KR101532307B1 - 죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물 - Google Patents
죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는, 암전이 억제용 약학 조성물 및 암전이 억제용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 죽여 추출물을 포함하는 조성물은 세포 독성이 낮고 부작용이 거의 없는 장점을 보유하면서도 전이를 억제할 수 있으므로, 전이 또는 전이 관련 질환의 치료제, 또는 전이 또는 전이 관련 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 기능성 식품 제제로 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물 및 암전이 억제용 식품 조성물에 관한 것이다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망원인이다. 특히, 인구의 고령화와 더불어 흡연 인구의 증가, 및 대기 오염으로 인해 폐암이 증가하고 있으며, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경오염물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다. 악성 종양은 대부분의 경우 하나의 장기 (폐, 간, 신장, 위, 대장, 직장 등)에서 발생한 후 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이 (metastasis)라 한다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상으로, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 전이에 필요한 새로운 유전 형질을 획득한 후 혈관과 림프선으로 침윤하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착한 후 증식하게 된다. 최근 연구 결과에서 전이와 관련된 유전 형질들이 밝혀지고 있으며, 원발 조직의 유전자 검사를 통해 차후 타장기로의 전이를 통한 재발 고위험군을 유추할 수 있게 된다. 이러한 전이 초기 단계에서 단백질분해효소인 매트릭스 메탈로프로티나아제 (MMP, matrix metalloproteinase)는 암세포가 세포외기질과 기저막을 분해하여 암세포의 침윤을 유도하고 전이하는데 중요한 역할을 하며 지금까지 20종 이상이 분리, 확인되었다. MMP는 아연을 보조효소로 사용하는 엔도프로티나아제 (endoproteinase)로, 콜라겐분해효소 (collagenase), 젤라틴분해효소 (gelatinase), 스트로멜라이신 (stromelysins), Membrane-type MMP로 나뉘어진다. 특히, 이들 MMP 중에서도 MMP-2 (72 kDa type IV collagenase; gelatinase A)와 MMP-9 (92 kDa type IV collagenase; gelatinase B)는 기저막의 중요 성분인 Type IV collagen을 분해하는 효소로, 암의 이동과 전이에 가장 직접적인 관련이 있으며 재발 및 사망률 증가와 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다 (Nabeshima, K. et al., Pathol . Int ., 52, 255-264, 2002). 또한, MMP-9의 프로모터 영역에는 전사인자인 AP-1과 NF-κB 결합 영역을 가지고 있으므로 TNF-α와 같은 싸이토카인이나 PMA (phorbol 12-mysistate 13-acetate)와 같은 암 유발 자극원이 이들 AP-1과 NF-κB 등의 전사인자의 활성을 유도하여 MMP-9의 발현 및 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Sato H., et al., Oncogene, 19, pp2904-2912, 2000; Lee S. O., et al., Biochem Biophys Res Commun, 354, pp165-171, 2007). 악성 종양의 전이에 대한 치료는 국소 치료와 전신 치료로 나누어 볼 수 있는데, 악성 종양의 전이에 대한 치료의 원칙은 종양의 종류와 종양의 전이 부위에 따라 다르다. 전이에 의한 국소 증상이 심하거나, 전이에 대한 수술적 치료가 악성 종양의 자연 경과를 호전시킬 수 있다고 알려진 일부 악성 종양의 경우 전이에 대해 치료수술 혹은 방사선치료와 같은 국소 치료 방침을 고려할 수 있다. 일반적으로는 악성 종양에서 전이가 일어난 경우 국소적인 치료보다는 항암 화학 요법과 같은 전신적인 치료를 통하여 전이 부위뿐 아니라 원발 부위의 종양을 함께 치료하는 것이 도움이 된다. 하지만 림프종과 같은 극소수의 종양을 제외하고는 전이가 발생한 악성 종양의 경우 완치의 가능성은 대단히 낮다. 전이가 발생한 악성 종양에 대한 경과는 다양하며, 원발성 악성 종양의 종류와 전반적인 종양의 진행 속도에 따라 경과가 결정된다. 어떤 장기에 전이가 되었느냐에 따라 합병증은 다양하게 발생할 수 있다. 예를 들어, 뇌 전이의 경우 두통, 시야감소, 구역, 구토 등의 증상이 발생할 수 있다. 골 전이의 경우 골의 통증이 발생할 수 있으며, 병적 골절이 발생할 수도 있다. 골 전이에 동반하여 고칼슘 혈증으로 의식 혼탁이 발생할 수도 있다. 따라서 검진을 통한 종양의 조기 발견 및 원발 종양의 유전자 검사는 전이로 인한 사망률 증가를 예방할 수 있는 방법이다. 한편, 일부 종양에서 수술적인 치료 후 보조 항암 화학요법 및 방사선 치료를 이용하여 재발 및 전이를 예방할 수 있다고 알려져 있으나 이러한 치료법은 정상세포들에게도 영향을 주어 심각한 부작용을 초래하는 문제가 있다. 따라서 보다 안전하고, 치료 효과가 높은 대체적인 암치료 방법이 요구되고 있으며, 이에 최근에는 안정성이 보장된 식물, 미생물 유래 등 천연자원을 이용한 기능성 식품 및 의약품 연구에 관심이 집중되고 있다.
현재까지 암치료를 위해 개발된 약제들은 전신치료용 주사제나 경구투여제로서 혈류를 따라 전신에 비특이적으로 작용하여 암세포에 대한 특이성이 낮으며, 약제 투여에 따른 전신적인 부작용이 많아 수술이나 방사선 치료에 비해 부작용이 많이 나타나는 단점이 있다. 암세포를 직접 공격하여 효과를 보는 기존의 화학적 치료법 역시 부작용이 매우 강하고, 폐와 같은 장기로의 전이 등을 막을 수 있는 획기적인 신약은 아직 개발되지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 인체에 부작용을 일으키지 않으면서 전이를 예방하거나 치료할 수 있는 천연 추출물을 찾고자 예의 노력한 결과, 대나무로부터 분리한 죽여 추출물이 독성이 없는 범위 내에서 전이를 억제하는 효과가 있다는 것을 보여줌으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 죽여 추출물을 개체에 투여하여 암전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 죽여 추출물을 포함하는 전이의 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, “죽여 (bambusae caulis in taeniam, 竹茹)”는 대나무의 껍질을 제거한 후 죽간층의 섬유질을 말하며, 소나 말의 여물처럼 가는 실과 같은 형태로 잘라진 속껍질이다. 생김새는 엷은 막 조각이나 띠 모양 또는 불규칙한 실 모양으로 너비와 두께가 고르지 않으며 바깥 면은 엷은 녹색이고 가루로 된 것도 있다. 질은 가볍고 부드럽고 탄력성이 있으며 섬유성이어서 쉽게 부스러지지 않는다. 다른 이름으로 청죽여, 죽피, 담죽피여 라고도 한다.
죽여는 폐열로 인한 해수와 가래가 황색이며 끈끈한 것을 치료하며, 담열로 담과 위의 기능이 화합되지 못하여 부조화로 가슴이 답답하고 가래가 많으며 잠을 못 자고 구토를 일으킬 때에 쓰이고, 위열과 위허로 인한 구토, 딸꾹질, 임신구토에도 효과적이고 긴요한 약물이다. 태아를 편안하게 하는 효능이 있으며, 약리작용으로 백색포도상규균, 고초열균, 대장균, 티푸스균 등에 강력한 억제작용을 나타낸다. 죽여는 신경성 구토, 폐결핵의 식은 땀을 그치게 하며, 급성 이질, 안면 신경염, 소아기관지염, 야제 (어린아이가 밤이 되면 불안해하고 발작적으로 우는 증상), 구강염 등에 유효한 효과를 보인다.
식물은 추출 부위에 따라서 각 추출물 또는 이의 분획물의 활성 여부, 활성의 정도, 및 이에 포함되는 구체적인 성분이 상이할 수 있다.
본 발명은 대나무의 겉껍질을 벗긴 후의 섬유질인 죽여 추출물의 전이의 예방 또는 치료 용도를 처음으로 밝힌 것이다. 본 발명의 죽여 추출물은 전이 억제 효과가 우수하다.
본 발명에서 죽여는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 죽여 추출물은 대나무의 겉껍질을 제거한 후 안쪽의 섬유질 분쇄물을 증류수 (D.W.), 또는 탄소수 1 내지 6의 알코올로 추출하여 수득할 수 있다.
죽여 추출물을 제조하는 방법은 열수 추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 대나무의 겉껍질을 제거한 후 안쪽의 섬유질을 세척 및 건조로 이물질을 제거하고, 죽여를 분쇄하여 얻은 건조물을 물, 증류수 (D.W.), C1 ~ C6의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있으며, 보다 바람직하게는 C1 ~ C4의 알코올 또는 증류수 (D.W.)로 추출할 수 있고, 가장 바람직하게는 증류수 (D.W.)로 추출할 수 있다. 이때, 추출용매는 죽여 건조중량의 2 ~ 20 배로 하는 것이 바람직하다. 일례로 죽여를 분말로 파쇄하여 혼합한 후 추출용기에 넣고 증류수, 또는 C1 ~ C4의 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 증류수 (D.W.)를 넣고 38 ~ 120 ℃ 에서 추출하여 증류수 (D.W.) 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 추출 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다.
본 발명에서, “암전이”란 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 말한다. 하나의 장기에서 시작한 악성 종양이 진행함에 따라 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이라 할 수 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이라고 할 수 있는데, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어날 수 있다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 림프선으로 침입하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어날 수 있다.
전이가 발생하는 조직에 따라, 간암, 신장암, 폐암, 위암, 대장암, 직장암, 췌장암 등 각종 암질환이 유발될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전이를 억제하여 암이 퍼지는 것을 예방 및 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 전이로부터 파생되는 암 관련 질환을 개선, 예방, 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "억제"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 발병을 억제시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 항전이 효과를 가진다고 알려진 약학 조성물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가하여, 약제학적 단위 투여형으로 제형화할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물에서 죽여 추출물은 약제학적으로 유효한 양으로 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 죽여 추출물은 조성물에 0.001 내지 50중량%로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게 0.001 내지 20중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 죽여 추출물을 준비하고, 악성종양의 특징인 부착-의존적 및 부착-비의존적 성장에 의한 콜로니 (colony) 형성을 분석한 결과, 독성이 없는 농도의 죽여 추출물을 처리한 실험군의 경우 대조군과 비교하여 HT1080 세포의 부착-의존적 및 부착-비의존적인 성장이 모두 억제되는 효과가 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 죽여 추출물을 처리한 군의 경우, 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 암세포 이동능력이 억제되어 죽여 추출물이 항전이 효과가 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 시험관 내 트랜스웰 세포이동 및 세포침윤능 분석에서, 세포이동과 세포침윤 활성이 죽여 추출물-처리된 세포에서 상당히 유의미하게 감소하였으며, 따라서 죽여 추출물이 세포의 이동 및 침윤 억제를 통해 항전이 효과가 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 HT1080세포를 죽여 추출물로 미리 처리한 경우 피브로넥틴 (FN)과 콜라겐에 대한 부착능이 용량-의존적 방법으로 감소되었고, 세포외 기질 (ECM)을 죽여 추출물로 미리 처리한 경우는 세포의 부착 능력에 영향을 주지 않았다. 이는 죽여 추출물이 종양 주변 조직에 영향을 주지 않고 암세포에 직접 작용하여 부착능을 억제하는 것임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 세포외 기질 (ECM)을 분해함으로써 암 전이에서 필수적인 역할을 하는 것으로 알려진 MMP-9의 발현 및 활성에 대한 죽여 추출물의 효능에 관한 것으로, 죽여 추출물을 처리함으로써 PMA 자극에 의한 MMP-9의 활성과 발현 증가가 극적으로 감소됨을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 죽여 추출물-처리된 세포에서, PMA 자극에 의한 IκB 인산화 및 분해가 대조군에 비해 억제되었으며 그 결과 p65 단백질의 핵 내 위치이동 역시 유의미하게 억제되었다. 또한, 죽여 추출물이 PMA 자극으로 유도되는 p38과 ERK1/2 인산화를 유의미하게 억제함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 죽여 추출물이 PMA 자극으로 유도된 ROS 생산을 억제하며, 이어지는 NF-κB 활성과 MMP-9 활성을 억제함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 죽여 추출물을 C57BL/6J 마우스에 경구 투여함으로써 혈관을 통해 주입된 B16F10 세포의 생체 내 폐 전이성 콜로니 증식을 유의미하게 감소시켜 생체 내 폐 전이를 현저하게 억제하였음을 확인하였다. 특히, 죽여 추출물을 실험기간동안 투여한 주입군은 대조군과 비교하여 GOT/GPT 및 BUN/CRE 비율, 적혈구의 숫자 및 헤모글로빈의 수준이 유의미하게 변하지 않았고, 백혈구의 숫자, 다른 매개 변수가 모두 정상적인 범위 내에 있으므로 죽여 추출물 경구 투여가 생체 내에 부작용이 없음을 확인하였다.
이와 같이, 죽여 추출물은 부작용 없이 암전이 억제 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 예방과 치료 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
다른 양태로서, 본 발명은 죽여 추출물을 포함하는 약학 조성물을 암전이 억제 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체에 투여하여 암전이를 억제하거나 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환은 간암, 폐암, 위암, 대장암, 직장암 등의 각종 암 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체는 암전이 억제 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체로서, 인간뿐만 아니라 암전이 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환 및 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 암전이 억제 또는 전이로부터 파생한 암 관련 질환의 치료방법은 죽여 추출물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 식품 조성물을 제공한다.
상기 죽여 추출물에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 식품 조성물은 전이, 또는 상기 설명한 전이 관련 질환의 발생 억제에 도움을 주는 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 전이 억제용 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 죽여 추출물 이외에도 항전이 활성에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명에서 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 죽여 추출물은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 바람직하게는 5 ~ 10중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 물, 증류수, C1 ~ C6의 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 죽여를 추출하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 단계에서 얻은 추출물을 여과, 및 농축하는 단계를 포함하는, 죽여 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 죽여의 추출용매로 증류수를 이용하여 죽여 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명의 죽여 추출물을 포함하는 항전이 효능을 가지는 약학 조성물은 세포 독성이 낮고 부작용이 없는 장점을 보유하면서도, 암전이를 억제할 수 있으므로, 암전이 억제제, 또는 암전이 억제용 기능성 식품으로 유용히 사용할 수 있다.
도 1a는 MTT 분석 (assay)을 통해 세포 생존율 평가 결과를 보여주는 그래프이다.
도 1b는 LDH 방출 분석 (LDH release assay)을 통해 세포 독성 결과를 보여주는 그래프이다.
도 1c 및 도 1d는 HT1080 세포를 낮은 밀도로 분주한 후 죽여 추출물을 독성이 없는 50 - 250 ㎍/㎖ 농도로 처리하면서 부착-의존적 콜로니 형성이 억제됨을 보여주는 도면이다.
도 1e 및 도 1f는 독성이 없는 50 - 250 ㎍/㎖의 죽여 추출물 처리 농도에서, 미처리 대조군 세포와 비교하여 부착-비의존적 성장 (반고형 배지에서 콜로니를 형성하는 세포의 능력)을 약 40 - 97% 정도 유의미하게 억제함을 보여주는 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 시험관 내 죽여 추출물의 항-전이 효능 검사의 하나로, 세포 운동성을 관찰하기 위한 상처 치유 분석 (wound healing assays) 결과를 보여주는 도면이다.
도 2c 및 도 2d는 죽여 추출물의 농도에 따른 트랜스웰 세포이동 및 세포 침윤 활성 분석 결과를 보여주는 도면으로서, 50 - 250 ㎍/㎖의 죽여 추출물의 처리는 미처리된 대조군 세포와 비교하여 대략 30 - 50% 정도 세포이동 및 세포 침윤 활성을 용량-의존적으로 억제하였다.
도 2e 및 도 2f는 피브로넥틴 (FN)과 I형 콜라겐에 대한 HT1080 세포의 부착능력에 대한 죽여 추출물의 효과를 보여주는 도면으로서, HT1080 세포를 죽여 추출물로 미리 처리한 경우 피브로넥틴 (FN)과 콜라겐에 대한 부착능이 용량-의존적 방법으로 감소되었다.
도 3a는 죽여 추출물이 MMP-9 활성을 조절할 수 있는 지 여부를 젤라틴 자이모그래피에 의해 검사한 결과를 보여주는 도면이다.
도 3b는 죽여 추출물이 MMP-9 발현을 조절할 수 있는 지 여부를 웨스턴 블럿팅으로 검사한 결과로서, 50 - 250 ㎍/㎖의 죽여 추출물 처리는 PMA 자극에 의한 MMP-9 활성과 발현의 증가를 용량-의존적인 방법으로 극적으로 감소시켰다.
도 4a는 PMA 자극에 의한 IκBα 인산화의 증가 및 IκBα 분해 증가가 대조군과 비교하여 죽여 추출물-처리된 HT1080 세포에서 현저하게 낮음을 보여주는 도면이다.
도 4b는 죽여 추출물-처리된 세포에서, PMA 자극에 의한 p65 단백질의 핵 내 위치이동이 대조군과 비교하여 유의미하게 억제됨을 보여주는 도면이다.
도 5는 죽여 추출물이 PMA 자극에 의한 ERK1/2의 인산화를 유의미하게 억제함을 보여주는 도면이다.
도 6a 내지 도 6d는 HT1080 세포에서 PMA 자극에 의한 ROS 생산 증가에 대한 죽여 추출물의 효과를 보여주는 도면으로서, 죽여 추출물은 PMA 자극에 의한 세포 내 ROS 생산을 ~70% 까지 감소시켰고, ROS 생산 억제를 통해 NF-κB 활성 및 MMP-9 활성을 억제함을 확인하였다.
도 7a 내지 도 7c는 죽여 추출물을 투여한 경우 식염수를 투여한 대조군과 비교하여 폐로 전이된 암세포 콜로니가 유의미하게 감소됨을 보여주는 도면이다.
도 1b는 LDH 방출 분석 (LDH release assay)을 통해 세포 독성 결과를 보여주는 그래프이다.
도 1c 및 도 1d는 HT1080 세포를 낮은 밀도로 분주한 후 죽여 추출물을 독성이 없는 50 - 250 ㎍/㎖ 농도로 처리하면서 부착-의존적 콜로니 형성이 억제됨을 보여주는 도면이다.
도 1e 및 도 1f는 독성이 없는 50 - 250 ㎍/㎖의 죽여 추출물 처리 농도에서, 미처리 대조군 세포와 비교하여 부착-비의존적 성장 (반고형 배지에서 콜로니를 형성하는 세포의 능력)을 약 40 - 97% 정도 유의미하게 억제함을 보여주는 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 시험관 내 죽여 추출물의 항-전이 효능 검사의 하나로, 세포 운동성을 관찰하기 위한 상처 치유 분석 (wound healing assays) 결과를 보여주는 도면이다.
도 2c 및 도 2d는 죽여 추출물의 농도에 따른 트랜스웰 세포이동 및 세포 침윤 활성 분석 결과를 보여주는 도면으로서, 50 - 250 ㎍/㎖의 죽여 추출물의 처리는 미처리된 대조군 세포와 비교하여 대략 30 - 50% 정도 세포이동 및 세포 침윤 활성을 용량-의존적으로 억제하였다.
도 2e 및 도 2f는 피브로넥틴 (FN)과 I형 콜라겐에 대한 HT1080 세포의 부착능력에 대한 죽여 추출물의 효과를 보여주는 도면으로서, HT1080 세포를 죽여 추출물로 미리 처리한 경우 피브로넥틴 (FN)과 콜라겐에 대한 부착능이 용량-의존적 방법으로 감소되었다.
도 3a는 죽여 추출물이 MMP-9 활성을 조절할 수 있는 지 여부를 젤라틴 자이모그래피에 의해 검사한 결과를 보여주는 도면이다.
도 3b는 죽여 추출물이 MMP-9 발현을 조절할 수 있는 지 여부를 웨스턴 블럿팅으로 검사한 결과로서, 50 - 250 ㎍/㎖의 죽여 추출물 처리는 PMA 자극에 의한 MMP-9 활성과 발현의 증가를 용량-의존적인 방법으로 극적으로 감소시켰다.
도 4a는 PMA 자극에 의한 IκBα 인산화의 증가 및 IκBα 분해 증가가 대조군과 비교하여 죽여 추출물-처리된 HT1080 세포에서 현저하게 낮음을 보여주는 도면이다.
도 4b는 죽여 추출물-처리된 세포에서, PMA 자극에 의한 p65 단백질의 핵 내 위치이동이 대조군과 비교하여 유의미하게 억제됨을 보여주는 도면이다.
도 5는 죽여 추출물이 PMA 자극에 의한 ERK1/2의 인산화를 유의미하게 억제함을 보여주는 도면이다.
도 6a 내지 도 6d는 HT1080 세포에서 PMA 자극에 의한 ROS 생산 증가에 대한 죽여 추출물의 효과를 보여주는 도면으로서, 죽여 추출물은 PMA 자극에 의한 세포 내 ROS 생산을 ~70% 까지 감소시켰고, ROS 생산 억제를 통해 NF-κB 활성 및 MMP-9 활성을 억제함을 확인하였다.
도 7a 내지 도 7c는 죽여 추출물을 투여한 경우 식염수를 투여한 대조군과 비교하여 폐로 전이된 암세포 콜로니가 유의미하게 감소됨을 보여주는 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1> 죽여 추출물 (
AE
-
BCT
)의 제조
상업적으로 제공되는 건조된 죽여 (bambusae caulis in taeniam extract, BCT)를 영천 한약재 시장 (영천, 대한민국)에서 구입하였으며, 죽여 추출물 (aqueous extract of bambusae caulis in taeniam, AE-BCT)을 준비하기 위하여, 죽여의 건조된 부분 (50.0g)을 1 L의 증류수에 놓고, 추출기 (코스모스-600 추출기, 경서기계산업, 인천, 대한민국)에서 115 ℃로 3시간 동안 열수 추출하였다.
죽여 추출물을 표준 시험 시브(체) (150 ㎛, Retsch, Han, 독일)를 이용하여 필터하였고, 동결 건조기 (lyophilizer)에서 건조할 때까지 농축하였다. 동결건조한 죽여 추출물 분말 (50 ㎎)을 1 ㎖의 증류수에 녹였으며, 0.22 ㎛의 디스크 필터 (disk filter)를 통해 필터하였고, 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.
< 실시예 2> 세포 독성 분석: MTT 및 LDH 방출 분석
HT1080 세포 독성을 평가하기 위하여, MTT 및 LDH 방출 분석 (MTT and LDH release assay)을 이용하였으며, HT1080 세포 (5x103 개의 세포/웰/96-웰 플레이트)를 10과 250 ㎍/㎖의 사이의 농도의 죽여 추출물로 인큐베이션 하였다. 48시간 처리 후, 세포를 10 ㎕의 MTT 용액 (PBS에서 5 ㎎/㎖)으로 4시간 더 추가적으로 인큐베이션 하였다. 포르마잔 (formazan) 침전물을 디메틸 설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO)로 녹인 후, 흡광도를 Infinite R M200 마이크로플레이트 리더 (TECAN Group Ltd, 스위스)로 570 ㎚에서 측정하였다. 죽여 추출물-처리 세포로부터 배양 상층액으로의 LDH 방출을 제조회사의 안내 설명서에 따라 상업적인 세포 독성 검출 키트로 결정하였다.
도 1a 및 1b에 나타난 대로 무처리 대조군 세포와 비교하여 25 ~ 250 ㎍/㎖의 농도의 죽여 추출물로 처리한 경우에 세포 생존율, LDH 방출에 영향을 주지 않아 독성이 없는 것으로 확인하였다. 따라서, 본 발명에서는 25 - 250 ㎍/㎖ 농도 범위의 죽여 추출물을 그 후의 실험에서 이용하였다.
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실시예
3> 부착-의존적 및 부착-
비의존적
콜로니
형성 분석
<3-1> 부착-의존적 콜로니 형성 분석
HT1080 세포가 부착 가능하도록 하기 위하여, 1㎖의 10% FBS/DMEM 내에 있는 200개의 HT1080 세포를 12웰 배양 플레이트에 분주하였다 (seeded). 죽여 추출물을 50-250 ㎍/㎖로 처리한 후, 세포를 7~10일 동안 인큐베이션 하였고, 생성된 콜로니를 0.2% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)/20% 메탄올 (w/v) 용액으로 염색하였다.
<3-2> 부착-비의존적인 콜로니 형성 분석
부착-비의존적인 세포 성장을 확인하기 위하여, 세포 (5 x 104개)를 특정 농도의 죽여 추출물, 0.3% 한천, 및 10% FBS가 포함된 2 ㎖의 배지에 현탁시켰으며, 이를 0.6% 한천과 10% FBS가 포함된 응고된 바닥 한천에 적용한 후, 2주의 인큐베이션 동안, 위상차 현미경으로 부드러운 한천 내에 형성된 콜로니를 관찰하여 사진을 찍었다.
<3-3> 독성이 없는 농도에서 죽여 추출물 (AE-BCT)은 HT1080 세포의 부착-의존적 및 부착-비의존적인 성장을 모두 억제함
세포를 낮은 밀도에서 분주한 후 죽여 추출물이 비-세포독성 농도에서 HT1080 세포의 부착-의존적인 콜로니 형성에 영향을 줄 수 있는 지 여부를 조사하였다. 죽여 추출물을 처리하지 않은 대조군 HT1080 세포는 빠른 증식을 보여 주었고, 단일 세포로부터 상당한 크기의 콜로니들을 형성하였다. 반면, 인큐베이션 동안 죽여 추출물을 처리한 경우 농도 의존적인 방법으로 콜로니 형성 활성을 억제하였고, 큰 크기의 콜로니가 현저히 적었고, 콜로니의 숫자도 감소하여 부착 의존적 성장을 억제하였다 (도 1c, 도 1d). 또한 죽여 추출물은, 50 - 250 ㎍/㎖의 농도에서, 미처리 대조군 세포와 비교하여 부착-비의존적 성장 (반고형 배지에서 콜로니를 형성하는 세포의 능력)을 약 40 - 97% 정도 유의미하게 억제하였다 (도 1e, 도 1f).
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실시예
4> 세포 이동 능력 분석
세포 운동성을 감시하기 위하여 상처 치유 분석 (wound healing assays)을 수행하였다. 약 80% 정도 단일층으로 증식된 세포에 25 ㎍/㎖의 미토마이신 C (mitomycin C) (Sigma chemical Co.)로 30분 동안 처리하여 세포 증식을 정지시킨 후, 단일층에 약 2 ㎜ 정도 넓이의 손상 (wound)을 만들었다. 떨어진 세포 부유물을 완전히 제거한 후에, 죽여 추출물이 포함된 배양 배지를 채워 준 후 일정 시간동안 손상 부위에서 세포 이동 능력을 위상차 현미경을 통해 관찰하였다.
도 2a, 도 2b에 보여 준 것처럼, 미처리 대조군 HT1080 세포는 36시간 동안 대략 50%의 손상 부위 치유로 이어졌다. 죽여 추출물을 처리한 실험군은 대조군 세포와 비교하여 대략 60 ~ 90% 농도 의존적으로 손상 부위로의 이동이 억제되었다.
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실시예
5> 시험관 내 세포 이동 및
침윤능
분석
8 ㎛의 구멍 (pore) 크기의 폴리카보네이트 (polycarbonate) 막 (Corning costar, Cambridge, MA)을 가진 10 ㎜ 직경의 트랜스웰 챔버 (transwell chamber)를 이용하여, 세포 이동 및 침윤능 분석 (migration and invasion assays)을 수행하였다. 간단히 말하면, 600 ㎕의 10% FBS/DMEM으로 아래쪽 챔버 (lower chamber)를 채웠으며, 혈청이 없는 DMEM 100 ㎕에 죽여 추출물 및 세포 (1 x 105 개/100 ㎕)를 넣고 각 위쪽 챔버 (upper chamber)에 넣은 후 37 ℃에서 인큐베이션 하였다. 이동하지 않은 필터의 위쪽 표면에 남아있는 세포를 제거하고, 필터를 0.2% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)/20% 메탄올 (w/v) 용액으로 염색하였다. 침윤능 분석은 20 ㎕의 마트리젤:DMEM의 1:2 혼합물 (마트리젤, BD Biosciences, Bedford, MA, 미국)로 트랜스웰 챔버를 코팅하여 중간 침윤 장벽 (intervening invasive barrier)을 형성한 후 수행하였다.
트랜스웰 세포 이동 및 침윤능 분석에서, 혈청-유도된 세포 이동 활성은 대조군 세포와 비교하여 죽여-처리된 추출물에서 유의미하게 감소하였다. 침윤 활성 (마트리젤 경계를 침투하는 능력) 역시 죽여 추출물-처리된 세포에서 상당히 감소하였다. 50 - 250 ㎍/㎖의 죽여 추출물의 처리는 미처리된 대조군 세포와 비교하여 대략 30 - 50% 정도 세포 이동 및 침윤 활성을 용량-의존적으로 억제하였다 (도 2c, 도 2d).
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실시예
6>
고정시킨
피브로넥틴
(
fibronectin
,
FN
)과 콜라겐 (
collagen
)에 대한 세포-부착능력 분석
세포외기질 (ECM)에 대한 세포의 부착은 종양 침입에서 기초적인 단계로 믿어지기 때문에, 본 발명에서는 피브로넥틴 (FN)과 I형 콜라겐에 대한 HT1080의 부착능 및 이에 대한 죽여 추출물의 효과를 검사하였다.
96-웰 배양 플레이트에서 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)에 대한 세포의 부착능에 대한 분석을 수행하였다. 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 (FN, Sigma) 또는 0.3% I형 콜라겐 용액 (Cell matrix type I-A; Nittazerachin Co., Osaka, 일본) 50 ㎕를 실온에서 밤새 코팅하였다. 차가운 PBS로 2번 세척하였으며, 3%의 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 0.2 ㎖의 DMEM으로 37 ℃에서 1 시간 동안 블러킹 (blocking)한 후 세척하였다. 혈청이 없는 DMEM에 현탁된 세포 (1 x 105 개/100 ㎕)를 ECM-코팅된 배양 플레이트에 분주한 후, 5% CO2 인큐베이터 안에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 세포를 두 번 세척한 후 부착된 세포를 실온에서 0.2% 크리스탈 바이올렛/20% 메탄올 (w/v) 용액으로 염색하였다. 염색된 세포를 0.2 ㎖의 1% 소디움 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에 녹였고, 분광광도계의 (spectrophotometric) 흡수도를 560 ㎚에서 측정하였다.
HT1080 세포를 죽여 추출물로 미리 처리한 경우 피브로넥틴 (FN)과 콜라겐에 대한 세포 부착능력이 용량-의존적 방법으로 감소되었다 (도 2e, 도 2f). 그러나, 세포외기질 (ECM)-코팅된 웰을 죽여 추출물로 미리 처리한 웰은 세포의 부착 능력에 영향을 주지 않았다 (자료를 도시 안 함).
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실시예
7>
MMP
-9 활성 분석 및
웨스턴
블럿
분석
<7-1> MMP-9 활성 분석 및 웨스턴 블럿 분석
MMP-9는 주위 세포외 기질 (ECM)을 분해함으로써 암 전이에서 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명에서는 죽여 추출물이 MMP-9 활성 및 발현을 조절할 수 있는 지 여부를 젤라틴 자이모그래피와 웨스턴 블럿팅에 의해 검사하였다. PMA를 MMP-9 활성과 발현을 증가시키는 MMP-9 활성의 강력한 유도자로서 사용하였다.
세포를 12시간 동안 혈청이 없는 DMEM에서 특정한 농도의 죽여 추출물로 미리 인큐베이션 한 후 5 nM의 포볼 미리스테이트 아세테이트 (phorbol myristate acetate, PMA)로 추가적으로 24시간 동안 자극하였다. 젤라틴 자이모그래피를 통한 MMT-9 활성을 조사하기 위해 조건화된 배지의 같은 용량을 0.1% 젤라틴이 포함된 8% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)에서 전기영동 하였고, 젤을 세척 버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 2.5% Triton X-100)로 꼼꼼히 세척한 후 활성 버퍼 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.02% NaN3, 1 μM ZnCl2)에 담근 후 37 ℃에서 인큐베이션 하였다. 젤을 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue) R-250 염색 용액 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, 미국)으로 염색하였고, 10% 이소프로판올 (isopropanol) / 10% 아세트산 (v/v) 용액으로 탈염색하였다. MMP-9의 젤라틴 분해 능력은 어두운 푸른색 배경에서 투명한 밴드로 92 kDa 크기에서 탐지되었다.
MMP-9 발현을 조사하기 위해 현탁액과 조건화된 배지를 전기영동 하였으며, 니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane)으로 전기 전달시킨 후 면역 블럿을 수행하였다. PowerOpti-ECL 웨스턴 블럿팅 탐지 시약 (Animal genetics, Inc., 한국)과 ImageQuant LAS 4000 mini (GE healthcare, Piscataway, NJ, 미국)를 이용하여 단백질을 시각화해 보이게 했으며, Image J 소프트웨어 (미국 국립보건원)를 이용하여 밴드 강도를 계산하였다.
도 3a와 3b에서 보여준 대로, 50 - 250 ㎍/㎖의 죽여 추출물 처리는 PMA 자극에 의한 MMP-9 활성과 발현의 증가를 용량-의존적인 방법으로 극적으로 감소시켰다. 휴지 상태의 억제 효과는 무시해도 될 정도였다.
<7-2> 죽여 추출물은 PMA에 의해 유도된 NF-κB 활성과 ERK 인산화를 차단함
전사인자 NF-κB는 다양한 세포에서 PMA에 의한 MMP-9 발현의 유도와 종양 침입을 늘리는 데 중심적으로 관여하는 것으로 보고되어 왔다. MMP-9 발현 및 침윤능력에 대한 죽여 추출물의 억제적 효과가 NF-κB 활성 억제와 연결되어 있는 지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명에서는 p65 단백질의 핵내 위치이동 (nuclear translocation)과 함께 IκB 및 인산화된 IκB의 수준을 웨스턴 블럿팅으로 검사하였다. M-PER 포유동물 단백질 추출 시약 (M-PER mammalian protein extraction reagent) 및 NE-PER 핵/시토졸 추출 시약 (Pierce biotechnology, Rockford, IL, 미국)을 이용하여 전체 세포 현탁액과 핵/시토졸 (cytosolic, 세포질의 액상 부분) 추출물을 준비하였다. 도 4a에서 보여준 바와 같이, 대조군 HT1080 세포에서 PMA 자극에 의해 IκB 인산화 및 IκBα 분해가 즉각적으로 증가한 반면, 죽여 추출물-처리된 HT1080 세포에서는 대조군 세포와 비교하여 현저하게 낮았다. 대조군 세포에서, p65 단백질은 PMA 자극 후에 시토졸에서 핵으로 빠르게 위치이동 하였다. 죽여 추출물-처리된 세포에서, p65 핵 내 위치이동은 유의미하게 억제되었다 (도 4b). 이러한 관찰들을 종합해 보면, 죽여 추출물이 NFκB 활성 억제를 통해 MMP-9 활성을 감소시킴으로써 HT1080 세포의 이동 및 침윤을 억제한다는 것을 시사한다. 많은 연구에서, ERK1/2, p38, JNK1/2를 포함하는 MAPKs가 NFκB 또는 AP-1의 위쪽 부위 조정자로서 작용하여 MMP-9 활성 및 발현에 관여한다고 보고되었다. 도 5에 보여준 대로, 대조군 세포에서 PMA 자극을 통해 p38, ERK 1/2, JNK1/2의 인산화를 빠르게 유도했다. 한편 죽여 추출물을 처리한 세포에서는 PMA 자극에 의한 ERK1/2의 인산화가 유의미하게 억제되었고, p38과 JNK1/2 인산화에 대해서는 효과가 거의 없었다. 이는 죽여 추출물이 PMA 자극에 의한 ERK 활성화를 특이적으로 억제하는 것이 MMP-9 활성 억제와 관련이 있다는 것을 시사한다.
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실시예
8> 세포 내
ROS
생성의 측정
이전의 실험들은 다양한 세포 유형에서 PMA가 ROS 생산을 통한 NFκB 활성을 통해 MMP-9 활성을 촉발한다는 것과, ROS 생산이 MMP-9의 발현과 활성에 기여한다는 것을 보여 주었다. 죽여 추출물에 의한 MMP-9 활성 억제가 ROS-제거 활동과 관련이 되는 지를 결정하기 위하여, 본 발명에서는 유세포 분석기 (flow cytometer)를 이용하여 HT1080 세포에서 PMA 자극에 의한 ROS 생산에 대한 죽여 추출물의 효과를 결정하였다.
과산화수소-감수성이 있는 형광 프로브 (peroxide-sensitive fluorescent probe) 2'7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA, Sigma)를 이용하여 세포 내 ROS 수준을 평가하였다. 죽여 추출물 또는 N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine)을 특정한 시간동안 미리 인큐베이션 없이 또는 미리 인큐베이션한 후 5 nM의 PMA로 자극하였으며, 그리고 나서 37 ℃에서 30 분 동안 DCF-DA (5 μM)로 인큐베이션 하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 세포 내 ROS 수준을 CellQuest 소프트웨어 (BD Biosciences, San Jose, CA, 미국)를 이용하여 FACSCalibur 유세포 분석기 (flow cytometer)로 즉각적으로 측정하였고, WinMDI 2.8 소프트웨어 (J. Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, 미국)로 분석하였다.
이전에 보고한 대로, 본 발명에서도 PMA 자극이 세포 내 ROS 수준 (~ 6.5-배)을 현저하게 증가시킨다는 것과 NAC 전처리에 의해 ROS가 거의 완전하게 제거된다는 것을 확인하였다 (도 6a). 게다가, NAC는 PMA 자극으로 유도된 IκBα 인산화와 IκBα 분해를 완벽하게 억제하였으며, MMP-9 활성과 발현을 감소시켰는데 (도 6b-c), 이는 HT1080 세포에서 PMA 자극에 의한 ROS 생산이 NF-κB 활성 및 MMP-9 활성 증가와 관련이 있음을 시사하는 것이다. 흥미롭게도, 죽여 추출물 역시 대조군 세포와 비교하여 PMA 자극으로 늘어난 세포 내 ROS 생산을 ~70% 까지 감소시켰고, IκBα 인산화와 IκBα 분해를 억제하였고, MMP-9 활성을 억제하였다 (도 6a-c). 이러한 자료는 죽여 추출물이 ROS 시그날링을 통한 NF-κB 활성화를 억제함으로써 PMA 자극으로 유도된 전이 활성의 증가를 억제한다는 것을 시사한다.
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실시예
9> 생체 내 실험적 폐 전이 분석
본 발명에서는 C57BL/6J 마우스의 꼬리정맥에 주입된 B16F10 세포가 폐로 전이되어 증식하는 능력에 대한 죽여 추출물의 억제적 효과를 검사하였다.
B16F10 세포 (3 x 105 개의 세포/0.2 ㎖ PBS)를 암컷 C57BL/6J 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다 (0일). 마우스를 임의적으로 3개의 군으로 나누었으며 (각 군 마다 n=5), 전이의 유도와 동시에 죽여 추출물을 매일 경구로 투여하였다. 50 또는 100 ㎎/㎏/day의 죽여 추출물 담체 (생리식염수)를 마우스에게 구강으로 17일 동안 투여하였다. 마우스를 희생시켰으며, 마우스의 폐를 보우인 용액 (Bouin's solution) (Sigma)으로 고정하였고, 폐의 표면에 있는 B16F10 세포의 검은 색 콜로니의 숫자를 육안 검사로 결정하였다.
도 7a 내지 도 7c에 보여준 대로, 죽여 추출물 투여한 군에서 대조군과 대비하여 검은 폐 전이성 콜로니가 유의미하게 감소하였다 (각각 50 및 100 ㎎/㎏의 용량에서 대조군 값의 ~20% 및 ~15%에 해당). 실험 기간 동안 죽여 추출물을 반복적으로 투여하는 것이 마우스 전신적으로 비-독성인지 여부를 조사하기 위하여, 동량의 생리식염수 (대조군) 또는 50 또는 100 ㎎/㎏ 농도의 죽여 추출물을 경구로 매일 투여하였다. 15일 동안 죽여 추출물을 투여한 경우 죽음 또는 비정상적인 행동을 야기하지 않았으며, 마우스의 체중 증가 (표 1) 또는 각 장기의 중량 (표 2)에 영향을 미치지 않았다. 혈청학적 분석에서, GOT/GPT 및 BUN/CRE 비율은 대조군에 비해 죽여 추출물-투여군에서 유의미하게 변하지 않았고, 이는 죽여 추출물 투여가 간 손상 또는 신장 손상을 유도하지 않았다는 것을 시사한다 (표 3). 혈액학적 분석에서, 적혈구의 숫자 및 헤모글로빈 (빈혈의 지표) 수준은 죽여 추출물에 의해 유의미하게 변화하지 않았으며, 죽여 추출물 처리한 마우스에서 백혈구의 숫자와 다른 매개 변수는 모두 정상적인 범위 내에 있었다 (표 4). 이러한 자료는 죽여 추출물을 투여한 경우 생체 내 부작용 없이 B16F10 세포의 폐 전이를 효과적으로 억제했다는 것을 보여 준다.
| 처리 | 체중 (g) | |||
| 0 일 | 5 일 | 10 일 | 15 일 | |
| 대조군 | 17.43 ± 0.36 | 18.68 ± 0.57 | 18.82 ± 0.73 | 19.21 ± 0.41 |
| 50 ㎎/㎏ | 17.38 ± 0.34 | 18.51 ± 0.42 | 18.64 ± 0.30 | 19.03 ± 0.52 |
| 100 ㎎/㎏ | 17.34 ± 0.35 | 18.65 ± 0.45 | 18.99 ± 0.12 | 19.34 ± 0.17 |
자료는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 마우스의 각 그룹 (n=3)은 50 또는 100 ㎎/㎏을 매일 경구 투여하였으며, 0, 5, 10, 15일에 체중을 측정하였다.
| 처리 | 장기의 무게 (g) | |||||
| 간 | 심장 | 폐 | 비장 | 신장 (왼쪽) | 신장 (오른쪽) | |
| 대조군 | 1.08 ± 0.04 | 0.10 ± 0.02 | 0.15 ± 0.01 | 0.08 ± 0.01 | 0.12 ± 0.01 | 0.12 ± 0.01 |
| 50 ㎎/㎏ | 1.08 ± 0.01 | 0.10 ± 0.01 | 0.13 ± 0.01 | 0.07 ± 0.00 | 0.11 ± 0.00 | 0.12 ± 0.01 |
| 100 ㎎/㎏ | 0.94 ± 0.08 | 0.11 ± 0.01 | 0.15 ± 0.01 | 0.08 ± 0.01 | 0.12 ± 0.01 | 0.12 ± 0.02 |
자료는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 마우스의 각 그룹 (n=3)은 50 또는 100 ㎎/㎏을 매일 경구 투여하였으며, 15일에 희생시킨 후 각 장기의 중량을 측정하였다.
| 처리 | GOT (IU/L) | GPT (IU/L) | LDH (IU/L) | BUN (IU/L) | CRE (IU/L) |
| 대조군 | 52.7 ± 3.1 | 29.3 ± 4.6 | 518.7 ± 78.0 | 36.5 ± 1.5 | 0.7 ± 0.1 |
| 50 ㎎/㎏ | 56.0 ± 6.3 | 28.0 ± 1.4 | 424.0 ± 83.7 | 36.8 ± 3.6 | 0.4 ± 0.1 |
| 100 ㎎/㎏ | 59.0 ± 2.0 | 30.0 ± 2.0 | 576.3 ± 72.3 | 39.0 ± 5.2 | 0.8 ± 0.3 |
자료는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 마우스의 각 그룹 (n=3)은 50 또는 100 ㎎/㎏을 매일 경구 투여하였으며, 15일에 희생시켰고, GOT, GPT, LDH (lactose dehydrogenase), BUN (blood urea nitrogen), 및 CRE (creatine)를 분석하였다.
| 매개 변수 (Parameter) |
대조군 | 50 ㎎/㎏ | 100 ㎎/㎏ |
| WBCP (x103 세포/㎕) | 1.8 ± 0.58 | 1.9 ± 0.27 | 1.9 ± 1.03 |
| WBCB (x103 세포/㎕) | 1.9 ± 0.56 | 1.8 ± 0.21 | 1.9 ± 1.01 |
| RBC (x106 세포/㎕) | 9.5 ± 0.30 | 10.4 ± 0.61 | 9.4 ± 0.01 |
| 평균 HGB (g/dL) | 13.6 ± 0.30 | 13.9 ± 0.06 | 13.7 ± 0.00 |
| HCT (%) | 54.5 ± 1.01 | 53.3 ± 1.11 | 53.8 ± 0.64 |
| MCV (fL) | 57.5 ± 1.10 | 59.6 ± 0.54 | 57.5 ± 0.63 |
| MCH (pg) | 14.4 ± 0.26 | 14.3 ± 0.03 | 14.6 ± 0.01 |
| MCHC (g/dL) | 24.9 ± 0.57 | 24.0 ± 0.51 | 25.5 ± 0.28 |
| PLT (x104 세포/㎕) | 97.1 ± 17.5 | 95.8 ± 11.4 | 89.3 ± 1.84 |
| % NEUT | 9.7 ± 1.96 | 9.20 ± 0.07 | 9.9 ± 0.37 |
| % LYM | 86.5 ± 1.85 | 90.5 ± 0.25 | 85.7 ± 2.62 |
| % MONO | 0.5 ± 0.11 | 0.5 ± 0.09 | 0.5 ± 0.10 |
자료는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 마우스의 각 그룹 (n=3)은 50 또는 100 ㎎/㎏을 매일 경구 투여하였으며, 15일에 희생시켰고, 혈액학적 매개 변수들 (parameters)을 분석하였다. 상기 표의 약어의 설명은 다음과 같다.
CBC, 전혈구검사 (complete blood cell count) ; WBCP, 백혈구 혈구검사 페록시다제 방법 (white blood cell count peroxidase method) ; WBCB, 백혈구 혈구검사 호염구 방법 (white blood cell count basophil method) ; RBC, 적혈구 검사 (red blood cell count) ; HGB, 헤모글로빈 (hemoglobin) ; HCT, 헤마토크릿 (적혈구 용적율, hematocrit) ; MCV, 평균 적혈구 용적 (mean corpuscular volume) ; MCH, 평균 적혈구 헤모글로빈 (mean corpuscular hemoglobin) ; MCHC, 평균 적혈구 헤모글로빈 농도 (mean corpuscular hemoglobin concentration) ; PLT, 혈소판 (platelet); NEUT, 호중구 (neutrophil); LYM, 림프구 (lymphocyte); MONO, 단핵구 (monocyte).
Claims (9)
- 죽여 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 0.001 중량 % 내지 50 중량 %의 죽여 열수 추출물을 포함하는 것인 암전이 억제용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물.
- 죽여 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 식품 조성물.
- 삭제
- 제5항에 있어서, 0.001 중량 % 내지 50 중량 %의 죽여 열수 추출물을 포함하는 것인 암전이 억제용 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130082481A KR101532307B1 (ko) | 2013-07-12 | 2013-07-12 | 죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130082481A KR101532307B1 (ko) | 2013-07-12 | 2013-07-12 | 죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150007883A KR20150007883A (ko) | 2015-01-21 |
| KR101532307B1 true KR101532307B1 (ko) | 2015-06-29 |
Family
ID=52570683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130082481A KR101532307B1 (ko) | 2013-07-12 | 2013-07-12 | 죽여 추출물을 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101532307B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180107004A (ko) | 2017-03-21 | 2018-10-01 | 충남대학교산학협력단 | Crif1 억제제를 함유하는 항암 및 암전이 억제용 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010018665A (ko) * | 1999-08-20 | 2001-03-15 | 유상옥 | 죽여 추출물을 함유하는 화장료 조성물 |
-
2013
- 2013-07-12 KR KR1020130082481A patent/KR101532307B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010018665A (ko) * | 1999-08-20 | 2001-03-15 | 유상옥 | 죽여 추출물을 함유하는 화장료 조성물 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BAIYI LU et al, African Journal of Biotechnology, 2010, Vol. 9(38), pp. 6430-6436 * |
| BAIYI LU et al, African Journal of Biotechnology, 2010, Vol. 9(38), pp. 6430-6436* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180107004A (ko) | 2017-03-21 | 2018-10-01 | 충남대학교산학협력단 | Crif1 억제제를 함유하는 항암 및 암전이 억제용 조성물 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20150007883A (ko) | 2015-01-21 |
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