KR102487650B1 - 베르베린 및 스틸로핀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 베르베린(Berberine) 및 스틸로핀(Stylopine)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

베르베린 및 스틸로핀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition containing berberine and stylopine for the prevention and treatment of cancer}
본 발명은 베르베린(Berberine) 및 스틸로핀(Stylopine)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 베르베린(Berberine) 및 스틸로핀(Stylopine)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
꽃양귀비(Common poppy)는 양귀비과(Papaveraceae) 양귀비속(Papaver)에 속하는 식물이다. 양귀비속은 세계적으로 80여종이 있으며 이 중 마약성분이 들어있는 양귀비는 4종이 있다. 꽃양귀비는 마약성분이 들어 있지 않아 관상용(원예용)으로 널리 재배되며 개양귀비, 털양귀비, 두메양귀비, 우미인초 등의 이름으로 불린다. 파파베르 로에아스(Papaver rhoeas L.) 아이슬랜드 양귀비(Papaver nudicaule L.), 오리엔탈 양귀비(Papaver orientale L.)가 대표적이며 포기 전체에 털이 있어 아편양귀비(Papaver somniferum)와 구별된다.
꽃양귀비는 키가 30~80cm로 자라고 6~8월경에 5~6cm 크기의 4판화의 꽃이 피며, 꽃 색깔은 분홍, 붉은색, 자주, 노랑, 백색 등의 여러 색깔이 있다. 꽃봉오리일 때 밑을 보고 있고 꽃이 진 후의 열매는 아편처럼 부풀지 않는다. 꽃양귀비의 전초는 진정, 최면, 진통 작용 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 알칼로이드류, 안토시아닌류, 페놀계 화합물 등의 다양한 피토케미컬을 가지고 있어 아편양귀비와 달리 재배가 가능한 꽃양귀비를 활용하여 항산화, 항균, 항염, 항섬유화 및 피부보호 등의 효능으로 활용가능성이 무궁무진하다.
그러나 아직까지 재배용 꽃양귀비의 여러 품종을 대상으로 의약학, 건강기능식품 또는 화장료로서의 활성 성분에 대한 연구가 활발하지 못한 실정이다.
특히, 꽃양귀비 추출물에 존재하는 다양한 천연 생리활성 물질을 이용하여 우수한 항암 효과를 나타내는 물질 또는 물질의 조합물에 대한 연구가 필요하나, 관련 연구가 부진한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1692032호(2017.01.03. 공고) 의학신문 “꽃양귀비 잎에서 의약소재 대사물질확인” 관련 인터뷰(2017.05.11.) “알칼로이드 생합성 작물의 오믹스정보 분석 및 의?e소재 활용기반 구축” 최종보고서(2019. 02.11.)
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 꽃양귀비 추출물에 존재하는 다양한 천연 생리활성 물질들 중에서 조합하여 사용시 우수한 항암 활성을 나타내는 물질 조합을 찾아내어, 그러한 조합(혼합)된 물질을 이용한 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
더 구체적으로, 본 발명은 꽃양귀비 추출물 유래 물질을 단독으로 사용하는 것과 대비하여 유의하게 향상된 항암 활성을 나타태는 조합(혼합)된 물질을 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 꽃양귀비 추출물에 존재하는 다양한 생리활성물질의 항암 활성에 대하여 연구하던 중 베르베린 및 스틸로핀을 특정 중량비로 포함하는 경우 다양한 암포세주에서 항암 활성이 단독 화합물에 비해 현저히 더 우수하게 나타나는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일 양태에서, 본 발명은 베르베린(Berberine) 및 스틸로핀(Stylopine)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물로서, 베르베린 및 스틸로핀을 3:7 내지 7:3의 중량비로 포함하는 것인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
한 실시형태에서, 3:7 또는 7:3의 중량비로 베르베린 및 스틸로핀의 혼합(중량)비는 3:7 또는 7:3이다.
한 실시형태에서, 베르베린 및 스틸로핀은 꽃양귀비 추출물로부터 얻어질 수 있다.
본 발명에서 꽃양귀비는 파파베르 로에아스(Papaver rhoeas) 및 파파베르 파우리에이(Papaver fauriei)일 수 있다.
본 발명에서 꽃양귀비는 발아 후 10일 내지 120일이 경과한 것일 수 있다.
본 발명에서 꽃양귀비는 암모니아와 에틸에테르를 5~20 : 95~80 혼합비로 혼합한 혼합용매로 추출할 수 있다.
본 발명에서 암은 췌장암(Pancreatic cancer), 대장암(Colon cancer), 유방암(Breast cancer), 폐암(Lung cancer) 및 전립선암(Prostate cancer)으로 이루어지는 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 암은 대장암(Colon cancer), 유방암(Breast cancer), 폐암(Lung cancer) 및 전립선암(Prostate cancer)으로 이루어지는 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 베르베린(Berberine) 및 스틸로핀(Stylopine)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물로서, 베르베린 및 스틸로핀을 3:7 내지 7:3의 중량비로 포함하는 것인, 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 베르베린 및 스틸로핀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암세포 사멸을 유도함으로써 췌장암, 대장암, 유방암, 폐암 및 전립선암 등의 암을 예방, 치료 또는 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 꽃양귀비에서 유래된 베르베린 및 스틸로핀의 단독 사용 대비 향상된 항암 활성을 갖는 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 파파베르 로에아스(Papaver rhoeas) 1품종(RR), 파파베르 누디카울레(Papaver nudicaule) 5품종(NW, NO, NY, NS 및 NP) 및 파파베르 파우리에이(Papaver fauriei) 1품종(FW)과 아편양귀비(Papaver somniferum, PS) 추출물에서 확인된 각각의 베르베린, 스틸로핀, 알로크립토핀, 프로토핀, 테트라하이드로베르베린 및 디하이드로베르베린을 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 발아 후 60일 및 90일 경과된 파파베르 로에아스 추출물의 항암 활성 분석 결과, 검증에 사용된 암세포주 및 IC50값을 나타낸 것이다(a: 췌장암, b: 대장암 및 폐암, c: 유방암 및 전립선암).
도 3a 내지 3c는 발아 후 60 및 90일이 경과된 파파베르 파우리에이 추출물의 항암 활성 분석결과, 검증에 사용된 암세포주 및 IC50값을 나타낸 것이다(a: 췌장암, b: 대장암 및 폐암, c: 유방암 및 전립선암).
도 4a 및 도 4b는 꽃양귀비 추출물에서 정제분리한 6가지 생리활성물질의 췌장암 세포주에 대한 항암 활성 분석결과 및 IC50값을 나타낸 것이다(a: MIA PaCa-2, BxPC-3, b: AsPC-1, PANC-1).
도 5a 및 5b는 꽃양귀비 추출물에서 정제분리한 6가지 생리활성물질의 대장암 세포주에 대한 항암 활성 결과 및 IC50값을 나타낸 것이다(a: HCT116, b: HT29, SW480).
도 6은 꽃양귀비 추출물에서 정제/분리한 6가지 생리활성물질의 유방암 세포주 MCF-7에 대한 항암 활성 측정 결과 및 및 IC50값을 나타낸 것이다.
도 7은 꽃양귀비 추출물에서 정제분리한 6가지 생리활성물질의 폐암 세포주 A549 및 H1299에 대한 각각의 항암활성 및 및 IC50값을 나타낸 것이다.
도 8은 꽃양귀비 추출물에서 정제분리한 6가지 생리활성물질의 전립선암 세포주 PC-3에 대한 항암활성 및 IC50값을 나타낸 것이다.
도 9는 발아 후 60일 및 90일 경과된 꽃양귀비 추출물 2품종(파파베르 로에아스, 파파베르 파우리에이)의 세포독성 분석결과를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 도 10d는 베르베린 및 스틸로핀을 특정 혼합(중량)비로 포함하는 조성물의 췌장암 세포주에 대한 항암 활성 시너지 효과를 나타낸 것이다(a:PANC1, b: MIA-PaCa-2, c: BxPC3, d: AsPC1).
도 11a 및 도 11b는 베르베린 및 스틸로핀을 특정 혼합(중량)비로 포함하는 조성물의 폐암 세포주에 대한 항암 활성 시너지 효과를 나타낸 것이다(a: H1299, b: A549).
도 12a 내지 도 12c는 베르베린 및 스틸로핀을 특정 혼합(중량)비로 포함하는 조성물의 대장암 세포주에 대한 항암 활성 시너지 효과를 나타낸 것이다(a: HCT116, b: HT-29, c: SW480).
도 13은 베르베린 및 스틸로핀을 특정 혼합(중량)비로 포함하는 조성물의 전립선암 세포주(PC-3)에 대한 항암 활성 시너지 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 베르베린 및 스틸로핀을 특정 혼합(중량)비로 포함하는 조성물의 유방암 세포주(MCF-7)에 대한 항암활성 시너지 효과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 실시형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시형태에 한정되지 않는다. 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 동일한 도면 부호를 붙였다.
또한, 본 발명에서 수치와 관련하여 용어 "약(about)", "대략(approximately)" 또는, 적어도(at least)와 같은 유사한 표현이 사용되는 경우, 해당 수치를 기준으로 ±10%, ±7%, ±5%, ±3%, ±2%, 또는 ±1%의 이론적, 실험적, 통계적, 또는 경험칙상의 오차가 허용되는 것으로 의도된다.
본 발명은 꽃양귀비로부터 유래된 베르베린 및 스틸로핀의 조합에 따른 항암 시너지 효과에 관한 것이다.
일양태에서 본 발명은 베르베린(Berberine) 및 스틸로핀(Stylopine)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물로서, 베르베린 및 스틸로핀을 3:7 내지 7:3의 중량비로 포함하는 것인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 암 예방 및 치료용 약학 조성물은 베르베린 및 스틸로핀을 3:7 또는 7:3의 중량비로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1: 1.5~2.5 또는 1.5~2.5:1의 중량비로 포함할 수 있다. 또한, 베르베린은 파파베르 로에아스로부터 얻어진 것일 수 있으며, 스틸로핀은 파파베르 파우리에이로부터 얻어진 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “꽃양귀비”는 재배, 유통을 금지한 마약성 양귀비를 제외하고 원예용, 조경용 또는 길꽃용으로 재배가 가능한 모든 양귀비를 지칭한다. 야생 상태의 꽃양귀비는 주로 노란색과 흰색의 꽃을 피우지만, 육종을 통하여 야생의 색 외에 진홍색, 자색, 분홍색, 주황색 등 다양한 꽃색을 갖게 되었다.
또한, 꽃양귀비는 꽃색을 기준으로 파파베르 로에아스(Papaver rhoeas) 1품종(붉은꽃), 파파베르 누디카울레(Papaver nudicaule) 5품종(흰꽃, 주황꽃, 노란꽃, 진홍꽃, 분홍꽃) 및 파파베르 파우리에이(Papaver fauriei) 1품종(노란꽃) 등 총 7가지 품종을 사용하였다. 파파베르 로에아스(Papaver rhoeas)는 대표적인 꽃양귀비이며 일반 양귀비, 잉글랜드 양귀비, 콘양귀비, 들양귀비 등으로 일컬어진다. 파파베르 누기카울레(Papaver nudicaule)는 아이슬란드 양귀비로도 일컬어지며, 유사한 파파베르 크로세움(Papaver croceum)과 구분되는 품종이다. 파파베르 파우리에이(Papaver fauriei)는 일본 또는 러시아에 서식하는 양귀비속으로 알려져 있다.
본 발명에서 꽃양귀비는 30일 내지 90일 경과시점에서 아편양귀비 보다 베르베린, 스틸로핀, 알로크립토핀, 프로토핀, 테트라하이드로베르베린 및 디하이드로베르베린을 포함하는 알칼로이드류를 가장 안정적으로 생합성할 수 있으며, 베르베린 및 스틸로핀의 경우 약 90일 경과시점에 생합성이 가장 활발히 이루어진다.
따라서, 본 발명에서 꽃양귀비 또는 그 일부분은 발아 후 10일 내지 120일이 경과한 것일 있으며, 바람직하게는 30일 내지 90일 경과한 것일 수 있다.
본 발명에서 꽃양귀비는 꽃양귀비 추출물일 수 있으며, 꽃양귀비의 전체 또는 일부분, 예컨대 꽃, 줄기, 잎, 뿌리, 전초, 또는 이들의 혼합물을 사용하여 추출한 것일 수 있으며, 구체적으로 꽃양귀비의 잎, 줄기 및 이들의 혼합물일 수 있다. 잎 및 줄기의 혼합물의 경우, 꽃봉오리가 있거나 또는 없는 것 모두 사용할 수 있다. 다만, 꽃양귀비에 꽃봉오리가 생성되면 알칼로이드류 성분들의 생성보다 개화에 필요한 성분들이 더 많이 생성되게 되므로, 꽃봉오리가 생기기 전의 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 꽃양귀비 추출물은 꽃양귀비 또는 그 일부분의 조추출물 또는 이의 농축물일 수 있으며, 물, 알코올 또는 유기용매 추출물을 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 알코올 또는 유기용매 추출물, 조추출물 또는 이의 농축물일 수 있다.
본 발명에서 유기용매는 헥산, 아세트산에틸, 디클로로메탄, 에테르, 클로로포름 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올은 무수 또는 함수 알코올을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 n-부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 또는 메탄올일 수 있으며 더욱 바람직하게는 50 내지 100부피%의 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.
본 발명에서 유기용매로 바람직하게는 에틸에테르를 사용할 수 있다. 에틸에테르 단독으로 또는 암모니아와 함께 사용할 수 있으며, 바람직하게는 암모니아와 에틸에테르를 5~20: 95~80 혼합비로 혼합한 혼합용매를 사용할 수 있고, 추출 온도는 25 내지 100℃일 수 있다.
본 발명에서 추출물의 추출방법으로 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각수추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법이 사용될 수 있으며 바람직하게는 용매추출 후 초음파을 병행하는 추출방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 꽃양귀비 추출물은 당업계에서 알려진 통상의 방법으로 적절한 온도(예컨대, 상온)에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상의 추출물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무건조 또는 동결건조할 수 있다. 아울러, 상기와 같이 추출된 추출물을 감압증류 및 동결건조 또는 분무건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수도 있다.
또한, 꽃양귀비 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획물로도 얻을 수 있다.
본 발명에서 꽃양귀비로부터 추출된 베르베린 및 스틸로핀 각각의 함량은 전체 약학 조성물에 대해 0.00001 내 50 중량%, 바람직하게는 각각 0.5 내지 25 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 꽃양귀비로부터 추출된 베르베린 및 스틸로핀은 암세포 사멸을 유도함으로써 우수한 항암활성을 나타내어 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용할 수 있다. 또한, 본 발명에서 암은 신체 어느 부위든지 발생하는 모든 암일 수 있으며, 바람직하게는 췌장암(Pancreatic cancer), 대장암(Colon cancer), 유방암(Breast cancer), 폐암(Lung cancer) 및 전립선암(Prostate cancer)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 '예방'은 베르베린 및 스틸로핀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 암을 억제, 지연시키는 모든 행위를 의미하고, '치료'는 해당 암 및 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변화되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 베르베린 및 스틸로핀을 유효성분으로 포함하는 조성물 이외에 추가로 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하게 사용할 수 있다.
다른 양태에서 본 발명은 베르베린 및 스틸로핀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 구체적으로, 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물은 베르베린 및 스틸로핀을 3:7 내지 7:3의 중량비로 포함한다. 더욱 구체적으로 베르베린 및 스틸로핀을 3:7 또는 7:3의 중량비로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1: 1.5~2.5 또는 1.5~2.5:1의 중량비로 포함할 수 있다.
건강기능식품 조성물은 음료, 환, 정제(tablet), 캡슐제(capsule), 산제 중에서 선택된 어느 하나로 제조하거나, 식품의 성분으로 첨가하여 제조될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 일례로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 꽃양귀비 추출물의 제조
1-1. 재료
국내 재래종인 파파베르 로에아스 1종(1품종)과 꽃색이 다른 파파베르 누디카울레 1종(5품종), 그리고 파파베르 파우리에이 1종(1품종)의 잎 부위를 발아된 시점을 기준으로 30일, 60일, 90일로 구분하여 시료로 사용하였다(표 1).
학명 ID 발아 후
30일 		발아 후
60일 		발아 후
90일
파파베르 로에아스(붉은꽃)Papaver rhoeas (red) RR RR30 RR60 RR90
파파베르 누디카울레(흰꽃)Papaver nudicaule (white) NW NW30 NW60 NW90
파파베르 누디카울레(주황꽃)Papaver nudicaule (orange) NO NO30 NO60 NO90
파파베르 누디카울레(노란꽃)Papaver nudicaule (yellow) NY NY30 NY60 NY90
파파베르 누디카울레(진홍꽃)Papaver nudicaule (scarlet) NS NS30 NS60 NS90
파파베르 누디카울레(분홍꽃)Papaver nudicaule (pink) NP NP30 NP60 NP90
파파베르 파우리에이(노란꽃)Papaver fauriei (yellow) FW FW30 FW60 FW90
파파베르 솜니페룸(붉은꽃)Papaver somniferum (red) PS PS30 PS60 PS90
1-2. 추출용매별 추출물 제조 및 추출효율 비교
표 1의 시료로부터 원하는 성분을 가장 효율적으로 추출할 수 있는 용매를 확인하고자 5가지 각기 다른 용매(50% 메탄올, 80% 메탄올, 100% 메탄올, 100% 에탄올 및 에틸에테르+10% 암모니아 용액)를 이용하여 추출을 진행하였다.
7품종에서 생육 시기별로 채취한 잎 시료를 5, 10 및 20 mg 준비하여 2 mL 에펜도르프 튜브에 담고 5가지 각각의 용매 1mL를 가하여 30초간 회전(Vortexing)한 다음 상온에서 30분간 초음파를 이용하여 추출하였다.
휘발성이 강한 에틸에테르를 추출용매로 사용한 경우는 추출 후 바로 농축을 진행하고 100% 메탄올로 재용해하였다. 그 다음, 추출액을 0.2 μm 공극 크기를 가진 시린지 필터를 이용하여 필터링 한 후, 통과한 여과액을 1mL 용량의 바이얼에 담아 분석을 진행하였다.
모든 시료에 존재하는 프로토핀 성분을 기준으로 분석해 추출용매의 최적화 정도를 확인하였다. 표 2를 참고하면, 모든 시료에서 프로토핀이 검출되었으며 프로토핀 피크 영역을 이용하여 추출 용매에 따른 효율성을 비교하였다.
추출용매조건 354.0/ 188.2 354.0/ 189.2 354.0/ 149.1 354.0/ 91.1
50% Methanol (5) 124000 (5) 131300 (5) 61337 (5) 29733
80% Methanol (3) 144300 (3) 151367 (3) 75333 (3) 34160
100% Methanol (4) 140067 (4 149933 (4) 68673 (4) 32503
100% Ethanol (2) 177333 (2) 185300 (2) 83740 (2) 39467
Ethylether + 10% ammonia (1) 211933 (1) 223433 (1) 102073 (1) 49510
생성물 이온(Q3)의 영역값이 에틸에테르 + 10% 암모니아 > 100% 에탄올 > 80% 에탄올 > 100% 메탄올 > 50% 메탄올 순으로 나타났으며, 에틸에테르를 이용한 추출법이 추출효율 측면에서 가장 우수한 것을 확인하였다.
1-3. 추출물의 생합성분 분석
생육시기에 따른 각 품종별 추출물에서 확인된 주요 생리활성물질과 생육시기별 함량을 도 1에 나타내었다.
주요 생리활성물질은 베르베린, 스틸로핀, 알로크립토핀, 프로토핀, 테트라하이드로베르베린, 디하이드로베르베린, 도파민, 로에아딘 등 8가지 성분이다. 이 중 항암 활성을 나타내는 베르베린, 스틸로핀, 알로크립토핀, 프로토핀, 테트라하이드로베르베린 및 디하이드로베르베린의 생육시기별 생합성률을 분석하였다.
도 1을 참조하면, 베르베린은 파파베르 로에아스, 파파베르 파우리에이, 파파베르 누디카울레에서 생합성되는 것을 확인하였으며, 3 종 모두에서 발아 후 90일 경과시점에 생합성이 활발하게 이루어짐을 확인하였다. 스틸로핀은 파파베르 파우리에이를 제외하고 모든 종에서 생합성되는 것을 확인하였고, 주요하게는 마약성 양귀비 보다 더 많은 양이 파파베르 로에아스에서 생합성되는 것을 확인하였다. 또한, 스틸로핀의 가장 안정적인 생합성 시점은 베르베린과 동일하게 발아 후 90일인 것을 확인하였다.
알로크립토핀은 파파베르 로에아스를 제외하고 모든 종에서 생합성되는 것을 확인하였고, 주요하게는 마약성양귀비 보다 더 많은 양이 꽃양귀비에서 생합성되는 것을 확인하였으며, 안정적인 물질 생합성 시점은 조사기간인 30 내지 90일 모든 시점에서 생합성이 원활함을 확인하였다. 프로토핀은 모든 종에서 생합성되는 것을 확인하였으며, 주요하게는 마약성 양귀비 보다 더 많은 양이 꽃양귀비에서 생합성되는 것을 확인하였다. 안정적인 물질 생합성 시점은 조사기간인 30 내지 90일의 기간에 걸쳐 생합성이 활발하게 이루어짐을 확인하였다. 테트라하이드로베르베린은 모든 종에서 생합성이 되나 마약성 양귀비 보다 적은 양으로 생합성되는 것을 확인하였고, 꽃양귀비 종간에서는 파파베르 로에아스에서 가장 많이 생합성되는 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로, 디하이드록시베르베린은 파파베르 파우리에이에서 마약성양귀비 보다 높은 함량과 안정적인 양으로 생합성되는 것을 확인하였고 시기도 발아 후 30일부터 120일까지 지속됨을 확인할 수 있다.
종합해보면, 꽃양귀비 7품종은 마약성양귀비 보다 높은 생합성률로 베르베린, 스틸로핀, 알로크립토핀, 프로토핀, 테트라하이드로베르베린 및 디하이드로베르베린 등의 알칼로이드 성분을 다량 함유하는 것을 확인하였다.
즉, 재배가 가능한 꽃양귀비를 이용하여 항암 치료 또는 개선용 의약품 및 건강기능식품의 원료로 산업적 활용이 가능함을 확인하였다.
실시예2. MTT 검정을 이용한 항암 효능 확인
상기 시료로부터 수득한 추출물의 항암 효능을 검정하기 위해 사용된 암세포주는 표 3에 나타난 바와 같다.
암(Cancer) 종류 사용된 암세포주(Cell line)
유방암(Breast Cancer) MCF-7, MDA-MB-231
폐암(Lung Cancer) A549, H1299
전립선암(Prostate Cancer) PC-3
췌장암(Pancreatic Cancer) PANC-1, AsPC-1, MIA PaCa-2, BxPC-3
대장암(Colon Cancer) HCT116, HT29, SW480
MTT 분석방법을 이용하여, 추출물의 세포 독성 및 암세포 사멸효능을 확인하였으며, 처리시간은 72시간으로 하였다.
2-1. 추출물별 항암 효능 검정
5종의 암 세포주(췌장암, 폐암, 대장암, 유방암 및 전립선암)에 대해 꽃양귀비 (파파베르 로에아스, 파파베르 파우리에이) 추출물의 항암 활성을 분석하여 도 2 및 도 3에 그 결과를 나타내었다.
도 2를 참고하면, 파파베르 로에아스는 폐암(Lung cancer)과 전립선암(Prostate cancer)에 대해 발아 후 60일 경과시점(RR60) 추출물에서 가장 높은 항암 활성을 보였으며, 췌장암(Pancreatic cancer), 대장암(Colon cancer) 및 유방암(Breast cancer)에 대해 발아 후 90일 경과시점(RR90) 추출물에서 가장 높은 항암 활성을 보였다.
도 3을 참고하면, 파파베르 파우리에이는 췌장암(AsPC-1세포주)에 대해 발아 후 60일 경과시점 추출물이 가장 높은 항암 활성을 보였으며, 이 밖에 다른 췌장암(MIA PaCa-2), 유방암, 대장암, 폐암 및 전립선암에 대해 발아 후 90일 경과시점 추출물이 가장 높은 항암 활성을 나타내었다.
2-2. 정제분리한 생리활성물질별 항암 효능 검정
실시예 1-3에서 확인한 알칼로이드 물질들을 정제분리한 다음, 각각의 항암 효능을 검정하여 도 4 내지 도 8에 나타내었다.
도 4 내지 도 8을 참조하면, 췌장암(MIA-PaCa-2, BxPC-3, AsPC-1, PANC-1 세포주)에 대해 베르베린이 가장 높은 항암 활성을 나타냈으며, 스틸로핀이 그 다음으로 높은 항암 활성을 보였다. 프로토핀과 알로크립토핀은 세포주에 따라 변동이 있지만 IC50 수치상으로 낮은 농도에서 높은 항암 활성을 나타냈다.
대장암(HCT116, HT29, SW480 세포주)에 대해서는 베르베린이 가장 높은 항암 활성을 나타냈으며, 이 밖에 스틸로핀, 프로토핀, 알로크립토핀의 순으로 높은 항암 활성을 나타내었고, 유방암(MCF-7 세포주)에 대해서도 베르베린이 가장 높은 항암 활성을 나타냈으며, 그 다음 알로크립토핀, 프로토핀, 스틸로핀의 순으로 높은 항암 활성을 나타냈다.
또한, 폐암(A549, H1299 세포주)에 대해서도 베르베린이 가장 높은 항암 활성을 나타냈으며, 그 다음 스틸로핀, 프로토핀, 알로크립토핀의 순으로 높은 항암 활성을 나타냈고, 전립선암(PC-3 세포주)에 대해서도 베르베린이 가장 높은 항암 활성을 나타냈으며, 이 밖에 스틸로핀, 프로토핀, 알로크립토핀 순으로 높은 항암 활성을 나타냈다.
분석 결과, 베르베린이 5종의 암 세포주 모두에서 가장 높은 항암 활성을 나타냈으며, 스틸로핀은 유방암을 제외한 모든 암 세포주에서 베르베린 다음으로 높은 항암 활성을 나타냄을 확인하였다. 또한 베르베린과 스틸로핀은 특히 췌장암(AsPC-1세포주)과 대장암(HCT116 세포주)에서 IC50값이 50μM 이하로 낮은 농도에서도 높은 항암 활성을 나타냄을 확인하였다.
베르베린은 파파베르 파우리에이에서 가장 많이 생합성 되었으며, 스틸로핀은 파파베르 로에아스에서 가장 많이 생합성 되었다. 이 밖에 본 발명의 꽃양귀비 7품종의 추출물에서 확인된 테트라하이드로베르베린 및 디하이드로베르베린의 경우 가장 높은 항암 활성을 보인 베르베린과 유사한 구조를 가지고 있으므로, 5종의 암 세포주에 대해 유효한 항암 활성을 보일 것으로 기대할 수 있다.
2-3. 세포 독성 분석
품종 및 생육시기별 각 추출물의 세포독성을 비교하기 위하여 MTT 분석법으로 세포 생존율을 측정하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소 효소작용에 의하여 MTT 테트라졸리움이 MTT formazan[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide]으로 환원되는 정도를 측정하는 검사법으로, 본 실시예에서는 마우스 대식세포주(RAW264.7)를 이용하였다. RAW264.7를 DMEM 배지(PAN-biotech)에 10% 우태아 혈청(BioProjects International), 1% antibiotic/antimycotic (Corning)를 첨가하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하여 준비하였다. 준비한 RAW264.7 대식세포주를 96-웰(well) 플레이트에 104 cells/well로 분주하여 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 다음날, 각 품종의 추출물을 500 ㎍/㎖까지 농도별로 1시간 전처리 한 후, 100 ng/㎖의 LPS를 함께 24시간동안 처리하였다. 24시간 경과 후, 2 ㎎/㎖의 MTT 시약(Sigma Aldrich)을 20 ㎕씩 각 웰(well) 마다 넣어준 후, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. DMSO를 첨가한 후, 버사맥스 프로 마이크로플레이트 리더(분자 장치, 캘리포니아, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 소프트맥스 프로 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
도 9에 나타낸 것과 같이, 생육시기별(발아 후 60일, 90일)로 수확한 2품종(파파베르 로에아스, 파파베르 파우리에이)으로부터 얻은 각각의 에탄올 추출물의 세포독성을 MTT 검정을 통해 확인한 결과, 발아 후 90일 경과시점의 2품종 추출물 모두 최고 처리 농도(500 ㎍/㎖)에서 10% 미만의 세포 독성이 나타나, 유의한 수준의 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.
2-4. 베르베린 및 스틸로핀의 혼합에 따른 항암 시너지 효과
꽃양귀비 추출물에서 분리정제한 베르베린 및 스틸로핀의 혼합에 따른 항암 시너지 효과를 분석하여 도 10 내지 도 14에 나타내었으며, IC50 결과는 표 4에 나타내었다.
Cancer Cell line Berberine Stylopine Canadine berberine:stylopine=3:7 berberine:stylopine=1:1 berberine:stylopine=7:3
Cancer Cell line IC50(uM, mean ±SE)
췌장암 AsPC1 5.85±1.6 37.46±1.28 13.03±0.07 13.71±0.13 14.82±0.02 14.29±0.04
BxPC3 8.02±1.15 92.74±1.07 45.71±0.04 26.01±0.60 23.7±0.23 28.93±0.14
MIA-PaCa-2 7.26±1.29 61.84±1.25 15.70±0.51 16.51±0.70 19.12±0.60 19.41±0.62
PANC1 2.28±1.32 135.6±1.16 9.66±0.06 10.57±0.03 11.41±0.29 11.34±0.02
폐암 A549 20.65±1.4 60.56±1.34 9.94±0.01 11.33±0.04 12.25±0.01 18.77±0.03
H1299 11.99±1.6 224±1.28 16.44±0.84 17.25±1.45 21.10±0.89 18.77±0.85
대장암 HT-29 15.29±1.2 58.62±1.17 12.44±0.30 12.90±0.42 14.62±0.52 13.51±0.70
HCT116 8.8±1.16 45.02±1.09 11.46±0.04 10.42±0.01 11.05±0.24 10.82±0.04
SW480 15.29±2.18 304.5±1.66 8.26±0.03 8.32±0.13 9.27±0.08 8.69±0.06
전립선암 PC-3 30.47±1.34 114.6±1.13 9.65±0.08 10.34±0.02 12.79±0.06 12.28±0.06
유방암 MCF-7 26.15±1.29 148.8±1.05 9.55±0.07 11.94±0.06 14.28±0.13 13.28±0.07
도 10 내지 14 및 표 4를 참조하면, 베르베린 및 스틸로핀을 특정 혼합비(즉, 3:7 또는 7:3)로 처치한 경우, 베르베린, 스틸로핀 그리고 카나딘(canadine, 대조군) 단독 대비 특정 암세포에서 적은 IC50값을 나타내어, 우수한 항암 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
특히, 베르베린 및 스틸로핀의 함량비가 7:3 보다 3:7 비율에서 췌장암을 비롯한 모든 암세포 조직에 특이적으로 작용하는 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과는 단일화합물 중에서는 베르베린의 항암 효과가 대부분 암세포에서 높은 효능 활성을 보였기 때문이며, 단일화합물인 베르베린과 스틸로핀 간 비교 결과와는 상이적인 결과로 물질간 비율이 효능에 시너지 효과를 가짐을 확인할 수 있는 결과이다.
Figure 112022070818978-pat00001
또한, 화학식 1을 참고하여, 베르베린과 카나딘은 구조적인 유사성을 가지지만 실제 항암 효과는 베르베린이 더 우수함을 확인할 수 있는데 이는 구조적인 차이로, 구조가 대부분 유사하더라도 일부 구조의 차이로 인해 암세포에 특이적 작용에서는 크게 기여한다는 것을 확인할 수 있다.
결과적으로 화합물 구조적으로 작은 차이라도 항암 효능에서는 크게 작용할 수 있고 이러한 측면에서 베르베린 및 스틸로핀의 조합은 항암 효능 활성에 시너지 효과로 더 큰 영향을 주었음을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태는 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 유효성분으로서 베르베린(Berberine) 및 스틸로핀(Stylopine)을 3:7 내지 7:3의 중량비로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물로서,
    상기 암은 폐암(Lung cancer), 전립선암(Prostate cancer) 및 유방암(Breast cancer)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 암인,
    암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    3:7 또는 7:3의 중량비로 베르베린 및 스틸로핀을 포함하는 것인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    베르베린 및 스틸로핀은 꽃양귀비로부터 얻어진 것인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    꽃양귀비는 파파베르 로에아스(Papaver rhoeas) 및 파파베르 파우리에이(Papaver fauriei) 중에서 선택되는 것인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    꽃양귀비는 발아 후 10일 내지 120일이 경과한 것인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    베르베린 및 스틸로핀은 꽃양귀비를 암모니아와 에틸에테르를 5~20:95~80의 부피비로 혼합한 혼합용매로 추출하여 수득한 추출물로부터 얻어진 것인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 암은 전립선암(Prostate cancer)인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 암은 유방암(Breast cancer)인, 암 예방 및 치료용 약학 조성물.
  9. 유효성분으로서 베르베린(Berberine) 및 스틸로핀(Stylopine)을 3:7 내지 7:3의 중량비로 포함하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물로서,
    상기 암은 폐암(Lung cancer), 전립선암(Prostate cancer) 및 유방암(Breast cancer)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 암인,
    암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
KR1020220083551A 2021-08-12 2022-07-07 베르베린 및 스틸로핀을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 KR102487650B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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