(도 3b).
4) 미토콘드리아 막 전위 변화
미토콘드리아 막 전위(Δψm)는 세포 상태의 중요한 지표이며, Δψm의 고갈은 초기 세포사멸이 유도되었다는 것을 의미한다. A549/ADR 세포에 GTX를 농도별로 처리하고, JC1-FITC로 염색한 결과, GTX 농도가 증가할수록 Δψm 수준이 감소하여 미토콘드리아 막의 탈분극이 증가함으로써 막 전위를 약화시켰다(도 4). 이를 통해 GTX에 의한 세포사멸은 내재 경로(intrinsic pathway)를 통해 유도되었음을 확인하였다.
5) 미토콘드리아 매개 세포사멸 인자 변화
A549/ADR에서 GTX 처리 후 총 p53, 인산화된 p53, p21, PUMA, Bax, PARP, 쪼개진 PARP(cleaved PARP, c-PARP) 및 쪼개진 caspase-9(cleaved caspase-9, c-caspase-9)의 발현을 조사하기 위해 웨스턴 블랏 분석을 실시하였고, β-액틴(β-actin)을 로딩 컨트롤로 사용하였다. GTX 처리는 p-p53과 p53의 발현을 유의하게 증가시켰고, 결과적으로 p21, PUMA 및 Bax를 포함하는 하위 단백질의 발현을 증가시켰다. 또한, 세포사멸에 중요한 표지 인자인 c-PARP와 c-caspase-9을 확인하였을 때, 농도 의존적으로 쪼개진 형태의 발현이 증가했다(도 5).
실시예 3. 글리오톡신 및 아드리아마이신 혼합물 처리에 의해 유도되는 세포사멸( apoptosis ) 효과
A549/ADR에서 GTX 및 아드리아마이신(adriamycin, ADR)을 병행 처리하였을때, 세포사멸에 대한 시너지 효과가 나타나는지 확인하기 위해 12시간 동안 GTX를 전처리한 후 48시간 동안 GTX 및 ADR을 농도별로 처리하여 배양하였고, 그 후 MTT 분석, 세포주기 분석 및 웨스턴 블랏을 실시하였다.
그 결과, GTX 및 ADR을 병행 처리하였을 경우 이들을 각각 처리한 경우에 비해 세포 생존율의 감소효과(도 6a) 및 세포주기에서 sub-G1기가 차지하는 비율이 증가하였다(도 6b). 또한, 세포사멸 관련 인자인 쪼개진 PARP(c-PARP)의 발현이 ADR을 단독으로 처리하였을 경우 음성대조군과 비슷한 수준을 유지하였으나, GTX 단독 처리시 소폭 증가하였고, GTX 및 ADR을 병행처리한 경우 현저히 증가된 발현을 유지하였다(도 6c). 이를 통해 항암제 내성 폐암 세포주는 GTX에 의해 세포사멸효과가 유도되며, GTX와 ADR을 병행처리한 경우 효과를 더욱 증진시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 안트라사이클린계 약물에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포성폐암(non-small cell lung cancer)인 것을 특징으로 하는 안트라사이클린계 약물에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 글리오톡신에 안트라사이클린계 약물을 추가로 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 안트라사이클린계 약물에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 안트라사이클린계 약물은 다우노마이신, 아드리아마이신, 독소루비신 및 아클라시노마이신 A 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 안트라사이클린계 약물에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 안트라사이클린계 약물에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 안트라사이클린계 약물에 대한 약제 내성 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
KR1020180033002A 2018-03-22 2018-03-22 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 KR102043454B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180033002A KR102043454B1 (ko) 2018-03-22 2018-03-22 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180033002A KR102043454B1 (ko) 2018-03-22 2018-03-22 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190111199A KR20190111199A (ko) 2019-10-02
KR102043454B1 true KR102043454B1 (ko) 2019-11-11

Family

ID=68422691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180033002A KR102043454B1 (ko) 2018-03-22 2018-03-22 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102043454B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230164939A (ko) 2022-05-26 2023-12-05 동의대학교 산학협력단 전호를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Alexander Arlt et al., ‘Inhibition of NF-κB sensitizes human pancreatic carcinoma cells to apoptosis induced by etoposide(VP16) or doxorubicin’, Oncogene, 2001 (20), pp.859-868.*
Marco Masi et al. Tetrahedron 2013 (69) pp.7466-7470.*
Wenshu Chen et al., ‘NF-κB, a mediator for lung carcinogenesis and a target for lung cancer prevention and therapy’, Front Biosci, 2012. 01. 01. (16), pp.1172-1185.*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230164939A (ko) 2022-05-26 2023-12-05 동의대학교 산학협력단 전호를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190111199A (ko) 2019-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101797813B1 (ko) 감귤 콤부차 발효액을 유효성분으로 포함하는 방광암 예방 또는 치료용 조성물
KR20170026115A (ko) 아리피프라졸을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR20190066637A (ko) 왕불류행 추출물을 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물
KR102043454B1 (ko) 글리오톡신을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101341195B1 (ko) 제니핀을 함유하는 유방암의 예방 또는 치료용 조성물
KR102032034B1 (ko) 패 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 조성물
KR20200023235A (ko) 강글리오사이드를 함유하는 근육 질환 예방 또는 치료용, 또는 근 기능 개선용 조성물
KR102395453B1 (ko) 홀수의 긴사슬 지방산을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 조성물
KR101392345B1 (ko) 영릉향 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학조성물
KR101552282B1 (ko) 디하이드로진저론을 함유하는 비만 치료 또는 예방용 조성물
KR101731214B1 (ko) 쿠드라트리구스잔톤 a를 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물
KR102006917B1 (ko) 리보솜 결합제제를 포함하는 ldl 콜레스테롤 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101715996B1 (ko) 톳 추출물의 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 활성 조성물
JP5985062B2 (ja) アルトカルプス・アルティリスの果実、葉、若しくは幹の抽出物、又はそれらの画分を有効成分として含有するがんの予防又は治療のための組成物
KR102450560B1 (ko) 혈갈 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈액암의 예방 또는 치료용 조성물
KR102109145B1 (ko) 파베타 인디카 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물로부터 분리한 5,6-디하이드로카와인을 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20190085459A (ko) 청각 추출물 또는 이의 분획물, 및 trail 단백질을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR20190129262A (ko) 단삼 및 도인 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR101569256B1 (ko) 메이신을 포함하는 전립선암 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR102197296B1 (ko) 세모고랭이의 추출물을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2023249075A1 (ja) 非アルコール性脂肪肝炎由来の肝細胞がんの予防又は治療剤
KR20230136105A (ko) 진세노사이드 Rh2 및 진세노사이드 Rg5를 유효성분으로 함유하는 간암 예방 및 치료용 조성물
KR102096345B1 (ko) 아출 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20230056882A (ko) 칠해목 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101926021B1 (ko) 텔렉타디엄 동나이엔스 추출물을 유효성분으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant