KR102212276B1 - 쌍별귀뚜라미의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암 치료용 조성물 - Google Patents
쌍별귀뚜라미의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 경우, 대세포폐암 세포주에 대한 항암활성이 선암 세포주에 비해 우수한 것을 확인하여, 대세포폐암 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있다.
상기 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 경우, 대세포폐암 세포주에 대한 항암활성이 선암 세포주에 비해 우수한 것을 확인하여, 대세포폐암 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 쌍별귀뚜라미의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
식용곤충은 풍부한 영양을 보유하고, 좁은 사육공간으로서 다 수확이 가능하며, 자연 친화적이고 식품 및 약용으로서 사용이 가능한 특징을 가지며 최근 식품원료로서 사용된 기록, 안전성 및 독성이 없음을 입증하는 과학적인 자료를 기반으로 전문가를 통해 등록작업이 이루어져 왔다. 식용곤충은 최근 과자, 파스타, 순대, 수프, 환자영양식 등은 물론 가축과 반려동물 사료로도 활용범위를 넓혀가고 있고, 2020년에는 5천 363억원까지 성장할 전망이다. 귀뚜라미를 비롯한 곤충은 적은 양의 사료와 물로도 충분히 잘 자라고 식물의 잎과 유기농 부산물을 이용하여 사육할 수 있기 때문에 가축보다 적은 비용으로 고단백질을 생산할 수 있으며, 일부 곤충은 환경 친화적 새로운 식품 원료로 사육되고 있다. 쌍별귀뚜라미는 특히 월동기간을 거치지 않고 온도만 맞으면 사계절 번식이 가능하며 온도 조건에서 온도가 높아질수록 산란수가 증가하고 산란 후 2주 뒤에 부화하는 특징을 갖고 있어 생산관리 및 생산량 확보가 쉽다는 측면에서 식량자원으로의 활용이 유리하다. 쌍별귀뚜라미 암컷은 배 끝의 긴 바늘처럼 생긴 산란관으로 수분이 있는 흙속에 산란하며, 산란처가 없을 때에는 수분이 있는 종이나 천 등에 산란하기도 하기 때문에 흙, 상토, 오아시스 등 알받이를 제작하여 채란 받는 것이 가능하여 인공 대량증식의 장점이 있다. 또한 귀뚜라미의 경우, 다양한 영양성분, 즉 단백질 및 아미노산, 지방(불포화지방산, 올레인산 등), 다양한 무기질 등이 존재하고 있고, 키틴 및 키토산 등이 존재함으로 활용범위가 증가하고 있다.
한편, 최근 천연물질을 이용하여 새로운 유용성을 확인하고자 하는 연구가 진행되고 있는 바, 본 발명에서는 쌍별귀뚜라미의 항암활성을 확인하고자 하였다.
본 발명의 목적은 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암을 개선 또는 예방하기 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 쌍별귀뚜라미는 학명으로 Gryllus bimaculatus이며, 보다 구체적으로 Gryllus bimaculatus de Geer이다. 본 발명의 일실시예에서는 Gryllus bimaculatus de Geer 학명을 가지는 쌍별귀뚜라미를 이용하여 추출물을 제조하였다.
쌍별귀뚜라미는 17세기 유럽에서 결석의 치료 및 이뇨제로 사용하기도 하였고 일본에서는 설사, 이질 및 장티푸스를 치료하는데 사용하였으며 이외에도 알코올 분해 대사 촉진 효과가 알려져 있다. 쌍별귀뚜라미는 아열대성 곤충으로 라오스, 인도네시아, 말레이시아, 아프리카 등에 분포하여, 2000년 전후로 일본에서 애완동물의 먹이로 사용하던 것을 소량씩 국내로 가져와 애완동물의 먹이로서 또는 민간요법에서 동물류 전통약재로서 사용되어 왔다. 또한 미국, 덴마크, 태국 등에서 식품으로 요리 가공 판매되어왔다.
본 발명에서 용어, "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 추출물의 건조는 쌍별귀뚜라미로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행되거나, 동결건조 또는 드라이 오븐에서 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 쌍별귀뚜라미의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.
본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다.
본 발명에서 쌍별귀뚜라미 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득될 수 있다. 또한, 구체적으로 쌍별귀뚜라미 물 추출물일 수 있다.
본 발명의 용어 "폐암"과 관련하여, 폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 의미한다. 또한 상기 폐암은 암세포의 크기와 형태 등 병리조직학적 기준에 따라 소세포(小細胞)폐암과 비(非)소세포폐암으로 나뉜다. 현미경으로 확인되는 암세포의 크기가 작은 것은 한자의 '작을 소(小)' 자를 써서 소세포폐암이라 하고, 작지 않은 것은 비소세포폐암이라 한다. 발생하는 폐암의 80~85%를 차지하는 비소세포암은 대표적으로 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma)이 있다. 상기 비소세포암과 소세포암을 구분하는 것은 임상적 경과와 치료가 다르기 때문입니다. 비소세포암은 조기에 진단하여 수술적 치료를 하면 완치를 기대할 수 있다. 이와 달리 소세포암은 대부분이 진단 당시에 수술적 절제가 어려울 정도로 진행돼 있는 경우가 많으며, 급속히 성장하여 전신 전이가 되기도 한다.
상기 비(非)소세포폐암(non-small cell lung cancer) 중에서 편평상피암(squamous cell carcinoma)은 폐의 기관지 점막을 구성하는 편평상피세포가 변성해서 생긴다. 편평상피란 엷고 평탄한 형태를 지닌 상피를 총칭하는 말이며, 상피란 몸 바깥 표면의 세포층과, 체강(체벽과 내장 사이의 공간) 및 위장관의 내부 표면을 싸고 있는 세포층을 가리킨다. 편평상피세포암은 주로 폐 중심부에서 발견되며, 남자에게 흔하고 흡연과 관련이 많다. 기침, 객혈, 쌕쌕거리는 숨소리 등의 주된 증상은 종양이 주로 기관지를 막기 때문에 나타나는 현상이다.
상기 비(非)소세포폐암(non-small cell lung cancer) 중에서 선암(adenocarcinoma)은 특정 물질의 분비를 주된 가능으로 하는 인체의 선세포(腺細胞, 샘세포)에 생기는 암을 두루 이르는 말이다. 폐의 선암은 폐암 종류 가운데서 발생 빈도가 가장 높다. 폐 말초 부위에서 잘 생기고, 여성이나 담배를 피우지 않는 사람도 걸리며, 크기가 작아도 전이가 되어 있는 경우가 많다. 최근 들어 발생 빈도가 더 늘어나는 추세를 보이는데, 이는 담배에 함유된 타르 양의 변화, 흡연 습관, 흡연량, 식생활 변화 및 환경적작업적 요인과 관련이 있다.
상기 비(非)소세포폐암(non-small cell lung cancer) 중에서 대세포암(large cell carcinoma)은 폐암의 4~10% 정도를 차지하며 폐 표면 근처(폐 말초)에서 주로 발생하며, 절반 정도는 큰 기관지에 생긴다. 암세포가 대체적으로 크며, 그 일부는 빠르게 증식전이하는 경향이 있어서 다른 비소세포폐암들보다 예후가 나쁜 편이다. 본 발명에서 쌍별귀뚜라미 추출물을 포함하는 약학 조성물은 폐암 중에서 비소세포성 폐암을 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
또한, 비소세포성 폐암 중에서도 대세포폐암을 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
본 발명의 일실시예에서는 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물을 농도별로 처리한 경우, 250, 500, 1000 μg/ml로 처리 농도가 증가할수록 대세포폐암 세포주의 생존율이 저하됨을 확인하였으며, 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 달리 쌍별귀뚜라미 에탄올 추출물은 대세포폐암 세포주에 대한 항암 활성이 없는 것을 확인하였다. 또한, 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 에탄올 추출물 모두 비소세포성 폐암 중에서 선암 세포주에 대한 항암 활성이 없는 것을 확인하였다. 또한 이러한 대세포폐암 세포주에 대한 세포사멸은 caspase 활성 증가와 절단된 PARP 단백질의 발현 증가에 의한 것임을 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 비소세포성 폐암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 비소세포성 폐암 발병 의심 개체에 투여하여 비소세포성 폐암에 의한 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 상기 쌍별귀뚜라미 추출물을 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 쌍별귀뚜라미 추출물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 비소세포성 폐암 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암을 개선 또는 예방하기 위한 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 비소세포성 폐암을 개선 또는 예방하기 위한 식품 조성물은 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서, 상기 쌍별귀뚜라미 추출물, 폐암, 비소세포성 폐암, 예방에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서의 용어, "개선"은 상기 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 이용하여 예방 또는 치료되는 비소세포성 폐암과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
구체적으로, 본 발명의 상기 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 비소세포성 폐암의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 상기 쌍별귀뚜라미 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 상기 쌍별귀뚜라미 추출물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있는 바, 본 발명에서 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 상기 쌍별귀뚜라미 추출물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 연육, 연제품, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명은 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus)의 추출물을 포함하는, 비소세포성 폐암을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 경우, 대세포폐암 세포주에 대한 항암활성이 선암 세포주에 비해 우수한 것을 확인하여, 비소세포성 폐암 중에서 대세포폐암 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있다.
도 1은 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물을 24시간 또는 48시간 처리한 후 세포생존율을 측정한 것이다.
도 2는 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 24시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
도 3은 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 48시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
도 4는 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 80% 에탄올 추출물을 24시간 또는 48시간 처리한 후 세포생존율을 측정한 것이다.
도 5는 A549 선암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 24시간 배양하여 세포생존율(세포독성)을 측정한 것이다.
도 6은 A549 선암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 48시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
도 7은 H460 대세포폐암 세포주에서 쌍별귀뚜라미 물 추출물에 의한 Caspase 활성에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 2는 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 24시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
도 3은 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 48시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
도 4는 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 80% 에탄올 추출물을 24시간 또는 48시간 처리한 후 세포생존율을 측정한 것이다.
도 5는 A549 선암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 24시간 배양하여 세포생존율(세포독성)을 측정한 것이다.
도 6은 A549 선암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 48시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
도 7은 H460 대세포폐암 세포주에서 쌍별귀뚜라미 물 추출물에 의한 Caspase 활성에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1. 쌍별 귀뚜라미 물 추출물의 제조
냉동 건조한 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus) (10g)를 물 (90ml)에 넣고 100에서 3시간 교반 추출 후 진공감압 농축, 여과멸균, 동결 건조하여 쌍별귀뚜라미 물 추출물을 제조하였다.
비교예 1. 쌍별 귀뚜라미 에탄올 추출물의 제죠
냉동 건조한 쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus) (10g)를 80% 에탄올(90ml)에 넣고 100에서 3시간 교반 추출 후 진공감압 농축, 여과멸균, 동결 건조하여 쌍별귀뚜라미 80% 에탄올 추출물을 제조하였다.
실험예 1. 쌍별귀뚜라미 추출물의 대세포폐암 세포주에 대한 항암효과 측정
1-1. 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 대세포폐암 세포주에 대한 세포생존율 측정
쌍별귀뚜라미 추출물의 항암활성을 측정하기 위해 세포독성을 평가하였다. 먼저, 비소세포성 폐암 중 대세포폐암(large cell lung carcinoma) 세포주인 H460 세포주를 10% fetal bovine serum, penicillin 및 streptomycin 등이 혼합된 RPMI1640 배지 (welgene, Korea)를 이용하여 37, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
상기 H460 대세포폐암 세포주에 실시예 1의 쌍별귀뚜라미 물 추출물을 처리 후 24시간 또는 48시간 배양하여, MTT 시약의 첨가로 생긴 formazan을 microplate reader를 이용하여 570 nm로 측정하여 세포 생존율(세포 독성)을 평가하였다.
도 1은 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물을 24시간 또는 48시간 처리한 후 세포생존율을 측정한 것이다.
그 결과, H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물을 농도별로 처리한 경우, 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 농도가 250, 500, 1000 μg/ml로 증가할수록 대세포폐암 세포주의 생존율이 저하됨을 확인하였다. 특히, 24시간보다 48시간 처리할수록 생존율 감소 효과가 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
1-2. 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 에탄올 추출물의 대세포폐암 세포주에 대한 항암활성 비교
다음으로, 상기 H460 대세포폐암 세포주에 실시예 1의 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 비교예 1의 80% 에탄올 추출물을 처리 후 24 또는 48시간 배양하여, MTT 시약의 첨가로 생긴 formazan을 microplate reader를 이용하여 570 nm로 측정하여 세포 생존율(세포 독성)을 평가하였다.
도 2는 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 24시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
그 결과, 쌍별귀뚜라미 80% 에탄올 추출물과 달리, 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 농도가 250, 500, 1000 μg/ml로 증가할수록 대세포폐암 세포주의 생존율이 저하됨을 확인하였다.
도 3은 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 48시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
그 결과, 쌍별귀뚜라미 80% 에탄올 추출물과 달리, 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 농도가 250, 500, 1000 μg/ml로 증가할수록 48시간 배양에서 대세포폐암 세포주의 생존율이 저하됨을 확인하였다.
도 4는 H460 대세포폐암 세포주에 쌍별귀뚜라미 80% 에탄올 추출물을 24시간 또는 48시간 처리한 후 세포생존율을 측정한 것이다. 그 결과, 쌍별귀뚜라미 80% 에탄올 추출물의 경우, 24시간 배양과 48시간 배양 모두에서 H460 대세포폐암 세포주의 생존을 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
상기 실험예 1-1과 1-2를 통해, 쌍별귀뚜라미 물 추출물은 대세포폐암 세포주에 대한 항암 활성이 있으나, 에탄올 추출물은 항암 활성이 없는 것을 알 수 있었다.
실험예 2. 쌍별귀뚜라미 추출물의 선암 세포주에 대한 항암효과 측정
비소세포성 폐암 중 선암 세포주인 A549 세포주를 10% fetal bovine serum, penicillin 및 streptomycin 등이 혼합된 RPMI1640 배지 (welgene, Korea)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
상기 A549 선암 세포주에 실시예 1의 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 비교예 1의 80% 에탄올 추출물을 처리 후 24 또는 48시간 배양하여, MTT 시약의 첨가로 생긴 formazan을 microplate reader를 이용하여 570 nm로 측정하여 세포 생존율을 측정하였다.
도 5는 A549 선암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 24시간 배양하여 세포생존율(세포독성)을 측정한 것이다.
그 결과, 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물 모두 선암 세포주 성장을 억제하지 못하였다.
도 6은 A549 선암 세포주에 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물을 처리 후 48시간 배양하여 세포생존율을 측정한 것이다.
그 결과, 24시간 배양 결과와 마찬가지로, 48시간 배양하여도 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 80% 에탄올 추출물 모두 선암 세포주 성장을 억제하지 못하였다.
따라서, 쌍별귀뚜라미 물 추출물과 에탄올 추출물은 비소세포성 폐암 중에서 선암 세포주에 대한 항암 활성이 없는 것으로 확인되었다.
실험예 3. H460 대세포폐암 세포주에서 쌍별귀뚜라미 물 추출물이 Caspase활성에 미치는 영향
특정 단백질의 발현 변화 분석을 위해 pro-prep(invitrogen) solution을 사용하여 H460 대세포폐암 세포주에서 단백질을 분리하였다. 단백질 농도는 BCA정량법을 사용하였다. western blot analysis를 위해 동량의 단백질들을 sodium dodecyl sulfate(SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 분리하고 PVDF membrane으로 전이시켰다. 각각의 membrane에 적정 항체 및 enhanced chemiluminescence(ECL solution)용액을 이용하여 단백질들의 발현변화를 조사하였다. 본 실험에 사용된 1차 항체들은 cell signalling 에서 구입하였으며, 2차 항체들은 santa cruz에서 구입하였다.
Caspase는 세포가 정상적으로 생존 및 증식할 경우, 핵과 미토콘드리아의 외막에 불활성 상태인 proenzyme 형태로 존재하지만 다양한 세포 내외부 apoptosis의 자극으로 활성화되면 선택적 기질 단백질들의 분해를 유발함으로써 apoptosis를 촉진하는 역할을 한다. caspase는 extrinsic apoptosis pathway와 intrinsic apoptosis pathway의 initiator caspase인 caspase 8과 9, effector caspase인 3, 7 등으로 나뉘어지는데, 먼저 initiator caspase가 활성되면 하위단계의 effector caspase가 활성화되어 세포의 apoptosis를 유발한다. PARP는 활성화된 effector caspase에 의해 분해되는 대표적인 기질 단백질로 정상적인 DNA 수복이나 유전자 안정성 유지에 핵심인자로 작용하지만, 116 KDa의 분자량을 가진 PARP 단백질이 85 및 24 KDa의 단편으로 잘리게 되면 PARP 기능은 상실하게 되며 PARP 단편화는 Caspase활성 의존적 apoptosis 유발의 생화학적 표식자로 사용이 되고 있다.
따라서, 본 발명에서는 caspase, PARP 단백질들의 발현을 측정하기 위해 western blot을 실시하였다.
도 7은 H460 대세포폐암 세포주에서 쌍별귀뚜라미 물 추출물에 의한 Caspase 활성에 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다. 대세포폐암 세포주인 H460에서 쌍별귀뚜라미 물 추출물을 처리한 결과, 고농도로 처리할수록 caspase 3, 8, 9의 발현은 감소하고 cleaved caspase 3, 8, 9의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 절단된 PARP 단백질의 발현(89 KDa)도 증가되었다.
즉, 쌍별귀뚜라미 물 추출물 처리에 의해 대세포폐암 세포주인 H460에서 apoptosis(세포 사멸) 유도와 관련된 절단된 caspase 활성이 증가되고 절단된 PARP 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하여, 쌍별귀뚜라미 물 추출물은 apoptosis(세포 사멸) 유도를 통한 대세포폐암 세포주에 대한 항암효과를 가지는 것을 확인하였다.
결론적으로, 쌍별귀뚜라미 에탄올 추출물의 경우, 대세포폐암 세포주와 선암 세포주 모두에 대한 항암활성이 없었다. 이와 달리 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 경우, 대세포폐암 세포주에 대한 항암활성은 있으나, 선암 세포주에 대한 항암활성이 없는 것을 확인하여, 쌍별귀뚜라미 물 추출물의 항암 활성은 비소세포성 폐암 중에서도 대세포폐암 특이적인 것을 알 수 있었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (5)
- 쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus)의 물 추출물을 포함하는 약학 조성물로서,
절단된 Caspase 활성 및 절단된 PARP 단백질의 발현을 증가시켜 비세포성 폐암 중에서 대세포폐암을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물. - 삭제
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- 쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus)의 물 추출물을 포함하는 식품 조성물로서,
절단된 Caspase 활성 및 절단된 PARP 단백질의 발현을 증가시켜 비세포성 폐암 중에서 대세포폐암을 개선 또는 예방하기 위한 식품 조성물.
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