KR102455428B1 - 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 보다 상세하게는 열-불활성화 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P 또는 이의 세포막으로부터 분리된 분자량 9 내지 18kDa의 단백질을 포함함으로써, 암세포 사멸 유도 효과를 가져 우수한 항암 효과를 나타내는 의약 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

암의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품{MEDICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD}
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 인구의 고령화와 더불어 흡연 인구의 증가 및 대기 오염으로 인해 폐암이 증가하고 있으며, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다.
한편, 암의 치료 방법은 암조직을 세포레벨에서 체내로부터 제거하는 데 있다. 현재의 암 치료방법은 외과요법, 방사선요법, 화학요법 등으로 나뉜다. 외과요법은 암을 조직레벨에서 체내로부터 제거하는 것으로서, 가장 합리적이지만 세포레벨에서 보면 주위의 조직 속에 침윤하거나 림프선에 전이해 있는 현미경적 병소를 완전히 제거하는 것은 힘든 문제점이 있다. 그러므로 조기암 또는 병소가 일부에 국한되어 있는 암(병기가 1기 또는 2기인 암)에 대해서는 외과요법이 매우 효과적이지만, 어느 정도 진행된 3기의 암인 경우에는 외과요법뿐 아니라 방사선요법이나 화학요법을 병용할 필요가 있다.
방사선요법, 화학요법은 3기 이후의 진행암 또는 말기암에 주로 쓰이나, 후두암, 자궁경부암에서는 1기의 암이라도 방사선요법만으로 완치되므로 방사선요법이 제일 우선시 되고 있다. 특히, 후두암에서는 성대의 기능을 보존하기 위하여 1기에는 방사선요법만을 하고, 2기에는 방사선요법에 부분수술 또는 화학요법을 병용하는 수가 있다. 또, 폐암 중 소세포암은 종래부터 외과요법으로 시술하여도 예후가 좋지 않았는데, 지금은 화학요법을 우선으로 하며 방사선용법을 병용하는 경우가 많다. 이 요법에 의해 최근에는 근소하나마 5년 생존율을 상승시킬 수 있게 되었다. 이상과 같이 암 치료법은 조기암을 제외하고는 어느 것이나 안전하다고 말하기 어려우며, 상기의 외과요법, 방사선요법 및 화학요법들은 모두 정상세포들에게도 영향을 주어 심각한 부작용을 초래하는 문제가 있다.
따라서 보다 안전하고, 치료 효과가 높은 대체적인 암치료 방법이 요구되고 있으며, 이에 최근에는 안정성이 보장된 식물, 미생물 유래 등 천연 자원을 이용한 기능성 식품 및 의약품 연구에 관심이 집중되고 있다.
한국공개특허 제2014-0117950호에는 솔장다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암 또는 항산화용 조성물이 개시되어 있다.
한국공개특허 제2014-0117950호
본 발명은 천연 자원을 이용한 암 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 천연 자원을 이용한 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 열-불활성화(heat-inactivated) 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P 또는 이의 세포막으로부터 분리된 분자량 9 내지 18kDa의 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)은 락토바실러스(Lactobacillus)속 젖산균으로 막대기 모양의 간균이며 그람양성이다. 크기는 0.7~1.0 x 3.0~8.0 μm으로 생육 적정 온도는 29-33℃이며 약간의 호기성을 띤다. 락토바실러스 플랜타룸은 아라비노오스(arabinose), 글루코오스(glucose), 과당(fructose), 갈락토오스(galactose), 엿당(maltose), 수크로오스(sucrose), 덱스트란(dextran), 라피노오스(raffinose) 및 트레할로스(trehalose) 등을 발효하여 젖산을 생성한다. 주로 우유, 치즈, 버터, 케피어(kefir), 발효된 소시지, 발효된 감자, 곡물, 빵의 산성 반죽(dough), 피클이나 김치와 같은 침채류 및 토마토 등에서 분리되며, 자연계에서 가장 분포가 넓은 젖산균 중의 하나이다. 특히 우리 나라 김치의 발효에 중요한 역할을 하는 젖산균으로 식염 내성은 약 5.5%이다.
본 발명자들은 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P를 열처리하여 불활성화한 경우, 이의 세포막으로부터 분리되는 특정 단백질이 암 세포의 세포 사멸을 유도하는 것을 발견한 것에 착안하여, 본 발명을 고안하였다.
락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P은 본 발명자들이 2014년 3월 11일자로 한국미생물보존센터에 기탁한 것으로, 기탁번호는 KCCM11522P이다.
락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P의 열-불활성화는 균주 내 단백질이 열손상될 수 있도록 열처리하여 수행될 수 있다. 예를 들면 70 내지 130℃의 열을 5분 내지 120분간 처리하여 수행된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
열-불활성화(heat-inactivated) 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P의 세포막으로부터 분리된 단백질은 9 내지 18kDa의 분자량을 갖는다. 보다 구체적으로, 12kDa 또는 15kDa의 분자량을 가질 수 있다. 상기 단백질은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 단백질은 암세포의 세포 사멸을 유도한다. 구체적으로, 암세포내 활성세포종 증가, 미토콘드리아로의 칼슘 이동 촉진, 세포질로의 PKC의 이동 촉진, 세포질로의 사이토크롬 c의 이동 촉진, Bax의 활성 촉진, t-Bid의 활성 촉진, 카스파아제-8 활성 촉진, 카스파아제-3 활성 촉진, PARP 활성 촉진, Bid 활성 억제 및 Bcl-2 활성 억제로 이루어진 군에서 선택된 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 예방 또는 치료 대상인 암은 예를 들면 대장암, 위암, 폐암, 간암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 자궁경부암, 피부암, 골암, 결장암, 갑상선암, 방광암, 신장암, 순암, 설암, 구강암, 결장암, 소장암, 직장암 등일 수 있고, 바람직하게는 대장암일 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P 또는 이의 세포막으로부터 분리된 분자량 9 내지 18kDa의 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P의 열-불활성화는 균주 내 단백질이 열손상될 수 있도록 열처리하여 수행될 수 있다. 예를 들면 70 내지 130℃의 열을 5분 내지 120분간 처리하여 수행된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
열-불활성화(heat-inactivated) 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P의 세포막으로부터 분리된 단백질은 9 내지 18kDa의 분자량을 갖는다. 보다 구체적으로, 12kDa 또는 15kDa의 분자량을 가질 수 있다. 상기 단백질은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 단백질은 암세포의 세포 사멸을 유도한다. 구체적으로, 암세포내 활성세포종 증가, 미토콘드리아로의 칼슘 이동 촉진, 세포질로의 PKC의 이동 촉진, 세포질로의 사이토크롬 c의 이동 촉진, Bax의 활성 촉진, t-Bid의 활성 촉진, 카스파아제-8 활성 촉진, 카스파아제-3 활성 촉진, PARP 활성 촉진, Bid 활성 억제 및 Bcl-2 활성 억제로 이루어진 군에서 선택된 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 예방 또는 개선 대상인 암은 예를 들면 대장암, 위암, 폐암, 간암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 자궁경부암, 피부암, 골암, 결장암, 갑상선암, 방광암, 신장암, 순암, 설암, 구강암, 결장암, 소장암, 직장암 등일 수 있으며, 바람직하게는 대장암일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 추출물을 포함한 음료 (알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품은 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제, 액제 제형 등으로 제형화된 것일 수도 있다. 이들은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 제형화될 수 있다.
본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
상기 상술한 제형 내 유효성분으로서의 본 발명의 건강기능식품의 함량은 사용 형태 및 목적, 사용자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물은 암세포의 세포 사멸을 유도하여 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 우수한 암의 예방 또는 개선 효과를 나타낸다.
도 1은 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P (락토바실러스 플랜타룸 L67)로부터 분리된 단백질의 동정을 나타낸 것이다. 열사멸 세포는 100℃에서 30분간 처리되고 수확된 것이다. 단백질은 살아있거나 또는 열처리된 세포로, 세포질 또는 막 단백질로 분리되었다(A). 분리된 단백질(12, 15kDa)은 원심여과기(centrifugal filter units) 및 투석막을 이용하여 정제되었다(B). Lane 1의 M 마커가 전체 L67; lane2가 살아있는 L67의 세포질; lane 3가 살아있는 L67의 막; lane 4가 열사멸 L67의 세포질; lane 5가 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67의 막이다.
도 2는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 단백질의 HT-29 세포에서의 세포 독성 효과를 나타낸 것이다. (A)는 생존율(%), (B)는 LDH 방출(%)이다. 흰색 막대는 컨트롤, 검정 막대는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 다양한 농도의 단백질로 24시간 처리된 HT-29 세포 또는 HCT-116 세포를 나타낸다. *는 p<0.05에서 **는 p<0.01에서 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
도 3은 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 단백질의 HT-29 세포에서의 세포 독성 효과를 나타낸 것이다. (C)는 HT-29 세포의 세포내 활성산소종(ROS)의 양이고, (D)는 HCT-116 세포의 생존율(%)이다. 흰색 막대는 컨트롤, 검정 막대는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 다양한 농도의 단백질로 24시간 처리된 HT-29 세포 또는 HCT-116 세포를 나타낸다. *는 p<0.05에서 **는 p<0.01에서 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
도 4는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 단백질의 HT-29 세포의 세포내 Ca2+ 및 PKC의 양에 대한 영향(24시간 처리)이다. 흰색 막대는 컨트롤, 검정 막대는 검정 막대는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 다양한 농도의 단백질로 24시간 처리된 HT-29 세포를 나타낸다(A). PKC의 활성은 면역 블롯 분석으로 평가하였다(B). (C)는 PKC의 상대 강도이다. 상대 밴드 강도는 Scion imaging soflWare (Scion Image Beta 4.02, Maryland, USA)로 계산하였다. 데이터는 3회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타내었다. *는 p<0.05에서 **는 p<0.01에서 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
도 5는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 단백질의 사이토크롬 c의 활성(A), 사이토크롬 c의 상대 강도(B)에 대한 영향을 나타낸 것이다. HT-29 세포는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 다양한 농도(5, 20, 50, 100㎍/ml)의 단백질로 24시간 처리되었다. 상대 밴드 강도는 Scion imaging soflWare (Scion Image Beta 4.02, Maryland, USA)로 계산하였다. 데이터는 3회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타내었다. *는 p<0.05에서 **는 p<0.01에서 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
도 6은 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 단백질의 Bcl-2 패밀리의 활성(Bid, Bax, Bcl-2)(C), Bax 및 Bcl-2의 상대 강도(D)에 대한 영향을 나타낸 것이다. HT-29 세포는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 다양한 농도(5, 20, 50, 100㎍/ml)의 단백질로 24시간 처리되었다. 상대 밴드 강도는 Scion imaging soflWare (Scion Image Beta 4.02, Maryland, USA)로 계산하였다. 데이터는 3회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타내었다. *는 p<0.05에서 **는 p<0.01에서 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
도 7은 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 단백질의 HT-29 세포에서 세포사멸-관련 단백질(카스파아제-3, 카스파아제-8, 폴리 ADP 리보스 폴리머라아제(PARP))의 활성에 대한 영향을 나타낸 것이다. HT-29 세포는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 다양한 농도(5, 20, 50, 100㎍/ml)의 단백질로 24시간 처리되었다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1.재료 및 방법
(1) Chemicals
모든 플라스틱 재료들은 Falcon labware(Bedton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USa)로부터 구입하였다. 페니실린 G 및 스트렙토마이신은 Sigma(St.Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. RPMI 1640 배지 및 소태아혈청(FBS)는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다.
(2) 열사멸 및 살아있는 락토바실러스 플랜타룸 CNU43 (Lactobacillus plantarum CNU43 ) KCCM11522P ( 락토바실러스 플랜타룸 L67)로부터의 전체 단백질, 세포질 단백질 및 막 단백질의 준비
박테리아 세포 분획은 (Rosenthal RS. Dzjarski R. Isolation of peptidoglycan and soluble epetidoglycan fragments. Methods Enzymol 1994; 235: 253-285.)에 기재된 방법에 약간의 수정을 가한 방법에 따라 준비되었다.
균주는 본 발명자들이 한국미생물보존센터에 기탁한 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P 균주를 사용하였다.
생물활성 단백질(12 및 15kDa)을 분리하기 위해, 원심분리 필터 유닛(Merk Millipore, Dannstadt, Germany)이 사용되었고, 단백질은 투석막(Fisherbrand, UK)을 거쳐 정제되었다.
용질은 동결 건조(Ilshin lab co. Yangjusi, Korea)에 의해 농축되었다.
두 단백질(12 및 15kDa)은 분자량에 큰 차이가 없어서 완전히 분리되지 않았다.
단백질의 양은 (Lowry OH. Rosebrough NJ. Farr At, el al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Bioi Chem 1951; 193: 265-275)에 기재된 방법을 통해 측정되었고, 세포 단백질은 사용 전에 -70℃에서 보관되었다.
(3) 세포 배양 및 세포 독성
HT-29 세포(ATCC HTB-38)가 10% FBS, 100U/ml 페니실린 및 100mg 스트렙토마이신을 함유한 RPMI 배지 1640에서 37℃, 5% CO2 대기에서 배양되었다. 세포(1 X 106개/ml, passage number 3)는 35mm 배양 접시 또는 96-well flat bottom plate에 분산되었다. HCT-116 세포도 이와 동일한 조건으로 배양 및 분산시켰다.
열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질의 세포 독성은 MTT 평가에 의해 결정되었다. 세포 독성은 또한 (Bergmeyer HU. Bernt E. Lactate dehydrogenase. In Methods of enzymatic analysis 2nd edition. Bergmeyer HU(ed.) Academic Press: NewYork. 1974; 574-579.)의 방법에 따라 배지 내에서 LDH(lactate dehydrogenase)의 방출에 의해 결정되었다.
세포는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 다양한 농도의 막 단백질로 37℃, 5% CO2 대기 조건에서 24시간 처리되었다.
(4) 세포내 ROS의 측정
세포내 ROS는 비형광 염료 20, 다양한 ROS에 의해 산화되는 막-투과 불소형성 추적자인 70-dichlorodihydrofluoresccin (H2DCF-DA)를 이용하여 측정되었다.
세포는 10mmol의 H2DCF-DA로 37℃에서 30분간 전-배양되었고, 세포외 H2DCF-DA를 제거하기 위해 PBS로 2회 세척되었다.
세포는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸으로부터 분리된 5, 20, 50 및 100㎍/ml의 막 단백질로 37℃, 5% CO2 대기에서 24시간 처리되었다.
이후, 형광 강도는 형광 마이클로플레이트 리더(Dual Scanning SPECTRAmax, Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 485nm의 여기 및 530nm의 방출에서 측정되었다.
(5) 세포내 칼슘 동원(mobilization)의 감지
세포내 칼슘은 (Kimata M. Shichijo M. Miura T. Serizawa I, et al. Ca2+ and protein kinase C signaling for histamine and sulfidoleukotrienes released from human cultured mast cells. BioCheml Biophl Res Co 1999; 257:895-900.)에 기재된 바에 따라 결정되었다.
세포는 락토바실러스 플랜타룸으로부터 분리된 5, 20, 50 및 100㎍/ml의 막 단백질로 처리되었다.
형광 강도는 형광 마이클로플레이트 리더(Dual Scanning SPECTRAmax, Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 510nm의 방출 및 340nm, 380nm의 여기에서 측정되었다.
(6) 막, 사이토졸의 , 핵의, 그리고 전체 단백질 추출물의 준비
PKC(protein kinase C)의 이행(translocation)을 감지하기 위해, 막 및 사이토졸의 추출물이 Patton의 방법(Patton WF, Dhanak MR. Jacobson BS. Differential partitioning of plasma membrane proteins into the triton X-100-insolubJe cytoskeleton fraction during concanavalin A-induced receptor redistribution. J Cell Sci 1989; 92: 85-91.)에 따라 얻어졌다.
사이토크롬 c의 면역블로팅을 위한 핵 단백질의 추출물, Bid, Cbl-2, Bax, caspase-9, caspase-3, PARP 및 α-tubulin의 면역블로팅을 위한 전체 단백질의 추출물이 (Oh PS, Lim KT. Blocking of intracellular ROS production by phytoglycoprotein (30 kDa) causes anti-proliferation in bisphenol Astimulated Chang liver cells. J Appl ToxicoI 2008; 28: 749-758.)에 기재된 바에 따라 HT-29 세포로부터 분리되었다. 단백질의 양은 Lowry에 의해 개발된 방법(Lowry OH. Rosebrough NJ. Farr At, el al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Bioi Chem 1951; 193: 265-275)을 통해 측정되었고, 세포 단백질은 사용 이전에 -70℃에서 저장되었다.
(7) 면역 블롯 분석
세포 단백질은 10% 폴리아크릴아미드 미니-겔 상에서 상온에서 2시간 동안 분리되었다.
전기영동 이후에, 단백질은 니트로셀루로오스 막(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮겨졌다. 막은 이후에 1차 항체(Bid, Cbl-2, Bax, caspase-9, caspase-3, PARP 및 α-tubulin), Tween 20(TBS-T) 용액과 함께 트리스-버퍼 살린 내에서 상온에서 2시간 배양되었다.
TBS-T로 3회 세척 이후에, 막은 TBS-T 용액 내에서 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG (I: 10000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)과 함께 상온에서 1시간 배양되었다.
얻어지는 단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence (Amersharn Pharmacia Biotech, Bristol, UK)에 의해 시각화되었다. 면역 블롯 평가 결과는 Scion imaging software (Scion Image Beta 4.02, Frederick, MD, USA)를 이용하여 상대 강도로서 계산되었다.
(8) 통계 분석
모든 실험은 독립적으로 3회 반복 수행되었다. 모든 데이터는 평균 및 표준편차로 나타내었다. 일원 분산 분석 및 Duncan's test가 SPSS 11.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 다중 검정 내에서 유의한 차이를 결정하기 위해 수행되었다. P<0.05가 유의한 것으로 간주되었다.
2. 결과
(1) 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 단백질의 분리
Schiff 시약이 아닌 쿠마시 블루를 이용하여 염색한 후에, 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리한 단백질은 14% 아크릴아미드 겔 상에 2개의 밴드로 위치하였다. 한 개는 겔 상에서 12kDa의 분자량을 가졌고, 나머지는 15kDa였다.
단백질은 살아있는 세포나 열사멸 세포의 세포질이 아닌, 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67의 막으로부터 분리되었다(도 1A). 상기 12 및 15kDa의 단백질을 이후 실험에 사용하였다(도 1B).
(2) 열사멸 락토바실러스 플랜타룸으로부터 분리된 단백질의 HT-29 세포에 대한 세포독성 효과
락토바실러스 플랜타룸 L67이 세포독성이 있는지를 결정하기 위해 HT-29 세포로 처리된 열사멸 락토바실러스 플랜타룸으로부터 분리된 막 단백질 내에서 MTT 및 LDH 평가를 수행하였다.
도 2A에 도시된 바와 같이, 세포 독성은 HT-29 세포가 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67의 다양한 농도(㎍/ml)의 막 단백질에 노출되었을 때 크게 증가하였다. 5, 20, 50 및 100㎍/ml에서 24시간 후의 생존율값은 각각 72.06, 66.01, 58.72, 50.23%였다.
도 2B에 도시된 바와 같이 락토바실러스 플랜타룸 L67의 단백질(12, 15kDa)은 LDH 평가에서 세포 독성이 증가했다.
도 3C에 도시된 바와 같이, 세포내 ROS의 상대값은 HT-29 세포가 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67의 다양한 농도(㎍/ml)의 막 단백질에 24시간 처리되었을 때 어떠한 처리도 하지 않은 컨트롤과 비교했을 때보다 증가하였다. 예를 들어, 세포내 ROS 값은 5, 20, 50 및 100㎍/ml에서 컨트롤과 비교했을 때보다 1배, 1.16배, 2.58배 및 2.61배 증가하였다.
또한, 세포독성은 HCT-116 세포와 같은 다른 대장암 세포주에서 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67의 다양한 농도(㎍/ml)의 막 단백질에 의해 크게 증가하였다(도 3D).
(3) HT-29 세포에서 세포내 칼슘 생산에 대한 열사멸 락토바실러스 플랜타룸으로부터 분리된 막 단백질의 영향
세포내 칼슘의 양은 HT-29 세포가 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질에 처리되었을 때 컨트롤과 비교했을 때보다 크게 증가했다.
예를 들어, 세포내 칼슘의 양은 5, 20, 50 및 100㎍/ml의 막 단백질에서 컨트롤과 비교했을 때보다 1.03배, 1.27배, 4.54배 및 4.57배 증가하였다(도 4A).
도 4B에 도시된 바와 같이, HT-29 세포가 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질에 처리되었을 때, PKCα의 이행(translocation)이 세포질에서 막으로 유도되었다.
PKCα의 경우, HT-29 세포가 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질에 처리되었을 때, 상대적인 강도가 컨트롤과 비교했을 때 세포질 내에서 감소한 반면에 막 분획에서 증가하였다(도 4C).
(4) HT-29 세포 내에서 미토콘드리아의 세포-사멸 관련 신호(사이토크롬 c, Bid, Bcl -2, Bax ) 및 관련 단백질( 카스파아제 -3, 카스파아제 -8, PARP )에 대한 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질의 영향
도 5A에 도시된 바와 같이, 사이토크롬 c 활성은 HT-29 세포가 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 5, 20, 50 및 100㎍/ml의 막 단백질로 24시간 처리되었을 때 세포질 분획에서는 점차 증가한 반면에, 미토콘드리아 분획에서는 점차 감소하였다.
미토콘드리아 분획의 사이토크롬 c의 상대적 밴드 밀도는 5, 20, 50 및 100㎍/ml의 막 단백질의 농도에 따라 1배, 0.87배, 0.42배 및 0.2배로 감소하였다(도 5B). 사이토크롬 c 활성은 세포질 분획에서는 반대로 나타났다.
Bid 활성은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 결정하였다. 도 6C에 도시된 바와 같이, 상대적 Bid 활성은 HT-29 세포가 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 5, 20, 50 및 100㎍/ml의 막 단백질로 24시간 처리되었을 때 농도 의존적으로 감소하였다. 상대 Bid 밴드 강도는 크게 증가하였다.
상대 Bcl-2 활성은 농도 의존적으로 감소하였다. 예를 들어, Bcl-2 밴드의 상대 강도는 5, 20, 50 및 100㎍/ml의 농도에서 각각 0.82배, 0.64배, 0.51배 및 0.43배 감소하였다.
상대 Bax 밴드 강도는 5, 20, 50 및 100㎍/ml의 농도의 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질에서 각각 1.08배, 1.62배, 1.74배 및 1.61배 증가하였다(도 6D).
전체 세포 추출물 분획의 카스파아제-3 및 PARP 단백질은 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질에 24시간 노출되었을 때 농도 의존적으로 쪼개졌다(도 7).
전-카스파아제-8, 전-카스파아제-3 및 PARP의 상대적인 강도는 막 단백질로 처리 이후에 크게 감소하였다. 그러나, HT-29 세포가 막 단백질로 처리되었을 때, 세포사멸 단백질의 쪼개진 형태는 강하게 감지되었다. 세포사멸 단백질의 상대적 강도는 크게 증가하였고 농도 의존적이었다.
토론
락토바실러스 플랜타룸 L67이 HT-29 세포와 예비 실험에서 공동 배양되었을 때, 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67의 추출물은 세포독성이었으나, 살아있는 락토바실러스 플랜타룸 L67의 추출물은 그렇지 않았다.
따라서, 본 발명자들은 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67의 세포막 및 세포질로부터 단백질을 분리하였다. 막 단백질은 HT-29 세포에 독성을 나타냈지만, 세포질 단백질은 그렇지 않았다.
도 1A에 도시된 바와 같이, 열사멸 세포에서는 여러 단백질 밴드가 사라진 반면에(line 4,5) 살아 있는 세포에서는 많은 단백질 밴드가 감지(line 2,3)되었다. 이는 열이 단백질을 변성시키거나 3차원 구조를 변형시켰기 때문이다.
단백질의 변형된 구조는 세포막의 수용체와 상호작용한다. 단백질과 수용체의 상호 작용의 결과는 세포 사멸 경로 상위의 활성 신호를 자극한다. 이는 막의 2개의 단백질 밴드(12kDa, 15kDa)의 과발현을 지칭한다(도 1B, line 5).
예비 실험에서, 2개의 단백질만이 생활성이 있는 것으로 나타났다. 살아있는 세포에서 분리된 단백질들이 더 많고, 고유의 구조를 유지하고 있음에도 불구하고, 이들은 HT-29 세포와의 미스매치 때문에 HT-29 세포의 수용체와 상호작용하지 못했다. 결과적으로, 열에 의해 변형된 단백질이 HT-29 세포의 막 단백질과 맞았다(fit).
본 발명자들은 MTT 및 LDH 평가를 통해 HT-29 세포에서 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질의 세포독성을 결정하였다.
결과는 24시간 처리 이후에 IC50이 100㎍/ml임을 나타냈다(도 2, 3). 이에, 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질이 HT-29 세포에 잠재 활성을 보였다.
암세포의 세포사멸 유도는 유산균으로부터 항암제 개발을 위한 유용한 전략이다. 락토바실러스, 특히 락토바실러스 플랜타룸은 다양한 항암 효과로 세포사멸을 유도한다.
이전의 연구들에 의해 다양한 락토바실러스 특정 균주들이 전-염증성 사이토카인(인터류킨-1, 인터류킨-6) 및 항염증성 사이토카인(인터류킨-2, 인터류킨-10)의 생성을 유도한다는 것이 알려져 있다.
그러나, 그러한 메커니즘은 불분명하다. 일반적으로, 암 치료는 사멸 수용체나 미토콘트리아 경로를 통한 세포사멸을 증가시킨다.
활성산소종(ROS)은 종양 형성에 있어서 반대의 기능을 갖는 2가지 신호 경로에 동시에 참여하기 때문에 종양 형성에 있어서 암 촉진 또는 암 억제의 2가지 역할을 한다.
ROS가 과다하게 생성되면 세포 손상을 유발하고 칼슘 항상성을 변화시키는 다른 형태상 및 기능상 세포 변화를 진행시키는 중재자로서 작용한다.
본 발명에서 세포내 ROS의 결과는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질이 HT-29 세포에서 세포내 ROS의 양 증가를 촉진함을 보였다(도 3C).
칼슘 항상성은 세포 기능에 중요한 요건이다. 미토콘드리아의 과다한 칼슘 적재는 미토콘드리아의 막간 공간에서부터 세포질로의 세포사멸-자극 인자의 방출을 자극하고 미토콘트리아의 기능을 손상시킴으로써 세포 사멸을 유도할 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터의 막 단백질은 HT-29 세포에서 세포내 칼슘의 이동량을 증가시켰다. 세포질에서 증가한 칼슘 레벨은 ROS와의 상승 작용에 의해 간세포에서 미토콘드리아의 막 투과도 전이 기공을 열 수 있다.
칼슘의 축적은 미토콘드리아의 주요 기능 중 하나이고, 세포내 칼슘 구획화의 교란은 세포 독성을 유발하고, 세포 사멸을 유도할 수 있다.
세포가 포스포리파아제 C의 활성을 통한 호르몬적, 그리고 특정 세포외 자극에 의해 세포내 시스템의 칼슘 양은 변한다.
즉, 포스포리피드는 이노시톨 프리포스페이트(IP3) 및 디아실글리세롤로 나눠지고, IP3는 세포질 망상 구조(ER)의 막과 열기 위한 복합체를 형성한다. 이후에, 칼슘은 ER에서 세포질로 이동하고, 칼슘 양은 증가한다. 이에, 증가한 칼슘은 핵 효소를 활성화시키고, DNA 조각의 180~200 염기쌍을 자른다. 또한, 칼슘은 신호 경로 하류의 세포사멸과 밀접하게 관련된 여러 키나아제를 활성화시킨다.
세포 성장 및 증식은 특히 세포내 칼슘 레벨에 있어서 PKC와 같은 키나아제의 활성 변화와 연관되어 있다.
흥분성 세포 내의 Ca2+의 증감은 PKC의 이행 및 활성과 관련이 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 이러한 결과는 락토바실러스 플랜타룸 L67의 단백질이 HT-29 세포에서 세포내 Ca2+의 이동량 및 PKC의 세포질로부터 원형질막으로의 이행을 증가시킴을 나타냈다.
다양한 연구들에 의해 칼슘 및 PKC는 세포사멸의 지표로 알려져 있다. 우리의 결과는 Ca2+/PKC의 활성이 세포사멸 경로 하류의 세포사멸 신호 유도를 자극함을 나타낸다.
세포사멸을 위한 TNF-α와 같은 잘 알려진 표면 수용체는 면역계 세포 및 세포질 프로테아제 카스파아제-8을 활성화시키는 Fas에 의해 만들어진다.
카스파아제-8은 세포사멸을 유도하는 카스파아제-3,-6,-7을 활성화시킨다. 그러나, 카스파아제-8은 또한 미토콘드리아를 통해 세포 사멸을 유도하는 Bid를 활성화시킴을 통해 미토콘드리아와 연관되어 있다.
보통의 생리학적 조건에서, Bid는 세포질 내에 비활성 상태로 위치해 있다. 그러나, 세포 표면의 사멸 수용체가 활성화되면, Bid 단백질은 Bax 단백질과 협응하는 위치인 미토콘드리아 막으로 재배치되는 tBid 조각으로 쪼개진다. 이러한 협응은 Bax와 미토콘드리아의 융합을 촉진하고, 이는 Bax 단백질의 배열 변화로 이어진다. 이러한 변화는 막 세공의 형성을 야기하고 많은 양의 사이토크롬 c가 미토콘드리아로부터 방출되게 하는 미토콘드리아의 손상을 증가시킨다. 이후에, 카스파아제-9는 활성화되어, 세포의 세포사멸 유도에 이른다.
도 6C에 도시된 바와 같이, HT-29 세포에서 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질의 첨가에 따라 Bid 및 Bcl-2 활성은 감소하고 Bax 활성은 증가한다. 막 단백질이 Bid, Bcl-2와 같은 생존 인자를 막고, 카스파아제-8, 카스파아제-3 활성을 유도한 것으로 추측된다.
상기 결과들은 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질이 사이토크롬 c의 미토콘드리아로부터 세포질로의 이형을 유도함을 보였다(도 5A).
더욱이, 카스파아제-케스케이드 시스템은 세포사멸에 중요한 역할을 한다. 특히, 카스파아제-3는 다양한 자극에 의해 유도되는 세포 사멸의 최종 및 집행 단계에서 중요한 역할을 한다. 전-카스파아제-3은 세포사멸의 주요 중재자이고, PARP는 카스파아제-3의 주요 기질이다. 이들은 DNA 손상 치료와 사멸에 중요하다.
상기 결과들은 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질이 카스파아제-8 및 카스파아제-3 활성을 자극함으로써 세포사멸 효과를 가짐을 나타낸다. 추가로, 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질로의 처리는 핵 세포사멸 마커인 PARP의 분열에 이르었다(도 7).
미토콘드리아는 세포내 ROS 생산 및 칼슘 이동에 밀접하게 관련이 있다. 미토콘트리아의 세포 사멸 경로의 유도는 Bid의 t-Bid 단백질로의 카스파아제-8-중재 분열에 의해 수행되었다. 미토콘드리아 막 상에서 t-Bid의 이행 및 올리고머화는 사이토크롬 c의 방출을 유도한다. 따라서, 세포내 ROS 및 칼슘의 이동은 세포외 자극, Bid의 분열을 유도한 세포사멸 관련 단백질(Bid, 사이토크롬 c) 및 미토콘드리아 내의 사이토크롬 c의 방출에 의해 활성화된다.
활성화된 세포사멸 관련 단백질은 이후에 그들의 신호를 예정된 세포 사멸을 시작하기 위해 카스파아제와 PARP를 통해 핵 내에서 세포 사멸 유전자의 발현하는 하류 신호 인자로 보낸다.
결론적으로, 이러한 결과는 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터의 막 단백질이 증가된 양의 세포사멸 관련 인자들을 촉진함을 나타낸다.
열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67의 단백질의 존재 하에 사이토크롬 c, Bcl-2, 카스파아제-8, 카스파아제-9, 카스파아제-3 및 PARP 신호는 감소한 반면에 Bax, t-Bid의 상대 강도는 증가했다.
이들을 종합하면, 열사멸 락토바실러스 플랜타룸 L67로부터 분리된 막 단백질은 HT-29 세포에서 세포사멸 인자 및 신호를 통해 세포 사멸을 유도한다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11522P
수탁일자 : 2014311

Claims (8)

  1. 열-불활성화 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P의 세포막으로부터 분리된 분자량 9 내지 18kDa의 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 열-불활성화 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P는 70 내지 130℃의 열을 5분 내지 120분간 처리한 것인 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 분자량 12kDa 또는 15kDa의 단백질인 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 암세포의 세포 사멸을 유도하는 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  5. 열-불활성화 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P의 세포막으로부터 분리된 분자량 9 내지 18kDa의 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 열-불활성화 락토바실러스 플랜타룸 CNU43(Lactobacillus plantarum CNU43) KCCM11522P는 70 내지 130℃의 열을 5분 내지 120분간 처리한 것인 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 단백질은 분자량 12kDa 또는 15kDa의 단백질인 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 단백질은 암세포의 세포 사멸을 유도하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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