KR20240108816A

KR20240108816A - 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20240108816A
Application number: KR1020220190073A
Authority: KR
Inventors: 김원규; 권유진; 조수연; 강윤진; 권재영; 권학철; 이현성; 황호성; 이순광; 박인화; 백종권; 김동훈; 송성민; 이택주; 강정화; 김은정
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2024-07-10

Abstract

본 발명은 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 한대리곰취 부탄올 분획물, 한대리곰취 헥산 분획물, 곰취 헥산 분획물, 곤달비 지하부 부탄올 분획물, 또는 곤달비 지하부 헥산 분획물이 미만형 위암세포주 및 미만형위암 오가노이드 사멸 효과가 우수한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 조성물은 암, 특히 미만형 위암 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer containing Ligularia fischeri var. spiciformis Nakai extract, Ligularia fischeri extract or Ligularia stenocephala extract}

본 발명은 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

암은 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있으며 세계적으로도 질병 사망원인 중 제1위로 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나이다. 그러므로 전 세계적으로 암을 치유하기 위하여 치료제를 개발하기 위해 막대한 자본이 투자되고 연구되고 있는 실정이다. 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 발암물질로써 암을 유발하고 있으며 이렇게 다양한 유발인자들로 인해 치료제나 예방하는 방법이 어렵고 발생하는 부위가 다양하다. 또한 발생하는 부위가 다른 암의 종류마다 치료제가 다르게 사용되고 있다.

특히, 위암은 국내에 있어서 가장 높은 발병율을 보이는 암으로서, 예후가 나쁜 미만형 위암(diffuse type gastric cancer)은 전체 위암의 40%에 달하는 것으로 나타났다. 위암은 조직학적으로 흔히 장형(intestinal-type)과 미만형(diffuse-type) 위암으로 분류하여 언급된다. 장형 위암은 주로 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)에 의해 유발된 만성 위염에서 위축성 위염 및 장상피화생의 전암 점막 변화를 거쳐 발생하는 것으로 알려져 있는 반면에, 미만형 위암은 발생 원인이 명확하지 않으며, 일부 암에서는 CDH1, CLDN18 변이 등에 의한 것으로 알려져있다. 미만형 위암은 발생 과정에서 염증을 동반하지 않기 때문에 장형 위암과는 다른 특징을 보인다. 또한, 미만형 위암은 눈에 보이지 않을 정도로 작은 암세포가 위벽을 파고들며 점막 아래로 자라기 때문에 점막 표면의 변화가 뚜렷하게 나타나지 않고, 선종처럼 전암성 병변이 잘 확인되지 않는다. 그러면서도 증식 속도는 빨라 암이 발견되면 이미 진행되어 있는 경우가 많아 대부분이 3~4기로 발견되어 예후도 좋지 않다. 또한, 원격 전이의 가능성이 높고, 식도나 십이지장 등 인접한 부위로 쉽게 전이된다. 특히, 젊은 연령에서 발생하는 위암은 진행 및 전이속도가 빠른 미만형 위암이 60~70%를 차지하고 있어, 미만형 위암에 대한 젊은층의 각별한 관심과 주의가 요구된다 (김지현, Korean Journal of Helicobacter Upper Gastrointestinal Research, 22(1): 11-17, 2022).

한편, 한대리곰취(Ligularia fischeri var. spiciformis Nakai)는 국화과 곰취속으로, 기본종인 곰취에 비하여 머리모양꽃차례의 자루가 짧아 이삭꽃차례처럼 보이는 특징이 있다.

곰취(Ligularia fischeri (Ledeb.) Turcz.)는 국화과 곰취속에 속하는 여러해 살이 풀로서, 높이가 약 1 미터 정도까지 자라며, 진해, 거담, 진통, 혈액순환 촉진제로 이용된다.

곤달비(Ligularia stenocephala)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀로, 주로 깊은 산의 습지에 서식하며, 잎과 꽃이 곰취와 유사한 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명에서는 항암효과, 특히 미만형 위암에 대한 치료 효과가 우수한 천연물을 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 한대리곰취 부탄올 분획물, 한대리곰취 헥산 분획물, 곰취 헥산 분획물, 곤달비 지하부 부탄올 분획물, 또는 곤달비 지하부 헥산 분획물이 미만형 위암세포주 및 미만형위암 오가노이드 사멸 효과가 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

상술한 목적을 달성하기 위해,

본 발명은 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 한대리곰취 추출물은 한대리곰취 에탄올 추출물의 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물일 수 있으며,

상기 곰취 추출물은 곰취 에탄올 추출물의 헥산 분획물일 수 있고,

상기 곤달비 추출물은 곤달비 지하부 에탄올 추출물의 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물은 전체 조성물에 25 ~ 150 ㎍/㎖ 농도로, 바람직하게는 50 ~ 100 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 암은 미만형 위암일 수 있다.

본 발명에서는 한대리곰취 부탄올 분획물, 한대리곰취 헥산 분획물, 곰취 헥산 분획물, 곤달비 지하부 부탄올 분획물, 또는 곤달비 지하부 헥산 분획물이 미만형 위암세포주 및 미만형위암 오가노이드 사멸 효과가 우수한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 조성물은 암, 특히 미만형 위암 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 다양한 미만형 위암 세포주 및 장형 위암 세포주의 상피-간엽 전환 마커 발현 정도를 분석한 데이터이다.
도 2는 한대리곰취 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 항암 효과를 확인한 데이터이다.
도 3은 한대리곰취 분획물의 정상 세포에 대한 세포독성 정도를 확인한 데이터이다.
도 4는 한대리곰취 부탄올 분획물 및 한대리곰취 헥산 분획물의 미만형 위암 오가노이드 기반 항암 효과를 확인한 데이터이다.
도 5는 한대리곰취 부탄올 분획물 및 한대리곰취 헥산 분획물의 정상 오가노이드에 대한 세포독성 정도를 확인한 데이터이다.
도 6은 다양한 곰취속 추출물 및 이의 분획물들의 미만형 위암 세포주인 MKN1 세포에 대한 항암 효과를 확인한 데이터이다.
도 7은 다양한 곰취속 추출물 및 이의 분획물들의 미만형 위암 세포주인 SNU668 세포에 대한 항암 효과를 확인한 데이터이다.
도 8은 다양한 곰취속 추출물 및 이의 분획물들의 정상 세포인 HEK 세포에 대한 세포독성 정도를 확인한 데이터이다.
도 9는 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물의 미만형 위암 오가노이드 기반 항암 효과를 확인한 데이터이다.
도 10은 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물의 정상 오가노이드에 대한 세포독성 정도를 확인한 데이터이다.
도 11은 한대리곰취 부탄올 분획물의 다양한 암에 대한 항암효과를 확인한 데이터이다.
도 12는 한대리곰취 헥산 분획물의 다양한 암에 대한 항암효과를 확인한 데이터이다.
도 13은 곰취 헥산 분획물의 다양한 암에 대한 항암효과를 확인한 데이터이다.
도 14는 곤달비 지하부 부탄올 분획물의 다양한 암에 대한 항암효과를 확인한 데이터이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 일관점에서, 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다른 일관점에서, 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 한대리곰취 추출물은 한대리곰취 에탄올 추출물의 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물이며,

상기 곰취 추출물은 곰취 에탄올 추출물의 헥산 분획물이고,

상기 곤달비 추출물은 곤달비 지하부 에탄올 추출물의 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물은 전체 조성물에 25 ~ 150 ㎍/㎖ 농도로, 바람직하게는 50 ~ 100 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다. 상기 농도 범위 미만의 농도로 추출물이 포함되는 경우, 효과가 미미할 수 있으며, 상기 농도 범위를 초과하면 세포 독성이 나타날 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 미만형 위암인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 일구현예에서는, 세포독성 항암제 외에 치료제가 전무한 미만형 위암에 대한 신규 치료물질을 개발하기 위해, 무작위적 위암세포주 사용이 아닌 미만형 위암(EMT type) 및 장형 위암(비 EMT type)을 분류할 수 있는 다양한 EMT 마커 발현 분석을 수행하였으며(도 1), 다양한 위암 세포주 중 SNU668 세포 및 MKN1세포가 가장 미만형 위암의 표현형에 적합함을 검증 후 미만형위암 연구용 세포주를 선별하였다.

본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서는, 용매 종류에 따른 한대리곰취 추출물의 미만형 위암 세포주(MKN1, SNU668)에 대한 암세포 사멸 효과를 확인한 결과, 한대리곰취 부탄올 분획물 및 한대리곰취 헥산 분획물이 우수한 암세포 사멸능을 보이는 것을 확인하였으며(도 2), 정상세포에 대해서는 낮은 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3)

또한, 한대리곰취 부탄올 분획물 및 한대리곰취 헥산 분획물은 미만형 위암 오가노이드의 사멸을 촉진한 반면(도 4), 정상 위 오가노이드에 대한 세포 독성은 낮은 것을 확인하였다 (도 5).

본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 다양한 곰취속 추출물 및 이의 분획불들의 항암활성 및 정상세포에 대한 세포독성 정도를 비교한 결과, 곰취 헥산 분획물, 곤달비 지하부 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물이 미만형 위암 세포주에 대한 우수한 암세포 사멸능을 보이는 것을 확인하였으며(도 6 및 도 7), 정상세포에 대해서는 낮은 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 8).

또한, 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물은 미만형 위암 오가노이드의 사멸을 촉진한 반면(도 9), 정상 위 오가노이드에 대한 세포 독성은 낮은 것을 확인하였다 (도 10).

본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 한대리곰취 부탄올 분획물, 한대리곰취 헥산 분획물, 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물의 암종류에 따른 항암활성을 확인한 결과, 한대리곰취 부탄올 분획물, 한대리곰취 헥산 분획물, 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물은 미만형 위암 세포주를 효과적으로 사멸시키는 것으로 확인되었다 (도 11 ~ 도 14).

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을의미한다. 본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 1 ~ 10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

또한 상기 건강기능성 식품 조성물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있다. 구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강기능성 식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 10중량%, 바람직하 게는 0.01 ~ 0.1중량%로 포함된다.

본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

미만형 위암 세포주 선별

본 발명에서는 미만형 위암에 대한 신규 치료물질을 개발하기 위해, 무작위적 위암세포주 사용이 아닌 미만형 위암(EMT type) 및 장형 위암(비 EMT type)을 분류하고자하였다.

미만형 세포주는 SNU1, SNU668, MKN1, Hs746T 및 SNU484를 사용하였으며, 장형 위암 세포주는 MKN74, SNU719, NCI-N87, MKN28, SNU1967 및 SNU601를 사용하였다. 모든 세포주는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다.

세포주는 DMEM 및 RPMI 배지에 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 섞은 배양 배지에서 배양하였다. 웨스턴블랏은 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)과 함께 패시브 용해 버퍼(passive lysis buffer; Promega)를 사용하여 세포 용해물(cell lysate)를 제조하였다.

이후 단백질을 전기영동하여 막으로 옮기고 멤브레인은 EMT 마커 단백들에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그런 다음 멤브레인을 세척하고, 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, LAS 4000 미니 카메라(Fujifilm)로 웨스턴 블롯 이미지를 획득하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 다양한 EMT 마커 발현 분석을 통해 다양한 위암 세포주 중 SNU668과 MKN1이 가장 미만형 위암의 표현형에 적합함을 검증 후 미만형위암 연구용 세포주를 선정하였다.

다양한 곰취속 추출물 제조

2-1: 한대리곰취 추출물 제조

한대리곰취(Ligularia fischeri var. spiciformis Nakai)의 전초는 2020년 5월 한택식물원에서 채집하여 물로 충분히 세척하고 7일 동안 온풍(30 ℃) 건조하여 820.9 g의 건조된 식물체를 얻었다. 그 다음, 상기 건조된 식물체를 분쇄기에 넣어 분말화한 후 추출용기에 넣고 70% 에탄올 수용액 8.2 ℓ를 가한 후 상온에서 흔들어 교반하여 7일 동안 추출하는 것을 2번 반복하였다. 상기 혼합물을 0.34 mm의 필름 두께를 가지는 와트만(whatman) 종이 여과지와 유리 깔대기를 사용하여 중력 여과하는 과정을 통해 여과된 추출액을 수득하였다. 상기 여과된 추출액을 둥근 플라스크로 옮겨 감압 농축기에 넣고 감압 하에 35 ℃에서 용매를 완전히 증발시켜 농축하여 한대리곰취 추출물 73.0 g(이하 'BPLF00001'라고 함)을 수득하였다(수율 8.9%).

2-2: 한대리곰취 분획물 제조

상기 한대리곰취 추출물(BPLF00001) 73.0 g을 물 350 ㎖에 현탁시킨 후, n-헥산 525 ㎖을 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 3회에 걸쳐 분획을 실시하여 n-헥산 분획물(BPLF00002) 13.8 g을 수득하였다.

상기 분획 후 남은 물은 수포화된 n-부탄올 525 ㎖를 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 2회에 걸쳐 분획을 실시하여 n-부탄올 분획물(BPLF00003) 22.8 g을 수득하였고, 상기 분획 후 남은 물(BPLF00004; 38.0 g)은 동결 건조하여 보관하였다.

2-3: 곰취 추출물 제조

곰취(Ligularia fischeri (Ledeb.) Turcz.)의 전초는 2020년 5월 한택식물원에서 채집하여 물로 충분히 세척하고 7일 동안 온풍(30 ℃) 건조하여 823.8 g의 건조된 식물체를 얻었다. 그 후, 상기 건조된 식물체를 분쇄기에 넣어 분말화한 후 추출용기에 넣고 70% 에탄올 수용액 8.2 ℓ를 가한 후 상온에서 흔들어 교반하여 7일 동안 추출하는 것을 2번 반복하였다. 상기 혼합물을 0.34 mm의 필름 두께를 가지는 와트만(whatman) 종이 여과지와 유리 깔대기를 사용하여 중력 여과하는 과정을 통해 여과된 추출액을 수득하였다. 상기 여과된 추출액을 둥근 플라스크로 옮겨 감압 농축기에 넣고 감압 하에 35 ℃에서 용매를 완전히 증발시켜 농축하여 곰취 추출물(KGILF00001) 115.2 g을 수득하였다(수율 14.0%).

2-4: 곰취 분획물 제조

상기 곰취 추출물(KGILF00001) 115.2 g을 물 300 ㎖에 현탁시킨 후, n-헥산 450 ㎖을 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 3회에 걸쳐 분획을 실시하여 n-헥산 분획물(KGILF00002) 9.6 g을 수득하였다.

상기 분획 후 남은 물은 수포화된 n-부탄올 450 ㎖를 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 2회에 걸쳐 분획을 실시하여 n-부탄올 분획물(KGILF00003) 40.5 g을 수득하였고, 상기 분획 후 남은 물(KGILF00004)은 동결 건조하여 보관하였다.

2-5: 곤달비 추출물 제조

곤달비(Ligularia stenocephala (Maxim.) Matsum. & Koidz.)의 지상부와 지하부 추출물은 한국과학기술연구원의 천연물라이브러리로부터 제공받았다. 곤달비의 전초를 전초는 2016년 6월 강원도 노추산에서 채집하여 지상부와 지하부로 분류하였다. 물로 충분히 세척하고 7일 동안 온풍(30 ℃) 건조하여 건조된 식물체를 얻었다. 그 후, 상기 건조된 식물체를 분쇄기에 넣어 분말화한 후 추출용기에 넣고 100% 에탄올 수용액을 건조물 100 g 당 1 ℓ비율로 가한 후 상온에서 흔들어 교반하여 7일 동안 추출하는 것을 2번 반복하였다. 상기 혼합물을 0.34 mm의 필름 두께를 가지는 와트만(whatman) 종이 여과지와 유리 깔대기를 사용하여 중력 여과하는 과정을 통해 여과된 추출액을 수득하였다. 상기 여과된 추출액을 둥근 플라스크로 옮겨 감압 농축기에 넣고 감압 하에 35 ℃에서 용매를 완전히 증발시켜 농축하여 곤달비 지상부 추출물(BE0093A1), 곤달비 지하부 추출물(BE0093B1)을 얻었다.

2-6: 곤달비 분획물 제조

상기 곤달비 추출물(지상부BE0093A1) 300 mg을 물 20 ㎖에 현탁시킨 후, n-헥산 30 ㎖을 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 3회에 걸쳐 분획을 실시하여 n-헥산 분획물(BE0093A1-1) 22.1 mg을 수득하였다.

상기 분획 후 남은 물은 수포화된 n-부탄올 15 ㎖를 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 3회에 걸쳐 분획을 실시하여 n-부탄올 분획물(BE0093A1-2) 147.5 mg을 수득하였고, 상기 분획 후 남은 물(BE0093A1-3)은 동결 건조하여 보관하였다.

상기 곤달비 추출물(지하부BE0093B1) 200 mg을 물 20 ㎖에 현탁시킨 후, n-헥산 30 ㎖을 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 3회에 걸쳐 분획을 실시하여 n-헥산 분획물(BE0093B1-1) 15.1 mg을 수득하였다.

상기 분획 후 남은 물은 수포화된 n-부탄올 15 ㎖를 가하고 상온에서 흔들어 교반하여 2시간씩 3회에 걸쳐 분획을 실시하여 n-부탄올 분획물(BE0093B1-2) 30.3 mg을 수득하였고, 상기 분획 후 남은 물(BE0093B1-3)은 동결 건조하여 보관하였다.

용매 종류에 따른 한대리곰취 추출물의 항암 효과

본 발명에서는 용매 종류에 따른 한대리곰취 추출물의 미만형 위암 세포주(MKN1, SNU668)에 대한 암세포 사멸 효과를 확인하고자 하였다.

상기 실시예 2에서 추출한 한대리곰취 추출물 시료 처리에 따른 세포 성장 억제능을 평가하기 위해 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) 어세이를 수행하였다. 구체적으로, MKN1 및 SNU668 세포는 각 5000개씩 96-웰 플레이트에 시딩한 후 하루 동안 배양하였으며, 이후 실험군에 시료를 농도별로 처리한 후 72시간 동안 배양하고 50 μL의 MTT (2 mg/㎖) 염료를 추가하였다. 이후, 4시간 동안 추가로 인큐베이션 을 수행하고, 배지 제거 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 각 웰에 넣어 20분 동안 염료를 녹여준 후, 490nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 생존 정도를 분석하였다.

한대리곰취의 에탄올, 헥산, 부탄올, 물 추출물에 대한 미만형 위암 세포의 항암 효능을 비교한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, MKN1 세포에서 한대리곰취 에탄올 추출물에 비해 한대리곰취 헥산 분획물 및 한대리곰취 부탄올 분획물이 우수한 암 세포 사멸 효과를 보이는 것을 확인하였다. SNU668 세포 역시 한대리곰취 헥산 분획물 및 한대리곰취 부탄올 분획물에서 우수한 암 세포 사멸 효과를 보이는 것을 확인하였다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 한대리곰취의 헥산 분획물은 50 ㎍/㎖ 농도 이하에서 부탄올 분획물은 100 ㎍/㎖ 이하에서 정상 세포 HEK293에서 낮은 독성을 보임을 확인하였다.

한대리곰취 추출물의 미만형 위암 오가노이드에 대한 항암 효과

본 발명에서는 한대리곰취 부탄올 분획물 및 한대리곰취 헥산 분획물의 미만형 위암 환자로부터 제작한 종양 오가노이드 4케이스에 대한 항암 효과를 평가하였다.

먼저, 세브란스병원에서 확보한 수술 조직을 활용하여 4명의 미만형 위암 환자에 대한 오가노이드를 제작하였다. 내시경 생검 및 수술 검체를 대상으로 위암 병변에서 각각 0.3 ~ 0.5 cm 크기의 조직 샘플을 채취하여 항생제/항진균제가 포함된 배지로 3-4회 세척 후 콜라겐분해효소 용액(collagenase solution)과 반응시켜 상피 세포를 추출하였다.

추출된 상피세포를 마트리젤에 시딩(seeding) 후 상온에 15분동안 노출하여 젤화시키고 위 오가노이드 배양액을 첨가 후 CO₂ 배양기(incubator)에서에 정상 위상피, 미만형 위암 오가노이드를 배양하였다.

그 다음, 배양된 정상 위 상피 오가노이드 및 미만형 위암 오가노이드에 한대리곰취 부탄올 분획물 및 한대리곰취 헥산 분획물를 각각 처리한 다음, 상기 실시예 3과 같이 오가노이드 생존 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 한대리곰취 부탄올 분획물 및 한대리곰취 헥산 분획물은 50 ㎍/㎖ 이상에서 미만형 위암 오가노이드 사멸을 강력하게 촉진한 반면, 동일 농도에서 정상 위 오가노이드에 대한 독성은 낮은 것을 확인하였다. 특히, 한대리곰취 헥산 분획물은 5 ㎍/㎖ 농도에서도 암세포 사멸 효능을 보인 반면, 정상 위 오가노이드에 대한 독성은 거의 관찰되지 않았다.

다양한 곰취속 추출물의 항암 효과

본 발명에서는 다양한 곰취속 추출물의 항암활성 및 정상세포에 대한 세포독성 정도를 확인하였다.

상기 실시예 2에서 추출한 한대리곰취 부탄올 분획물, 한대리곰취 헥산 분획물, 곰취 에탄올 추출물, 곰취 헥산 분획물, 곰취 부탄올 분획물, 곰취 물 추출물, 곤달비(지상부) 에탄올 추출물, 곤달비(지상부) 헥산 분획물, 곤달비(지상부) 부탄올 분획물, 곤달비(지상부) 물 추출물, 곤달비(지하부) 에탄올 추출물, 곤달비(지하부) 헥산 분획물, 곤달비(지하부) 부탄올 분획물, 곤달비(지하부) 물 추출물을 이용하여, 각 추출물들의 미만형 위암 세포주(MKN1, SNU668)에 대한 암세포 사멸 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 곰취 헥산 분획물, 곤달비 지하부 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물이 미만형 위암 세포주에 대한 우수한 암세포 사멸능을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 곰취 헥산 분획물, 곤달비 지하부 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물은 활성농도에서 모두 정상세포에 대한 낮은 세포독성을 나타내었다.

곰취 추출물 및 곤달비 추출물의 미만형 위암 오가노이드에 대한 항암 효과

본 발명에서는 상기 실시예 5에서 미만형 위암 세포주에 대한 우수한 암세포 사멸능을 보인 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물의 미만형 위암 오가노이드에 대한 항암효과를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물은 50 ㎍/㎖ 농도 이상에서 우수한 미만형 위암 오가노이드 사멸능을 확인하였다. 또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물 모두 활성 농도에서 정상 위 오가노이드에 대한 세포 독성은 높지 않은 것으로 나타났다.

암종류에 따른 항암활성 확인

본 발명에서는 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 및 곤달비 추출물의 암 종류에 따른 항암활성을 확인하기 위해, 미만형 위암(diffuse gastric cancer), 장형 위암(intestinal gastric cancer), 간암(liver cancer), 대장암(colon cancer), 췌장암(parcreatic cancer)에 대한 항암 활성을 측정하였다.

미만형 위암은 MKN1 세포 및 SNU668 세포를, 장형 위암은 MKN74 세포주를, 간암은 SNU761 세포주를, 대장암은 HT-29 세포주를, 췌장암은 PANC-1 세포주를 사용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 모든 세포주는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다.

그 결과, 도 11 내지 도 14에 나타난 바와 같이, 한대리곰취 부탄올 분획물, 한대리곰취 헥산 분획물, 곰취 헥산 분획물 및 곤달비 지하부 부탄올 분획물은 다른 암종에 비해 미만형 위암에 보다 특이적으로 항암효과를 보이는 것으로 관찰되었다.

Claims

한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 한대리곰취 추출물은 한대리곰취 에탄올 추출물의 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물이며,
상기 곰취 추출물은 곰취 에탄올 추출물의 헥산 분획물이고,
상기 곤달비 추출물은 곤달비 지하부 에탄올 추출물의 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물은 전체 조성물에 25 ~ 150 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 암은 미만형 위암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
제5항에 있어서,
상기 한대리곰취 추출물은 한대리곰취 에탄올 추출물의 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물이며,
상기 곰취 추출물은 곰취 에탄올 추출물의 헥산 분획물이고,
상기 곤달비 추출물은 곤달비 지하부 에탄올 추출물의 헥산 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
제5항에 있어서,
상기 한대리곰취 추출물, 곰취 추출물 또는 곤달비 추출물은 전체 조성물에 25 ~ 150 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
제5항에 있어서,
상기 암은 미만형 위암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.