KR20160056007A - 황칠나무 추출물을 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 추출물이 미세아교세포(microglia cell)를 이용한 MTT 어세이 방법을 통한 세포독성실험(실험예 1) 및 LPS로 자극된 미세아교세포(microglia)에서 생산되는 아질산염(NO) 분비 저해 측정실험(실험예 2)를 통하여 염증유발 인자인 NO 분비를 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 유용하게 이용할 수 있다.

Description

황칠나무 추출물을 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물{Composition comprising extract of Dendropanax morbifera Lev. for the treatment and prevention of inflammatory disease}

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] 한국 특허공개 제 2000-0004499

[문헌 2] 한국 특허공개 제 2003-0079205

[문헌 3] 한국 특허공개 제 2004-01077853

[문헌 4] 한국 특허공개 제 2004-0107852

[문헌 5] 한국 특허공개 제 2005-0036093

[문헌 6] 한국 특허공개 제 2006-0131360

[문헌 7] Olajide et al., J Ethnopharmacol 2013; 145: 42-49

[문헌 8] Carey et al., J Agric Food Chem 2013; 61(25): 5979-5986

염증은 손상에 대한 살아있는 조직의 반응으로 염증 반응은 면역계를 동원 하는 생체의 방어와 치유에 핵심적인 역할을 하고 있을 뿐 아니라 많은 질병의 병리작용에 관련되어 있는 대단히 중요한 과정이다. 염증을 일으키는 원인을 무수히 많으나 세균, 진균, 바이러스와 같은 생물성 원인도 그 중 하나이다. 또한, 염증 반응 시, 면역세포인 마크로파지(macrophage)는 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β)나 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α)와 같은 사이토카인(cytokine)류 또는 일산화질소(nitric oxide, NO)나 프로스타글란딘(prostaglandin, PG)등의 다른 염증 메디에이터(inflammatory mediator)를 생산함으로써 반응 진행과정에서 중요한 역할을 수행한다. 마크로파지(Macrophage)에 의한 이런 매개체의 생산은 많은 염증성 조직에서 발견된다. 예를 들어 생체가 세균 내독소(bacterial endotoxin)인 리포폴리싸카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 외부 면역 자극 물질에 노출되면 생체신호전달 경로를 거쳐 면역세포들이 활성화되며 동시에 이들 세포에 의한 염증 유발 인자들의 발현양이 증가하게 되는데, 이 과정의 첫 단계로 해당 인자의 mRNA 발현이 증가하게 된다. 또한, 증가된 IL-1β, TNF-α, iNOS, COX-2 등과 같은 사이토카인이나 생체 효소들은 염증(inflammation), 통증조절 (pain control), 세포사멸(apoptosis), 종양생성 (tumorigenesis), 자가면역반응(autoimmune response) 등의 약리학적 또는 생리학적 생체반응에서 중요한 역할을 수행 한다.

생체 조직의 손상에 대한 능동적인 생체 방어 과정으로 설명되는 염증반응은 생체의 세포나 조직이 어떤 원인에 의하여 손상을 받으면 이에 대한 반응을 시작하여 손상을 극소화시키고, 손상된 부위를 복구시키려는 일련의 생체과정을 일으키게 된다. 염증 반응시, 면역세포인 마크로파지(macrophage)는 인터루킨((interleukin)-1β, IL-1β)나 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α)와 같은 사이토카인(cytokine)류 또는 일산화질소(nitric oxide, NO)나 프로스타글란딘(prostaglandin, PG) 등의 다른 염증 메디에이터(inflammatory mediator)를 생산함으로써 반응 진행과정에서 중요한 역할을 수행한다. 마크로파지(Macrophage)에 의한 이런 매개체의 생산은 많은 염증성 조직에서 발견된다. 예를 들어 생체가 세균 내독소(bacterial endotoxin)인 리포폴리싸카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 외부 면역 자극 물질에 노출되면 생체신호전달 경로를 거쳐 면역세포들이 활성화되며 동시에 이들 세포에 의한 염증 유발 인자들의 발현양이 증가하게 되는데, 이 과정의 첫 단계로 해당 인자의 mRNA 발현이 증가하게 된다. 염증 매개 인자의 과생산은 류마티스성 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 만성 간염, 폐섬유화증 등과 같은 많은 염증성 질환에서 쉽게 발견되며 이들 질환의 병리현상에 대한 주요인이 된다. 따라서, 이러한 염증 유발 매개 인자에 대한 유전자 발현의 저해방법은 다양한 염증성 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 치료원리 및 방법이 될 수 있다. IL-1β, TNF-α, iNOS, COX-2 등과 같은 사이토카인이나 생체 효소들은 염증(inflammation), 통증조절 (pain control), 세포사멸(apoptosis), 종양생성 (tumorigenesis), 자가면역반응(autoimmune response) 등의 약리학적 또는 생리학적 생체반응에서 중요한 역할을 수행 한다.

목이 아프면서 열이 나는 질환 중에 가장 많은 경우는 급성 편도염인데, 편도염과같은 염증성 질환은 감염, 외상, 면역학적 반응을 포함한 인체 내의 반응이다. 발열, 홍조, 부종, 통증 등의 급성 염증 증후가 있으며, 염증과정의 후반에는 염증부위로의 백혈구의 이주 및 사이토카인(cytokine), degradative enzyme, bioactive lipid intermediate, transient reactive oxygen species, sensitized lmphocyte의 생성 등 세포내의 변화가 일어난다. 만성적인 염증질환에서는 백혈구의 침윤에 의해 세포 활성화 및 세포사멸이 일어난다. 염증반응의 화학매개물 중 프로스타글란딘(prostaglandins, PG)과 일산화질소(nitric oxide ,NO)는 발암 및 염증의 진행과정에 중요한 매개물질이다. 염증이나 통증을 조절하는 약물 중 가장 흔히 사용되는 약물인 nonsteroidal antiinflammatory drugs(NSAIDs)는 체내에 프로스타글란딘(prostaglandin)을 생성하는 COX를 저해함으로써 약리작용을 나타나는데 싸이클로옥시게나제(cyclooxygenase)는 COX-1과 COX-2의 두 가지 isoform으로 존재한다는 것이 밝혀졌다. 이 중 COX-1은 정상상태에서 위장관 점막과 혈소판, 신장에서 세포 보호 작용과 조절 작용에 관여하는 PG류 생성에 관여하는 효소인데 반해, COX-2는 정상세포에서는 그 농도가 매우 낮으나 염증관련세포에서 여러 자극(cytokine, endotoxin, mitogen)에 의해 유도 발현되어 통증이나 염증에 관여하는 PG류 생성에 관여한다. 염증이나 통증을 조절하는 약물 중 NSAIDs는 인체 내에서 염증 반응에 관여하는 PG류 이외에 위점막 보호, 혈소판기능과 관련된 PG의 생성도 억제하여, 위장관 장해나 출혈 등의 부작용도 함께 나타나게 된다.

황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 두릅나무과에 속하는 식물로써 세계에서 오직 한국의 해남, 완도와 같은 남부 해안 지역과 제주도에서만 자생하는 상록 활엽교목으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것으로 황칠(黃漆)이라고 한다. 본초 강목에서는 황칠나무가 번열을 제거하고, 안질 및 화상치료에 효과가 있다고 알려졌으며, 최근 들어서는 황칠나무의 잎이 항암 작용에 효능이 있으며 또한 항산화 작용 및 신경 안정작용이 있는 것으로 보고되어 지고 있으며 아울러 황칠나무 추출물이 피부의 멜라닌 색소를 생성하는 타이로시나아제를 불활성화 시켜 피부 미백에 도움을 준다고 알려져 있다. 황칠나무는 비휘발 성분 66.7%, 방향성분 10.8%, 수분 8.1% 및 고형분이 14.4% 로 구성되어져 있으며 특히 방향성분은 주로 β-쿠베벤(cubebene), γ-셀리넨(selinene), δ-카디넨(cadiene)으로 이루어져 있다고 보고되고 있다.

종래의 황칠나무에 관한 관련 기술로는 한국 특허공개 제 2000-0004499에 항암활성을 가지는 황칠나무 추출물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2003-0079205에 간세포 보호효과를 갖는 황칠 추출물, 황칠 분획물 및 이들을 함유한 약학 조성물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2004-01077853에 에탄올 유발 간손상을 억제하는 황칠추출물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2004-0107852에 피부 미백 효과가 있는 황칠추출물과 황칠 분획물이 기재되어 있으며 한국 특허공개 제 2005-0036093에 황칠나무 수액을 유효성분으로 하는 자외선 차단 화장품 조성물, 한국 특허공개 제 2006-0131360에 생리활성이 뛰어난 황칠나무의 종실추출물이 기재되어 있다.

그러나, 상기 종래기술 문헌의 어디에도 황칠나무 추출물에 대한 염증성 질환에 치료효능에 대하여 개시되거나 교시된 바는 없다

이에 본 발명자들은 천연물로부터 새로운 염증치료 약물을 개발하기 위하여 수백종의 천연물을 검색한 결과, 황칠나무 추출물이 미세아교세포(microglia cell)를 이용한 MTT 어세이 방법을 통한 세포독성실험(실험예 1) 및 LPS로 자극된 미세아교세포(microglia)에서 생산되는 아질산염(NO) 분비 저해 측정실험(실험예 2)를 통하여 염증유발 인자인 NO 분비를 탁월하게 억제하는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 황칠나무 추출물의 약학조성물은 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 사용이 가능하다.

본원에서 정의되는 염증성 질환은 편도염, 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 결막염, 아토피, 비염, 고혈압, 당뇨병, 암 또는 천식, 바람직하게는 염증, 편도염, 위염, 대장염, 관절염, 아토피, 보다 바람직하게는 대장염, 염증성 고열, 또는 편도염을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본원에서 정의되는 상기 황칠나무 추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 또는 10~100%(v/v) 에탄올, 보다 더 바람직하게는 물 또는 20~50%(v/v) 에탄올에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 황칠 나무 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 황칠 나무 추출물은 건조된 황칠 나무의 잎, 가지, 또는 수피, 바람직하게는, 잎 또는 가지부위를 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 주정 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 주정 또는 10~100% 에탄올을 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 12시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 초음파 추출법 또는 환류 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 추출물은 미세아교세포(microglia cell)를 이용한 MTT 어세이 방법을 통한 세포독성실험(실험예 1) 및 LPS로 자극된 미세아교세포(microglia)에서 생산되는 아질산염(NO) 분비 저해 측정실험(실험예 2)를 통하여 염증유발 인자인 NO 분비를 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 황칠 나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 염증성 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 황칠나무 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.

상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 추출물은 미세아교세포(microglia cell)를 이용한 MTT 어세이 방법을 통한 세포독성실험(실험예 1) 및 LPS로 자극된 미세아교세포(microglia)에서 생산되는 아질산염(NO) 분비 저해 측정실험(실험예 2)를 통하여 염증유발 인자인 NO 분비를 탁월하게 억제하는 효과를 보여 염증성 질환의 치료 및 예방의 유용한 약학조성물 또는 건강기능식품으로서 사용할 수 있다.

도 1는 황칠나무 잎 추출물에 대한 HPLC 분석 결과에 관한 도이고,
도 2는 LPS로 자극된 미세아교세포(microglia)에서 황칠나무 잎의 주정추출물 및 열수추출물에 대한 세포독성 및 NO방출 저해능을 확인한 도이며(여기에서, (A) 황칠나무 잎 주정추출물이 세포 생존율에 미치는 영향. (B) 주정 추출물의 NO의 방출 저해 효능. (C) 황칠나무 잎 열수추출물이 세포 생존율에 미치는 영향 및 (D) 열수추출물의 NO의 방출 저해 효능임),
도 3는 LPS로 자극된 미세아교세포(microglia)에서 황칠나무 가지의 주정추출물 및 열수추출물에 대한 세포독성 및 NO방출 저해능을 확인한 도이며(여기에서, (A) 황칠나무 가지 주정추출물이 세포 생존율에 미치는 영향. (B) 주정 추출물의 NO의 방출 저해 효능. (C) 황칠나무 잎 열수추출물이 세포 생존율에 미치는 영향 및 (D) 열수추출물의 NO의 방출 저해 효능임);
도 4는 LPS로 자극된 미세아교세포(microglia)에서 레몬의 주정추출물 및 열수추출물에 대한 세포독성 및 NO방출 저해능을 확인한 도이다(여기에서, (A) 레몬 주정추출물이 세포 생존율에 미치는 영향. (B) 주정 추출물의 NO의 방출 저해 효능. (C) 레몬 열수추출물이 세포 생존율에 미치는 영향 및 (D) 열수추출물의 NO의 방출 저해 효능임).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 황칠 추출물의 제조

본 연구에 사용된 황칠은 농업회사법인 (주)황칠코리아에서 공급받았으며, 대조용을 사용한 레몬은 제주레몬 업체에서 공급받았으며, 황칠의 경우 잎과 가지를 분리하여 사용하였다.

1.1. 열수 추출

레몬 및 황칠나무 가지, 잎 부위의 이물질을 제거한 뒤 환류(refluxing) 추출장치(광명화학, EAM-9204-06)를 사용하여 가열은 항온수조(동진과학, KSW-6001) 100°C에서 4시간을 조건으로 추출하였다. 추출된 시료를 원심분리기(FLETA5, 한일)로 원심분리하여 상등액(supernatant)만을 취하여 동결건조기(DRC-100+FDU-2100, 렙코퍼레이션)로 동결 건조를 하여 분말을 제조하여 사용하였다. (이하, ‘DMW라 함), 수율은 하기 표 1에 기재하였다.

열수추출 수율

구분	황칠나무 가지	황칠나무 잎	레몬
수율	3.4%	2.8%	2.4%

1.2. 에탄올 추출

레몬 및 황칠나무 가지, 잎 부위를 정제수로 이물질을 제거한 뒤에 80°C의 열풍건조기(SC-OV72, 성찬화학) 내에 48시간동안 방치하여 수분을 제거하였다. 그 후 파쇄 한 뒤 각 원료를 칭량하고 질량의 7배의 70%의 주정에탄올을 추출용매로 하여 초음파추출장치(SM30-CEP, 애니택코리아)로 초음파처리를 한 후 7일간 침지시켜 추출하였고, 여과지로 여과한 후, 여과액을 회전식 진공 증발기(N-1200BSW, 렙코퍼레이션)로 감압 농축하여 건조시켜 분말화 하여 사용하였다.(이하, ‘DME라 함), 수율은 하기 표 2에 기재하였다.

에탄올 추출 수율

구분	황칠나무 가지	황칠나무 잎	레몬
수율	3.6%	3.0%	2.6%

실시예 2. 지표성분 분석

분말화된 레몬과 황칠나무 잎, 가지 부위의 지표성분 분석을 위한 지표성분에 대하여 레몬은 Limonene으로 설정이 되었다. 황칠의 경우 베타-아미린(β-amyrin)을 지표물질로 설정하여 실험을 진행하였다.

레몬과 황칠나무 잎, 가지 부위를 표 3과 같은 조건으로 HPLC 분석을 하여 그 결과들은 도 1에 나타내었다.

HPLC 분석결과 조건

흡광도	용매	Column	유속
245nm	3DW : ACN(Merck, 1.14291.4004) (60:40)	C18	0.9/min

실험예 1. 황칠나무 추출물의 세포독성

상기 실시예의 시료들의 미세아교세포(microglia cell)에서의 세포독성에 마차는 영향을 확인하기 위하여 종래문헌에 기재된 MTT assay 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Olajide et al., J Ethnopharmacol 2013; 145: 42-49).

상기 참고예2를 통해 배양된 RAW 264.7 세포를 96 well에 2×10⁵/200 μL/well로 준비하여 48시간동안 안정화 시켰다. 48시간이 지난 세포에 1 μg/ml의 lipopolysaccharide (LPS)를 넣고, 각각의 0.78mg/ml 및 50mg/ml의 농도로 준비된 추출물을 넣고, 24시간 배양하였다. 이후 각 well에 5 mg/ml의 (5 mg/ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) solution 20 μL을 넣고 37ºC에서 4시간 CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후 108 μL의 세포배양액을 얻고, methanol/DMSO 용액이 1:1로 들어간 용액 180 μL를 각 well에 첨가한 다음 shaker에 섞은 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 계산하였다.

상기한 MTT 측정 결과 LPS 및 황칠나무 잎, 가지, 레몬의 주정 추출물 각각 단독으로 또는 같이 처리한 모든 실험군에서 대조군에 비하여 황칠나무 가지 추출물은 세포 생존율이 변하지 않았으며(도 2) 황칠나무 잎과 레몬 주정추출물은 최고 농도 50mg/ml에서 각각 27.38%, 19.61%의 세포독성을 보임을 확인 하였다(도 3, 도 4). 또한 황칠나무 잎, 가지, 레몬의 열수 추출물도 주정추출물과 같은 방법으로 세포 독성 검사를 하였으며, 황칠나무 가지 추출물은 열수 추출물 또한 생존율이 변하지 않았으며(도 1) 황칠나무 잎과 레몬 열수추출물은 최고농도 50mg/ml에서 각각 25.82%, 17.89%의 세포독성을 나타내었다. (도 3, 도 4)

실험예 2. 항염증 실험

상기 실시예 1에서 수득한 시료의 아질산염(NO) 방출 저해 작용효능을 확인하기 위하여 하기와 같이 미세아교세포(microglia)를 이용한 문헌에 개시된 방법을 응용하여 실험을 실시하였다 (Carey et al., J Agric Food Chem 2013; 61(25): 5979-5986).

Microglia 세포주인 RAW264.7을 10% fetal calf serum, 100 μg/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한, Dulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY)에서 5% CO2, 37ºC에서 배양하였다. 아질산염 방출 저해 실험 전에 세포를 12-well plate로 옮겼으며, 75% confluence를 유지하였다. 추출물의 항염증 효능을 분석하기 위하여 농도별로 황칠나무 잎 주정 추출물, 황칠나무 잎 열수추출물, 황칠나무 가지 주정 추출물, 황칠나무 가지 열수 추출물, 레몬 주정 추출물, 레몬 열수추출물을 처치한 다음, 1시간 후에 신경염증 유발 인자인 LPS(100ng/㎖)로 다음날까지 microglia 세포를 자극하였으며, 이 때 생산되는 아질산염(NO)가 농도 의존적으로 저해효능을 보이는지 분석하였다.

아질산염(NO)의 측정은 Griess 시약을 이용한 NO assay kit (Abcam)를 사용하였으며, 측정 방법은 Abcam의 사용설명서에 따라 진행하였다. 세포배양액 85 μL를 이용하여 assay 시약을 넣고, 540 nm의 흡광도에서 관찰하였으며, 농도는 standard curve를 이용하여 최종 확인하였다.

상기 실험 결과, 황칠나무 잎 주정 추출물을 처리한 세포에서 LPS에 의해서 유도되는 아질산염(NO)은 8.85±0.58μM로 대조군으로 사용한 1.72±0.06μM에 비하여 약 5.2배의 증가를 보였으며, 황칠나무 잎 열수 추출물의 경우에는 1.14μM에 비하여 약 8.7배의 증가를 보였다. 실험군으로 황칠나무 잎의 주정추출물을 농도별로 처리를 한 결과, 각각 7.34±0.35, 6.52±0.27, 5.7±0.57, 4.02±0.32, 2.56±0.72, 2.05±0.27, 2.1±0.1μM로 아질산염(NO)의 함량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인 하였으며, 열수 추출물의 경우도 9.87±0.79μM, 9.21±0.67μM, 8.78±0.49μM, 7.42±0.41μM, 6.42±0.87μM, 5.98±0.38μM, 5.87±0.31μM로 아질산염(NO)의 함량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.(도 2) 또한 황칠나무 가지 주정추출물을 처리한 세포에서 LPS에 의해서 유도되는 아질산염(NO)은 8.68±0.45μM로 대조군으로 사용한 1.82±0.08μM에 비하여 약 4.8배의 증가를 보였으며, 황칠나무 가지 열수추출물을 처리한 경우에는 아질산염(NO)가 8.23±0.38μM로 대조군으로 사용한 1.07±0.07μM에 비하여 7.7배 증가하였다. 실험군으로 황칠나무 가지 추출물을 농도별로 처리를 한 결과 각각 8.91±0.98, 8.79±1.01, 7.71±0.31, 7.22±1.01, 5.69±1.39, 4.95±1.04 1.72±0.36로 아질산염(NO)의 량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인 하였고, 황칠나무 가지 열수추출물을 농도별로 처리한 결과도 8.12±0.7μM, 8.09±0.64μM, 7.64±0.42μM, 7.42±0.59μM, 7.28±0.76μM, 6.32±0.54μM, 6.11±0.27μM로 아질삼염(NO)의 함량이 농도의존적으로 감소하였다(도 1=Fig. 5B, D). 레몬의 주정추출물을 처리한 세포에서 LPS에 의해서 유도되는 아질산염(NO)은 29.3±2.54μM로 대조군으로 사용한 3.35±0.41μM에 비하여 약 8.8배의 증가를 보였으며, 열수추출물을 처리한 세포에서는 LPS에 의해 유도되는 아질산염은 8.23±0.42μM로 대조군으로 사용한 1.03±0.1μM에 비해 약8배의 증가를 보였다. 실험군으로 황칠나무 잎의 주정추출물을 농도별로 처리를 한 결과 각각 31.75±2.30, 32.2±2.16, 25.17±3.09, 22.87±2.38, 22.34±2.91, 22.29±3.12, 12.64±1.57μM로 아질산염(NO)의 량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인 하였고, 열수 추출물 또한 8.23±0.78μM, 8.12±0.71μM, 8.14±0.77μM, 7.32±0.78μM, 7.03±0.84μM, 6.02±0.29μM, 5.48±0.3μM로 아질산염(NO)의 량이 농도 의존적으로 감소하였다(도 3=Fig. 6B).

상기 세포l 실험의 연구단계에서 독성평가 및 NO 분비 실험 결과를 확인한 결과, 열수 추출물에 비해 주정추출물이 월등히 효과가 좋았다. 따라서 실험비용 절감 및 주정추출물의 실험집중을 위해 이후 실험은 주정추출물을 이용하여 진행하였으며, 세포l 실험에 의해 측정된 세포독성의 범위는 지속되는 모든 실험들의 독성 범위에 대한 근거가 되었다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

DME --------------------------------------------- 20 mg

유당 ------------------------------------------- 100 mg

탈크 -------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

DMW --------------------------------------------- 10 mg

옥수수전분 ------------------------------------- 100 mg

유당 ------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------ 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

DME --------------------------------------------- 10 mg

결정성 셀룰로오스 -------------------------------- 3 mg

락토오스 -------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 -------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

DMW --------------------------------------------- 10 mg

만니톨 ----------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 ---------------------------- 2974 mg

Na2HPO4,12H2O ----------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

DME --------------------------------------------- 20 mg

이성화당 ----------------------------------------- 10 g

만니톨 -------------------------------------------- 5 g

정제수 ------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

DMW ------------------------------------------ 1000 ㎎

비타민 혼합물 ----------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ---------------------------- 70 ㎍

비타민 E -------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 ------------------------------------ 0.13 ㎎

비타민 B2 ------------------------------------ 0.15 ㎎

비타민 B6 ------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ------------------------------------ 0.2 ㎍

비타민 C --------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ----------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 -------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 --------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ----------------------------------- 적량

황산제1철 ------------------------------------ 1.75 ㎎

산화아연 ------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 --------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ------------------------------------ 15 ㎎

제2인산칼슘 ------------------------------------ 55 ㎎

구연산칼륨 ------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 -------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 --------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

DME ------------------------------------------ 1000 ㎎

구연산 --------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 --------------------------------------- 100 g

매실농축액 --------------------------------------- 2 g

타우린 ------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 -------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 선택되어진 용매에 가용한 추출물인 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 Dendropanax morbifera Lev. , Dendropanax morbiferus의 잎, 가지, 또는 수피임을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 고열, 염증, 편도염, 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 결막염, 아토피, 비염, 고혈압, 당뇨병, 암 또는 천식인 약학조성물.
5. 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 제 5항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.

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