KR20230138977A

KR20230138977A - 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20230138977A
Application number: KR1020220036998A
Authority: KR
Inventors: 김봉이; 김정우
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2023-10-05

Abstract

본 발명은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것으로서, 목통 추출물은 췌장암의 세포주인 panc-1에서 목동추출물의 농도 의존적으로 항암 활성을 확인하고, 세포사멸(apoptosis)이 자극하는 신호에 따라 활성화되는 Bax, ER stress로 인한 세포사멸 진행시 나타나는 CHOP의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과, 농도 의존적으로 Bax 및 chop의 발현이 증가하여 췌장암 세포주의 세포사멸을 유발하는 것을 확인하였다. 또한, JC-1 assay를 진행하여, 췌정암 세포주의 세포사멸의 미토콘드리아 막전위를 확인하여, 췌장암 치료 약학 조성물 및 건 강기능식품으로의 적용가능성을 확인하였다.

Description

목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing and treating pancreatic cancer comprising Akebiae Caulis extract as an active ingredient}

본 발명은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

목통은 으름덩굴 또는 기타 동속식물의 줄기로서 껍질을 제거하고 가로로 잘라서 만든 약재로서, 중국은 으름덩굴 및 같은 으름덩굴과의 삼엽목통, 백목통을 사용한다.

목통은 방광의 습열로 인한 신우신염, 방광염, 요도염으로 복수가 찰때, 심화로 입안에 발진이 날때, 가슴앓이, 소변이 붉을때, 마비동통에 사용한다. 약리작용은 이뇨작용, 진균억제작용이 보고되었다. 또한, 산후 유즙 분비를 촉진해서 젖이 잘 돌게 한다. 목통은 원형 또는 타원형의 자른 조각으로 바깥쪽의 코르크층은 회갈색이며 원형 또는 가로로 긴타원형의 피목(皮目)이 있다. 목부는 엷은 갈색의 도관부와 회백색의 방사조직이 엇갈려서 방사상으로 배열되어 일정한 배열 무늬를 보인다. 목통의 이명으로 만년등(萬年藤), 부지(附支), 정옹(丁翁), 통초(通草)라고도하며, 씨앗은 연복(燕覆)이라고 하고, 열매를 예지자(預知子)라고 부른다. 목통을 일본 각지에서 나므로, 화목통(和木通)이라 부르기도 한다.

생체 내의 세포들은 영원히 생존해 있는 것이 아니라 세포사멸(apoptosis)의 과정을 거쳐 제거된다. 그러나 암세포는 이러한 과정에서 벗어나 계속해서 분열한다. 그 결과 사멸해야 할 비정상 세포들이 계속 해서 증식하고, 전이되어 몸속에서 퍼지게 된다. 이러한 암세포를 제거하 기 위해서는 세포사멸을 유도해야 한다.

소포체(Endoplasmic Reticulum, ER)에서 unfolded protein이 축적되어 나타나는 반응은 unfolded protein response(UPR)인데 이러한 반응이 일어나도록 하는 자극들을 ER stress라고 부른다. 실험적으로는 ER은 산화적환경을 유지하고 있기 때문에 세포에 DTT나 beta-mercaptoethanol과 같은 환원제를 처리하면 UPR가 일어나게 된다. ER stress는 소포체가 처리할 수 있는 능력 이상의 단백질이 소포체 내로 유입되거나 소포체 내 칼슘이 고갈돼 소포체 기능에 장애가 발생하는 상태를 일컫는데, 이는 암의 발달과 유지에 영향을 주기 때문에 중요한 암 치료 타겟으로 생각되고 있다. ER stress가 심해 지면 손상된 세포를 제거하기 위해 세포사멸 (apoptosis)을 유도하게 되는데 이 과정에서 CHOP이 중요한 매개체로 작용한다.

또한, 세포 내의 미토콘드리아 pore(MOMP, mitochondria outermembrane pore)를 생성하는 Bax는 세포사멸이 자극하는 신호에 따라 활성화되는데, 이를 통해 세포사멸이 진행되는 것을 확인할 수 있다.

지금까지 췌장암(pancreatic cancer)은 초기 진단이 어렵고 주변 장기나 림프절로 쉽게 전이되는 특징이 있어 예후가 매우 좋지 않으며 수술로 절제하는 것이 가장 효과적인 치료법이지만, 10-20% 정도의 환자들 만이 수술이 가능한 것으로 알려져 있어 암 사망률이 매우 높은 공격적인 암 종으로 분류되어 있다. 또한, 수술을 받은 환자들 중에서도 공격적인 전이가 발생하면 일반적인 화학 요법이나 방사선 요법 등의 치료가 어려웠다.

췌장암 치료에 사용되는 많은 약물 치료법 중에서도 젬시타빈(gemcitabine) 치료법은 지난 20년간 췌장암 환자 치료에서 가장 일반적으로 사용되는 치료법으로 알려져 있다. 젬시타빈과 함께 다양한 약물과의 병용치료가 췌장암에서 사용되고 있지만, 그 효과는 미미하여 췌장암 환자들의 유의적인 생존율 증가에는 영향을 미 치고 있지 않다. 이후로 개발된 폴피리녹스(FOLFIRINOX)는 5-FU(5-fluorouracil), 류코보린 (leucovorin), 이리노테칸(irinotecan) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)의 4가지 약물의 조합으로 구성되어 있으며, 젬시타빈 단독과 비교하여 췌장암의 중앙 생존율을 증가시켰으며, 마찬가지로 알부민이 결합된 파클리탁셀(paclitaxel)과 젬시타빈의 병용치료도 젬시타빈 단독과 비교하여 췌장 암에서 중앙 생존율을 증가시키는 효과를 보였다. 하지만, 최종적으로 장기 생존율을 확인하였을때 이러한 약물의 병용 치료의 효과는 미미했고, 약물 독성으로 인한 부작용이 발생하기도 하였다.

이에 본 발명자들은 목통에 대한 생약 연구를 하던중, 목통이 Panc-1 세포주에서 암세포를 농도 의존적으로 세포사멸(apoptosis)를 유발하여 미토콘드리아의 효소활성을 감소 및 억제시키며 MMP(matrix metalloproteinase)에 영향을 끼쳐서 암세포의 전이 및 성장을 차단하는 효과를 확인하였다.

본 발명의 목적은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암 항암 보조제을 제공하는 것이다.

본 발명은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암 항암 보조제을 제공한다.

본 발명의 목통 추출물은 췌장암의 세포주인 panc-1에서 목동추출물의 농도 의 존적으로 항암 활성을 확인하고, 세포사멸(apoptosis)이 자극하는 신호에 따라 활성화되는 Bax, ER stress로 인한 세포사멸 진행시 나타나는 CHOP의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과, 농도 의존적으로 Bax 및 chop의 발현이 증가하여 췌장암 세포주의 세포사멸을 유발하는 것을 확인하였다. 또한, JC-1 assay를 진행하여, 췌정암 세포주의 세포사멸의 미토콘드리아 막전위를 확인하여, 췌장암 치료 약학 조성물 및 건강기능식품으로의 적용가능성을 확인하였다.

도 1은 목통 추출물 처리에 의한 췌장암 세포주 PANC-1의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 2는 목통 추출물 처리에 의한 췌장암 세포주 PANC-1의 세포사멸 관련 단백질 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 3은 목통 추출물 처리에 의한 췌장암 세포주 PANC-1의 JC-1 assay를 통해 미토콘드리아 막전위를 나타낸 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다, 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 사료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 췌장암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하여 췌장암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 췌장암 발병의 의심 개체에 투여하여 췌장암의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 창출으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 창출으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

췌장암은 악성 췌장 종양, 췌관선암 (Pancreatic ductal adenocarcinoma), 신경 내분비 종양 (Neuroendocrine tumor), 낭종성 췌장 종양, 점액성 낭성 종양(mucinous cystic neoplasm), 췌관내 유두상 점액종양(intraductal papillary mucinous neoplasm), 고형 가유두상 종양(solid pesudopapillary neoplasm)으로 분류될 수 있다.

췌장암을 연구하기 위한 세포주는 다양하며, 현재 일반적으로 PANC-1, AsPC-1 등을 포함하는 11개이상의 세포주를 이용하고 있다. 상기 각 세포주는 서로 다른 표현형과 유전형이 나타나고 이에 따라 종양 성장, 침습 및 전이 뿐만 아니라 화학요법과 약물 내성에 따른 특징이 상이한 것으로 알려져 있다(Pancreas. 2010 May; 39(4): 425-435.)

상기 조성물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출된 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 췌장암은 악성 췌장 종양, 췌관선암 (Pancreatic ductal adenocarcinoma), 신경 내분비 종양 (Neuroendocrine tumor), 낭종성 췌장 종양, 점액성 낭성 종양(mucinous cystic neoplasm), 췌관내 유두상 점액종양(intraductal papillary mucinous neoplasm), 고형 가유두상 종양(solid pesudopapillary neoplasm) 종양으로 이루어서 선택된 1종 이상인 것이나, 구체적으로 췌관선암인 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 췌장암 세포주의 세포사멸을 유발하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포사멸 유발은 Bax와 CHOP의 발현이 증가여 세포사멸을 증가시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 MMP 활성을 억제시켜, 암 전이 및 암세포 성장을 억제시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 미토콘드리아 막전위를 감소시켜 암 전이 및 암세포 성장을 조절하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조설물의 농도는 0~300㎍/ml인 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암 항암 보조제을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.

이하 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

[실시예]

실시예 1. 목통 추출물 제조

본 발명의 300g 목통(약원한약국, 서울특별시 동대문구 경희대로1가길 39지번서울특별시 동대문구 회기동 108-20 2층)을 25% 에탄올 5L로 48시간 추출 후 감압농축하여 사용하였으며, 강압 증류 후 무게는 28.08g이였고, 그 후 동결 건조를 진행하였고, 동결 건조 후 무게는 2.65g이였다.

실시예 2. 목통 추출물의 췌장암 세포주에 대한 세포 독성 확인

상기 실시예 1에서 제조한 목통 추출물의 췌장암 세포주에 대한 항암 활성을 확인하기 위하여, 췌장암 세포주인 PANC-1 세포주 (한국세포주은행) 100㎕를 96웰-플레이트에 1.3×10⁴세포/웰이 되도록 분주한 뒤, 10% inactivated fetal bovine serum 및 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM 배지에서, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)로 배양하였다. 배양한 96웰-플레이드에서 배지만 걷어내고 상기 실시예 1에서 제조한 목통 추출물을 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200㎍/ml의 농도로 각각 100㎕씩 처리한 뒤, 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 한 세포에 EZ-Cytox 시약 (DoGen)을 10㎕ 처리하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 한 뒤 마이크로플레이트 리더기 (Bio-rad Model 680)를 이용하여 450nm 파장대에서 흡광도를 측정함으로써 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, 목통 추출물은 농도 의존적으로 췌장암 세포주(PANC-1)에서 독성을 나타냄을 확인하였다(도 1).

실시예 3. 목통 추출물에 의한 췌장암 세포주의 세포사멸 유발 효과 확인

상기 실시예 1에서 제조한 목통 추출물이 췌장암 세포주의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위해, 세포사멸이 자극하는 신호에 따라 활성화되는 Bax, ER stress로 인한 세포사멸 진행시 나타나는 CHOP의 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.

췌장암 세포주인 PANC-1 세포주에 상기 실시예 1에서 제조한 목통 추출물을 0, 12 및 24 ㎍/ml로 각각 처리하고 24시간 동안 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터로 인큐베이션 후, 세포를 수집하여 PBS로 워싱하고, 세포 파쇄 버퍼 CETI Lysis Buffer with Inhibitor(TransLab, Korea)를 첨가하여 30분간 4℃에서 세포를 파쇄하였다. 세포파쇄물을 13,000 RPM에서 10분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거한 후, RC DC™ Protein Assay Kit II(protein assay kit) (Bio-rad, USA)를 사용하여 단백질을 정량하여 시료별 (목통 추출물 0, 12 및 24 ㎍/ml 처리군들)로 동일한 단백질의 양이 포함되도록 조절하였다. 준비된 단백질 시료에 5×로딩 다이를 넣고 5분 동안 95℃로 가열하여 단백질을 변성시켰다. 그 후, 10~12% SDS-PAGE 젤에 시료를 로딩하여 100V로 1시간 40분 동안 전기영동을 수행하였으며, 젤 위에서 분리된 단백질들을 280mA로 2시간 동안 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 단백질이 트랜스퍼된 멤브레인을 5% 탈지유가 포함된 TBST (tris buffered saline, pH 7.5) 용액으로 상온에서 1시간 동안 블로킹한 뒤 1차 항체 항-Bax(cell signaling), 항-CHOP(cell signaling) 을 각각 1:1,000으로 희석하여 블로킹한 멤브레인과 4℃에서 오버나잇으로 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 3회 워싱한뒤 horseradish peroxidase가 결합된 항-rabbit, mouse IgG를 1:10,000 으로 희석하여 상온에서 멤브레인과 1시간 동안 반응시킨 다음 TBST로 3회 워싱하였다. 워싱한 멤브레인을 chemiluminescent reagent와 1 내지 3분 동안 반응시키고 chemiluminescent western blot 이미징 장비(Corebiosystem, Korea)를 통해 단백질 밴드를 가시화하였다.

그 결과, 목통 추출물은 농도 의존적으로 Bax와 CHOP의 발현이 증가하여 목통 추출물이 췌장암 세포주의 세포 사멸을 유발하는 것을 확인 하였다(도 2).

실시예 4. 목통 추출물에 의한 췌장암 세포주의 미토콘드리아 막전위 확인

상기 실시예 1에서 제조한 목통 추출물이 췌장암 세포주의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위해, 미토콘드리아 막전위를 확인할 수 있는 JC-1 assay를 진행하였다.

미토콘드리아에 막을 투과하는 JC-1 dye를 이용하여 막을 잘 투과하여 dye들이 뭉쳐있으면 빨강계열의 형광을 보이며 세포가 죽거나 상태가 안좋게 되면 투과율이 떨어지게 되어서 dye가 적어지게 되는데 이때 초록색 계열의 형광을 나타내며 이러한 세포의 비율을 측정하여 나타낸다. 아무것도 처리를 안한 세포그룹에서 약품을 처리한 세포그룹을 나눈값으로 표시하며 녹색빛을 띄는 세포는 monomer라고 하며 빨강빛을 띄는 세포는 oligomer라고 한다. monomer/oligomer를 한 값이 JC-1값이다. 이러한 JC-1은 세포의 MMP(세포외기질 금속함유 단백분해효소)를 측정하는 분석법으로 암세포의 상태를 알 수 있다. MMP는 암세포의 침습과 전이에 주된 역할을 하며, 암치료에 있어서 가장 큰 장벽으로 작용한다. 만약 MMP를 억제하게 된다면 암세포가 성장 및 전이를 못하게 되는데 이러한 방식의 항생제가 많이 임상시험단계에 있는 상황이다. MMP를 억제하면 미토콘드리아 막의 탈분극을 유도하게 되고 이렇게 되면 제대로된 효소반응등을 할 수 없게되어 세포의 성장이 억제가 된다.

췌장암 세포주인 PANC-1 세포주 (한국세포주은행) 100㎕를 96웰-플레이트에 1.3×10⁴세포/웰이 되도록 분주한 뒤, 10% inactivated fetal bovine serum 및 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM 배지에서, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)로 배양하였다. 배양한 96웰-플레이드에서 배지만 걷어내고 1mM JC-1을 처리하여 10분 동안 반응시켰다. 그 후 다시 배지를 걷어내고 페놀 레드가 포함되지 않은 DMEM배지로 워싱해주었다. 상기 실시예 1에서 제조한 목통 추출물을 0, 12, 24㎍/ml의 농도로 각각 100㎕씩 처리한 뒤, 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 한 뒤 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 480nm와 530nm에서 monomer를, 535nm와 590nm에서 oligomer의 형광을 측정함으로써 미토콘드리아의 막전위를 확인하였다.

그 결과, 목통 추출물을 처리하였을 때 췌장암 세포에서 농도 의존적으로 녹색의 세포는 늘고 빨강색의 세포는 줄어든 결과가 나왔다. 이는 미토콘드리아의 막 단백질인 MMP가 문제가 생겨 JC-1 dye가 통과하지 못하게 된다는 의미로 따라서 목통 추출물이 MMP의 활동을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명의 목통 추출물은 췌장암 세포에 대하여 성장 및 전이를 차단하거나 억제하는 효능이 있다는 것을 확인 하였다(도 3).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

목통(Akebiae Caulis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 목통 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출된 것인, 췌장암 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 췌장암은 악성 췌장 종양, 췌관선암 (Pancreatic ductal adenocarcinoma), 신경 내분비 종양 (Neuroendocrine tumor), 낭종성 췌장 종양, 점액성 낭성 종양(mucinous cystic neoplasm), 췌관내 유두상 점액종양(intraductal papillary mucinous neoplasm), 고형 가유두상 종양(solid pesudopapillary neoplasm) 종양으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식품 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 췌장암은 췌관선암인 것인, 식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 췌장암 세포주의 세포사멸을 유발하는 것인, 식품 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 세포사멸 유발은 Bax와 CHOP의 발현이 증가하여 세포사멸을 유발 시키는 것인, 식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 MMP 활성을 억제시켜, 암 전이 및 암세포 성장을 억제시키는 것인, 식품 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 미토콘드리아 막전위를 감소시켜 암 전이 및 암세포 성장을 조절하는 것인, 식품 조성물.
제 1항에 있어서,
목통 추출물의 농도는 0~300㎍/ml인 것인, 식품 조성물.
목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
목통 추출물을 유효성분으로 포함하는 췌장암 항암 보조제.