KR101341195B1 - 제니핀을 함유하는 유방암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

제니핀을 함유하는 유방암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암용 조성물, 보다 상세하게는 치자의 성분인 제니핀을 유효성분으로 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 유방암 증상의 예방, 치료 및 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

제니핀을 함유하는 유방암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Breast Cancer Comprising Genipin}
본 발명은 항암용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 치자의 성분 중 하나인 제니핀(genipin)을 유효성분으로 함유하는 유방암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
종양은 비정상적이고 비제어성이며 무질서한 세포증식의 산물이다. 이러한 종양이 파괴적인 성장성, 침윤성 및 전이성이 있을 때 악성종양, 즉 암으로 분류된다. 현재, 암은 주로 3가지 치료법, 즉 외과적 수술, 방사선치료 및 화학요법 중 1가지 또는 이들의 조합을 통해 치료되고 있다. 외과적 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 것을 포함한다. 이러한 외과적 수술은 특정 부위, 예컨대 유방, 결장 및 피부에 위치한 종양을 제거하는 데에는 효과적이지만, 척추와 같이 일부 구역에 있는 종양을 치료하거나 백혈병과 같은 분산성 종양 질환을 치료하는 데는 사용할 수 없다.
화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사를 붕괴시키며, 흔히 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 많이 사용되는데, 종양 질병을 치료하는데 사용되는 전신성 화학요법의 부작용은 암 치료를 받는 환자들에게 가장 문제가 된다. 이러한 부작용 중에서 멀미와 구토는 가장 일반적이며 심각한 부작용이다. 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 큰 영향을 미치며, 치료에 대한 환자의 순응성을 급격하게 변화시킬 수 있다. 또한, 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여시 주의해야 하는 주용량 제한 독성(DLT)이 있다. 예를 들어, 점막염은 여러 항암제, 예컨대 항대사물질 세포 독소제인 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트 및 항종양 항생제(예, 독소루비신) 등에 대한 주용량 제한 독성이다. 이러한 화학요법 유래의 부작용 중 대부분은 심한 경우 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위해 진통제를 필요로 하기도 한다. 또한, 종래의 항암제들은 정상세포까지 죽이는 경우가 많았기 때문에, 최근에는 정상세포에는 작용하지 않고 암세포에만 작용할 수 있는 새로운 기전의 항암제에 대한 연구가 진행되고 있다.
유방암은 미국에서는 여성암 중 1위, 우리나라에서는 3위를 차지하는 가장 보편적인 암으로 매년 약 2만 명의 여성들이 유방암에 걸리며, 환자 발생도 매년 증가하는 추세이다. 유방암의 발생 원인에는 여러 가지가 있겠지만 가장 중요하게 작용하는 것은 여성 호르몬이다. 이 외에도 유전적인 영향이 크다. 가족 중에 유방암이 있는 경우 유전자 검사를 통하여 일부 유전자의 변형이 있는 경우 그 발생률이 높은 것을 확인할 수 있다. 그 외에도 지방식이 많은 음식 등이 또 하나의 원인으로 인식되고 있다.
유방암의 치료는 조기 진단시 외과적 절제술로 치료가 가능하나 많은 환자에서 폐, 뼈, 간 등의 원격적인 전이 형태로 재발된다. 암 세포의 전이는 암 치료를 가장 어렵게 하며, 이 때 세포를 둘러싸고 있는 조직으로 침투해 들어가는 세포 침윤 과정이 필수적으로 동반되며, 이는 악성 암세포의 특징 중 하나이다(비특허문헌 1). 암세포의 침윤성에는 세포외 기질(extracellular matrix: 이하 "ECM"이라 약칭함)과 기저막(basement membrane)을 분해하는 단백질 분해 과정과 분해된 매트릭스(matrix)를 통하여 이동하는 세포 이동성(migration)이 포괄적으로 관여하고 있다. ECM을 분해하는 단백질 분해 효소 중 대표적인 것이 매트릭스 메탈로프로티에이즈 (matrix metalloproteinase: 이하 "MMP"라 약칭함)이며 이 중 특히 MMP-2와 MMP-9이 세포 침윤성에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).
한편, 제니핀은 치자나무(Gardenia jasminoides)에 존재하는 제니포사이드(geniposide)로 알려진 이리도이드 배당체(iridoid glycoside)로부터 유래되는 비당질 배당체(aglycone)의 일종으로서, 일반적으로 사용되고 있는 합성 가교제보다 독성이 낮기 때문에 우수한 천연 단백질 가교제로 많이 사용되고 있다. 또한, 제니핀은 간 질환에서는 이담작용에 도움을 주는 것으로도 알려져 있으며, 최근 연구에서는 제니핀이 항염증 및 항혈관형성 억제 역할을 가지는 것이 보고되었다(비특허문헌 3 및 비특허문헌 4). 아울러, 제니핀이 간암, 전립선암 및 자궁경부암 세포에서 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것도 보고된 바 있다(비특허문헌 5 내지 비특허문헌 7). 그러나, 제니핀이 유방암 세포의 침윤성에 관여하여 유방암의 전이를 억제함으로써 유방암의 치료에 사용될 수 있음을 보여주는 문헌은 아직까지 보고된 바가 없다.
Aznavoorian et al., Cancer, 71, 1368-1383, 1993 Ura et al., Cancer Res, 49, 4615-4621, 1989 Koo et al., Eur J Pharmacol, 495, 201-208, 2004 Nam et al., Int Immunopharmacol, 10, 493-499, 2010 Kim et al., Biochem. Pharm, 70, 1398-1407, 2005 Hong et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 362, 307-312, 2007 Cao et al., Biol. Pharm. Bull, 33, 1343-1348, 2010
본 발명은 치자의 성분 중 하나인 제니핀을 유효성분으로 함유하는 유방암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제니핀을 유효성분으로 함유하는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "침윤성"이란 주위 조직을 침습 또는 파괴하는 성질을 나타내는 것으로서, 일반적으로 조직의 경계를 이루는 기저층을 파괴시켜 종양이 국부적으로 전파되는 것을 의미하며, 종종 체내의 순환계로도 유입된다.
또한, 본 발명에 있어서, "전이"란 일반적으로 림프관 또는 혈관에 의해 원발 위치와는 다른 곳으로 종양 세포가 퍼지는 것을 의미한다. 전이는 또한 장액성 체강 또는 다른 공간을 통해 직접 신장하여 종양 세포를 이동시키는 것을 의미하기도 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 제니핀에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체로는 부형제 또는 희석제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 등의 1종 이상 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 바람직하게는 주사용으로 투여되며, 일례로 종양세포 또는 종양세포를 포함하는 개체에 1회 종양세포내 주사로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 선택적으로 종래 공지된 항암 활성을 갖는 물질 또는 아폽토시스 유도제 등을 추가 성분으로서 제한없이 포함할 수도 있다. 상기 "항암 활성을 갖는 물질"은 암세포를 직접적으로 죽이거나 암이 전이되는 것을 억제 또는 경감할 수 있는 임의의 화합물 또는 천연 추출물을 포괄하는 의미로서, 이러한 물질들은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예컨대, 상기 항암 활성을 갖는 물질로는 암세포에 특이적으로 결합하는 항체, 항암 유전자의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 핵산 분자, 바람직하게는 siRNA 분자, 또는 항암 활성을 갖는 종래 공지된 다양한 항암제 화합물, 예컨대 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 독소루비신 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, "항체"는 항원을 특이적으로 결합시키고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터의 골격 영역을 포함하는 폴리펩티드를 나타내는 것으로서, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등을 포괄하는 의미로 사용된다. 상기 "모노클로날 항체"는 단일 클론으로부터 유도된 항체를 나타내고, "키메라 항체"는 (a) 불변 영역 또는 그의 일부분이 항원 결합 영역(가변 영역)과 상이하거나 변형된 클래스, 효과기(effector) 작용기 및/또는 종의 불변 영역, 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자에 연결되도록 변형, 치환 또는 교환되거나; (b) 가변 영역 또는 그의 일부분이 상이하거나 변형된 항원 특이성을 갖는 가변 영역에 의해서 변형, 치환 또는 교환된 항체 분자를 나타낸다. 또한, "인간화 항체"는 인간에 대한 면역원성은 낮으면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 상기 인간화 항체는, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유시키고 항체의 나머지 부분들을 그들의 인간 대응물로 치환시킴으로써 수득될 수 있다.
본 발명에 있어서, "siRNA"는 간섭을 야기시킬 수 있으며, 세포, 예를 들어 인간 세포를 포함하는 포유동물 세포, 및 신체, 예를 들어 인간을 포함하는 포유동물 신체에서 특정 유전자의 전사후 무증상(post-transcriptional silencing)을 야기시킬 수 있는 작은 간섭성(small interfering) RNA를 의미한다. siRNA는 일반적으로 100개 보다 적은 염기쌍을 가지며, 예를 들어 약 30 bp 또는 그 보다 더 짧을 수 있으며, 상보적 DNA 가닥 또는 합성 방법을 사용하는 것을 포함하여 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 만들 수 있다.
본 발명에 있어서, "핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일나선 또는 이중나선 형태인 그의 폴리머를 의미한다. 이 용어에는 합성, 천연적으로 존재 및 비-천연적으로 존재하며, 참조 핵산과 유사한 결합특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지의 뉴클레오티드 상동체 또는 변형된 골격구조 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산이 포함된다.
본 발명에 있어서, "아폽토시스 유도제"는 세포 유형에 접촉하는 경우에 적어도 하나의 세포 유형에서 아폽토시스를 유도하거나 촉진시키는 화합물을 의미한다. 예시적인 아폽토시스-유도제에는 DR5 및 DR4 발현 및/또는 안정성을 증진시키는 약제, 카스파제 활성 또는 안정성을 증진시키는 약제, 및 DNA 손상반응을 유도하거나 증진시키는 약제가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물의 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 함유할 수 있다. 개별 투약량은 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 인체 투여량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 정도 등에 따라 적절히 선택되고, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 이러한 투여량은 전임상 및 임상 1상을 통하여 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물 내에 포함되는 유효성분인 제니핀의 일일 투여량은 성인에게 0.01∼500 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.1∼50 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6회 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 제니핀은 농도-의존적으로 유방암 세포의 생존율을 현저하게 억제하며, 유방암 세포의 생존율을 50% 억제하는 제니핀의 농도는 0.327 mM인 것으로 나타났다(도 1 참조).
또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 제니핀은 유방암 세포의 아폽토시스를 유도하고(도 2 참조), 특히 제니핀은 유방암 세포에서 아폽토시스 억제 유전자인 Bcl2의 발현을 억제하고 아폽토시스를 유도하는 bax 유전자의 발현을 증가시키며, pro-caspase 3의 발현을 감소시킴으로써 아폽토시스를 유도한다(도 3 참조). 또한 p38과 JNK 단백질의 활성화를 통해 아폽토시스를 유도하고 있음을 시사한다(도 4 참조).
또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 제니핀은 농도-의존적으로 유방암 세포의 침윤성과 이동성을 현저하게 저해한다(도 5 참조). 이상부터, 제니핀은 유방암 세포에서 아폽토시스 유도하고, 암전이 단계에 필수적인 과정인 세포의 이동성과 침윤성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 제니핀을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 유방암 증상의 개선용 건강식품을 제공한다.
유효성분인 제니핀은 유방암의 예방 또는 유방암 증상의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있으며, 상기 제니핀을 식품 첨가물로 사용할 경우에는 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 상기 제니핀을 원료에 대하여 30 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물에는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에도 제니핀은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에도 상기 제니핀은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지는 않지만 상기 제니핀 100 중량부 당 0.01∼0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 항암용 조성물은 유방암 세포의 침윤성을 농도 의존적으로 억제하여 유방암이 전이되는 것을 방지함으로써, 유방암의 전이를 억제하는 항암제로서 유방암 증상의 예방, 치료 및/또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 제니핀에 의한 유방암 세포의 생존 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 제니핀에 의한 유방암 세포의 아폽토시스가 일어나는지 여부를 보여주는 유세포 분석 결과이다.
도 3은 제니핀이 Bcl2, bax 및 pro-caspase3 유전자의 발현에 미치는 영향을 보여주는 면역블롯 분석 사진으로서, 농도에 의한 발현 정도(A) 및 시간에 의한 발현 정도(B)를 보여주는 것이다.
도 4는 제니핀이 p38과 JNK의 활성에 미치는 영향을 보여주는 면역블롯 분석 사진으로서, 농도에 의한 발현 정도(A) 및 시간에 의한 발현 정도(B)를 보여주는 것이다.
도 5는 제니핀에 의한 세포의 침윤성(A) 및 이동성(B) 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 제니핀에 의한 유방암 세포의 생존 억제 효과
제니핀이 유방암세포의 생존을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 농도(0, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mM)의 제니핀을 처리한 후 MTT 분석을 이용하여 세포의 생존성을 측정하였다. MTT 분석은 96-웰 플레이트에 3×104 세포/웰의 농도로 100 ㎕/웰 씩 분주한 후, 0, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mM의 제니핀과 함께 24시간 동안 배양하였다. 각각의 웰에 5 ㎎/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, Sigma, MO, USA) 용액 20 ㎕를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 항온기에서 4시간 동안 반응시켰고, 배지를 제거한 후, 100 ㎕ DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma, MO, USA)를 첨가하여 골고루 혼합하였다. ELISA 플레이트 판독기(EL800, Bio-TEK Instruments, USA)로 570 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 제니핀은 농도-의존적으로 유방암 세포의 생존율을 현저하게 억제시켰다. 유방암 세포의 생존율을 50% 억제하는 제니핀의 농도는 0.327 mM인 것으로 확인되었다(도 1).
실시예 2. 유세포 분석(Flow cytometry, FACS)
실시예 1에서 확인된 유방암 세포 생존율의 감소가 아폽토시스에 의한 것인지 여부를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 세포에 제니핀을 처리한 후 유세포 분석을 수행하였다. 이를 위하여, 6-웰 플레이트에 2.5×105 세포/웰의 농도로 세포를 분주한 후, 24시간 뒤에 200 μM의 제니핀을 처리하였고, CO2 항온기에서 37℃에서 48시간 동안 세포를 배양하였다. 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 수확한 후, 차가운 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하였고, 1× 아넥신 V 결합 버퍼에 세포를 재부유시켰다. 100 ㎕의 부유액을 5 ㎖ 배양 튜브에 옮긴 후, 5 ㎕의 아넥신 V-FITC와 5 ㎕의 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)를 첨가하였다. 세포를 잘 혼합하여 어두운 실온에서 15분 동안 방치한 후, 1× 아넥신 V 결합 버퍼 400 ㎕를 첨가하였고, 한 시간 이내에 유세포 분석을 수행하였다.
그 결과, 제니핀이 MDA-MB-231 세포의 아폽토시스를 유도한다는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3. 제니핀이 Bcl2, bax 및 pro-caspase3 유전자의 발현에 미치는 영향
제니핀이 세포의 생존을 억제하고 아폽토시스를 유도한다는 실험 결과를 바탕으로, 제니핀이 아폽토시스와 관련된 유전자의 발현에 영향을 주는지 여부를 확인하였다. 이를 위하여, 제니핀을 농도별(0, 0.05, 0.1 및 0.2 mM) 및 시간별(0, 5, 10, 30 및 60분 또는 0, 3, 5, 18 및 24시간)로 MDA-MB-231 세포에 처리하여 배양한 후, 세포에 0.25 ㎖의 용해 버퍼(50 mM Tris.Cl pH 6.8, 2% SDS, 1 mM EDTA, 100 mM DTT, 프로테아제 억제제)를 넣어 세포를 용해시켰고, Bradford 방법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 동량의 단백질을 5분 동안 95℃ 이상으로 가열한 후 5분 동안 얼음에 넣어 냉각시켰고, 12% SDS-PAGE 겔에 100 V로 전기영동하였다. 이후, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 옮겨서 5% 탈지유로 블로킹하였다. 항-인산화된(phosphorylated) p38, 항-인산화된 ERK, 항-인산화된 JNK(Cell signalling Technology, Inc, USA), 항-Bcl2, 항-bax, 항-caspase3 항체(Santa Cruz Biotech, USA) 및 항-actin 항체를 부착시켜 4℃에서 하루 동안 반응시킨 후, PBST로 세척하였다. 2차 항체를 결합시킨 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시스템(Armersham-Pharmacia Buckinghamshire, UK)을 이용하여 1분 동안 반응시켰고, X-선 필름에 노출시켜 단백질의 발현 정도를 관찰하였다.
그 결과, 제니핀을 각각 0, 0.05, 0.1 및 0.2 mM의 농도로 24시간 처리시 아폽토시스를 억제하는 유전자인 Bcl2의 발현이 농도-의존적으로 감소된 반면, 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려진 bax의 발현은 증가되는 것으로 나타났다. Pro-caspase3의 발현 또한 감소되었다(도 3의 A). 이와 유사하게, 0.2 mM의 제니핀을 다양한 시간에 처리한 경우에도 Bcl2의 발현은 감소되고, bax의 발현은 증가되는 것으로 나타났다(도 3의 B). 상기 결과는 제니핀이 MDA-MB-231 유방암 세포에서 이들 유전자의 발현을 조절함으로써 아폽토시스를 유도하고 있음을 시사한다.
실시예 4. 제니핀이 p38 과 JNK 의 활성에 미치는 영향
p38과 JNK는 많은 연구에서 아폽토시스 유도에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 제니핀에 의한 아폽토시스 유도에 어떤 신호 분자가 관여하는지를 확인하기 위하여, 제니핀을 다양한 농도(0, 0.05, 0.1 및 0.2 mM)로 처리한 후 상기 실시예 3과 동일한 방식으로 ERK, p38 및 JNK의 활성 여부를 조사하였다.
그 결과, 제니핀 처리시 p38과 JNK가 활성화되는 것이 관찰되었지만, ERK1/2의 활성에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 4의 A). 또한, 제니핀을 다양한 시간에 처리했을 때에도 p38과 JNK의 활성은 증가되었지만, ERK의 활성에는 영향을 주지 않았다(도 4의 B). 상기 결과는 제니핀이 MDA-MB-231 유방암 세포에서 p38과 JNK의 활성화를 통하여 아폽토시스를 유도하고 있음을 시사한다.
실시예 5. 제니핀에 의한 세포의 침윤성 및 이동성 억제 효과
제니핀이 MDA-MB231 유방암 세포의 침윤성 및 이동성에 영향을 주는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 농도(0, 0.05, 0.1 및 0.2 mM)의 제니핀을 세포에 17시간 동안 처리한 후 트렌스웰을 이용하여 세포의 침윤성 및 이동성을 확인하였다.
먼저, 세포의 침윤성은 6.5 ㎜ 직경에 세공의 크기가 8.0 ㎛인 폴리카보네이트 필터(Corning Costar, Cambridge, MA)가 있는 24-웰 트렌스웰를 이용하여 측정하였다. 필터의 안쪽 부분을 0.5 ㎎/㎖ 농도의 타입 I 콜라겐으로 덮고 건조시킨 후, 바깥 부분은 0.5 ㎎/㎖ 농도의 재구성된 기저막 물질(Matrigel; Collabrative Reserch, Lexington, KY)로 코팅하였고, 세포를 넣기 전에 공기 중에 건조시켰다. 0.1 ㎎/㎖ 농도의 BSA가 함유된 600 ㎕의 배지를 웰의 아랫부분을 넣고, 5×104 세포가 분산된 100 ㎕ 배지를 트렌스웰의 윗부분에 넣은 후 17시간 동안 배양시켰다. 제니핀은 트렌스웰의 바깥쪽 및 안쪽 모두에 0, 0.05, 0.1 및 0.2 mM의 농도로 처리하였다. 세포를 메탄올로 고정시킨 후, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 세포막을 염색하고, 에오신(eosin)으로 세포핵을 염색하였으며, 필터 아랫부분으로 이동한 세포수를 400 배율의 현미경으로 측정하였다. 각각의 분석을 위해 13개의 필드(field)를 사용였으며, 각각의 샘플에 대해 실험을 3회 반복 수행하였다.
다음으로, 지름이 6.5 ㎜고 세공의 크기가 8.0 ㎛인 24-웰 트랜스웰 유닛을 사용하여 이동성 연구를 시행하였다. 필터의 바깥 부분을 0.5 ㎎/㎖의 타입 I 콜라겐으로 코팅한 후 공기 중에서 1시간 동안 건조시켰다. 24-웰의 바닥에는 0.1%의 BSA를 함유한 배지를 600 ㎖ 넣고 트랜스웰의 안쪽에는 5×104 세포를 혈청이 포함되지 않은 100 ㎕의 배지(DMEM/F12, 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신)에 잘 혼합하여 넣었다. 이 후의 과정은 상기 침윤성 실험 방법과 동일하게 수행하였다.
그 결과, 제니핀은 농도-의존적으로 유방암 세포의 침윤성과 이동성을 현저하게 저해하였다(도 5). 상기 결과로부터, 제니핀은 MDA-MB-231 유방암 세포에서 아폽토시스 유도하고, 암전이 단계에 필수적인 과정인 세포의 이동성과 침윤성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
제조예 1: 제니핀을 포함하는 약학적 조성물의 제조
<1-1> 시럽제의 제조
제니핀을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 제니핀, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.
상기 시럽제의 구성 성분은 다음과 같다.
제니핀··························· 2 g
사카린·························· 0.8 g
당 ··························· 25.4 g
글리세린························· 8.0 g
향미료 ························· 0.04 g
에탄올·························· 4.0 g
소르브산························· 0.4 g
증류수·························· 정량
<1-2> 정제의 제조
유효성분 15 ㎎이 함유된 정제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
제니핀 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 상기 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
상기 정제의 구성 성분은 다음과 같다.
제니핀·························· 250 g
락토오스························ 175.9 g
감자전분························· 180 g
콜로이드성 규산······················ 32 g
10% 젤라틴 용액
감자전분························· 160 g
활석 ··························· 50 g
스테아르산 마그네슘 ···················· 5 g
<1-3> 주사액제의 제조
유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
제니핀 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성 성분은 다음과 같다.
제니핀··························· 1 g
염화나트륨························ 0.6 g
아스코르브산······················· 0.1 g
증류수 ·························· 정량
제조예 2: 제니핀을 함유하는 건강식품의 제조
<2-1> 식품의 제조
제니핀을 유효성분으로 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 조리용 양념의 제조
제니핀을 1∼10 중량%로 함유하는 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
2. 토마토 케찹 및 소스의 제조
제니핀 0.2∼1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.
3. 밀가루 식품의 제조
제니핀 0.5∼5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
제니핀 0.1∼5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
제니핀 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
6. 유제품의 제조
제니핀 5∼10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
7. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 제니핀을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),
종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),
제니핀(3 중량%),
영지(0.5 중량%),
지황(0.5 중량%)
<2-2> 음료의 제조
1. 탄산음료의 제조
제니핀 1∼5%, 설탕 5∼10%, 구연산 0.05∼0.3%, 카라멜 0.005∼0.02%, 비타민 C 0.1∼1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79∼94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85∼98℃에서 20∼180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5∼0.82%를 주입하여 제니핀을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.
2. 건강음료의 제조
액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 제니핀(1%)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
3. 야채주스의 제조
제니핀 5 g을 토마토 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
4. 과일주스의 제조
제니핀 1 g을 사과 또는 포도주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims (8)

  1. 제니핀을 유효성분으로 함유하고, 상기 제니핀은 유방암 세포의 침윤성 및 전이를 억제하고 유방암 세포의 생존을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제니핀을 유효성분으로 함유하고, 상기 제니핀은 유방암 세포의 침윤성 및 전이를 억제하고 유방암 세포의 생존을 억제하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예방 또는 유방암 증상의 개선용 건강식품.
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