KR102203626B1

KR102203626B1 - 포스비틴 및 리소자임을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물 및 건강기능식품

Info

Publication number: KR102203626B1
Application number: KR1020190032948A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 김기태; 이재훈; 김현석; 김인규
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; 주식회사 위드바이오
Priority date: 2018-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2021-01-15
Also published as: KR20190111828A

Abstract

본 발명은 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물, 건강기능식품 내지 대식세포 활성화용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 조성물은 대식세포에 대한 세포독성이 없으며, NF-κB, Akt 또는 MAPKs 경로를 통하여 대식세포의 활성을 자극하여 대식세포의 산화질소(NO), 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생산을 증가시키고 식세포 활성(phagocytic activity)을 높일 수 있다. 특히, 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 조성물은 대식세포의 산화질소(NO) 생산을 유의적으로 증가시킬 수 있으므로 면역증강용 조성물 내지 대식세포 활성화용 조성물로서 효과적이다.

Description

포스비틴 및 리소자임을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물 및 건강기능식품{Pharmaceutical and functional food composition comprising phosvitin and lysozyme for enhancing immunity}

본 발명은 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물, 건강기능식품 내지 대식세포 활성화용 조성물에 대한 것이다.

면역 체계의 자극은 고령의 노인들이나 암환자 같은 면역 반응이 불안정한 사람들에게 면역 체계의 활성을 높일 수 있는 중요한 전략 중 하나이다. 현재 이와 관련하여 다당류(polysaccharide), 단백질(protein) 또는 플라보노이드(flavonoid) 등 천연 물질로부터 면역 증강 물질을 찾아내어 면역 반응을 적절한 수준으로 조절 및 유지할 수 있도록 하는 연구가 진행되고 있다. 특히, 특정 암세포나 병원균, 손상된 세포를 사멸시키는 자연살해세포(natural killer cells)나 대식세포의 활성화는 고령의 노인들이나 암환자에게 면역 체계를 활성화 시키므로 중요하다고 볼 수 있다.

현재 다양한 천연 식품 유래 물질들이 면역 증강능이 있다는 연구가 보고되고 있다. 예를 들면, 허브(herb)로부터 추출한 다당류(polysaccharides), 인삼(ginseng)으로부터 추출한 단백질(protein), 포도로부터 추출한 레스베라트롤(resveratrol) 등이 있는 것으로 알려져 있다.

대식세포는 선천 면역과 적응 면역에서 병원균에 대한 식세포 작용이나, 항원의 형성, 사이토카인(cytokine)의 분비 등 중요한 역할을 하고 있다. 여기서 대식 세포 내의 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF-α)와 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β)와 같은 사이토카인들은 전염증 반응에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. 이들은 항균, 항바이러스, 항종양 등에 대하여서도 작용하여 면역 반응에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있다. 또한 대식세포는 산화질소(nitric oxide, NO)나 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2)와 같은 전 염증 인자들도 생성한다. 산화질소는 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 합성되는데, 이 NOS는 뉴런 NOS(neuronal NOS, nNOS), 내피 NOS(endothelial NOS, eNOS), 유도 NOS(inducible NOS, iNOS) 등으로 구성되어 있다. 따라서 대식세포의 전염증 사이토카인 내지 인자 등의 분비를 촉진 시킬 수 있는 새로운 물질들을 찾는 것이 면역 약리학이나 암 예방 분야에서 중요한 연구 주제 중 하나이다.

난황 단백질 중 하나인 포스비틴(phosvitin)은 분자량 35-40 kDa인 단백질이다. 총 아미노산 서열 중 57.5%가 세린(serine)이며 대부분의 세린이 인산화되어 있다는 구조적인 특징을 갖고 있다. 이러한 특별한 구조적인 특징으로 인해 포스비틴은 강한 메탈-킬레이팅(metal-chelating) 능력과 항산화력(anti-oxidant activity)를 갖고 있다고 보고되고 있다. 이 외에도 유화 활성(emulsifying activity), 항균력(antimicrobial activity), 멜라닌생성 억제 활성(melanogenesis inhibitory activity), 세포독성 효과(cytotoxic activity), 항유전자독성 활성(antigenotoxic activity) 등이 있다고 보고되고 있다.

리소자임(Lysozyme)은 계란 난백 또는 우유와 같은 동물성 식품에 존재하는 효소로서 세균의 세포벽을 구성하는 N-아세틸무람산(N-acetylmuramic acid)와 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)의 β-1,4 결합을 분해시켜 용균작용을 하는 것으로 알려져 있다. 다양한 병원성 미생물에 대해 항균작용을 보이는 것으로 보고되고 있으며 이 외에도 항바이러스 활성(antiviral activity), 항염증 활성(anti-inflammatory activity), 항암 활성(antitumor activity) 등이 있다고 보고되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1597540호에서는 난황 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물은 IgY를 포함하고 있어 B 세포의 활성을 유도하여 후천적으로 면역능력을 향상시키는 효과가 있음을 개시하고 있다.

그러나, 리소자임과 산화질소(NO)와의 관련성 내지 포스비틴 및 리소자임을 모두 포함하는 경우 면역증강효과에 대한 연구는 미흡한 편이다.

이에 본 발명자들은 계란의 난황 단백질로서 포스비틴(phosvitin)과 난백 단백질로서 리소자임(lysozyme)을 모두 포함하는 경우 대식세포의 산화질소(NO) 생성량이 증가하는 등 대식세포의 활성을 증가시켜 면역 증강 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은, 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 면역증강용 조성물 내지 대식세포 활성화용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)은 1:1 내지 5:1의 농도비로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 대식세포의 NO, iNOS 및 전염증사이토카인(pro-inflammatory cytokine)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 분비를 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 전염증사이토카인(pro-inflammatory cytokine)은 TNF-α 또는 IL-1β인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 대식세포의 식세포 활성(phagocytic activity)를 증강시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 면역증강용 건강기능식품을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 대식세포 활성화용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 계란의 난황 단백질인 포스비틴(phosvitin) 내지 난백 단백질인 리소자임(lysozyme)을 포함함으로써 계란에 고부가가치를 부여할 수 있다. 또한, 대식세포에 대한 세포독성이 없으며, NF-κB, Akt 또는 MAPKs 경로를 통하여 대식세포의 활성을 자극하여 대식세포의 산화질소(NO), 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생산을 증가시키고 식세포 활성(phagocytic activity)을 높일 수 있다. 특히, 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 조성물은 대식세포의 산화질소(NO) 생산을 유의적으로 증가시킬 수 있으므로 면역증강용 조성물 내지 대식세포 활성화용 조성물로서 효과적이다.

도 1은 포스비틴(phosvitin)을 대식세포에 처리하는 경우 대식세포의 생존률을 나타낸다. 포스비틴은 첨가농도와 무관하게 대식세포에 대하여 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
도 2는 포스비틴(phosvitin)을 대식세포에 처리하는 경우 산화질소(NO) 및 산화질소합성효소(iNOS)의 생산량을 나타낸다. 포스비틴의 첨가농도가 증가할수록 이에 의존적으로 대식세포의 NO 및 iNOS의 생산량이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
도 3은 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 대식세포에 처리하는 경우 산화질소(NO)의 수준을 나타낸다. 포스비틴 및 리소자임이 6:4의 비율로 포함된 조성물의 경우, 다른 비율로 포함된 경우에 비하여 NO 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 4은 포스비틴(phosvitin)을 대식세포에 처리하는 경우 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 종류인 TNF-α와 IL-1β의 생산량을 나타낸다. 포스비틴의 첨가농도가 증가할수록 이에 의존적으로 대식세포의 TNF-α와 IL-1β의 생산량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 포스비틴(phosvitin)을 대식세포에 처리하는 경우 식세포 활성(phagocytic activity)을 나타낸다. 포스비틴의 첨가농도가 증가할수록 이에 의존적으로 대식세포의 식세포활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 6는 포스비틴(phosvitin, PSV)을 대식세포에 처리하는 경우 활성화되는 메카니즘을 나타낸다. NF-κB 억제자인 PDTC, Akt 억제자인 LY294002 또는 MAPKs 억제자인 SP600125를 각각 첨가하는 경우 대식세포가 생산하는 산화질소(NO)의 농도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 대식세포는 선천면역 또는 적응면역, 병원균에 대한 식세포 작용 또는 사이토카인의 분비 등 중요한 역할을 하고 있으므로 대식세포를 자극하여 면역력을 증강시키는 조성물 내지 방법에 대한 연구가 요구되고 있다. 또한, 포스비틴 및 리소자임을 모두 포함하는 경우 대식세포의 활성을 자극하여 발생할 수 있는 면역증강효과에 대한 연구는 개시된 바 없다.

본 발명에 따른 포스비틴(phosvitin)과 리소자임(lysozyme)을 모두 포함하는 면역증강용 조성물은 대식세포의 활성을 자극하여 산화질소(NO) 생산량을 증가시키므로(실시예 <3-2>, 도 3) 면역증강용 조성물로서 효과적이다. 특히 상기 조성물에 리소자임 단독으로 포함되는 경우 대식세포의 산화질소 생산량에 영향이 없었으며, 포스비틴보다 리소자임을 같거나 높은 농도로 포함하는 경우 포스비틴과 리소자임의 시너지 효과가 발생하지 않았다.

특히, 본 발명의 포스비틴은 대식세포에 대한 세포독성이 없으며, 대식세포의 산화질소(NO), 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생산이 늘어나고 식세포 활성(phagocytic activity)가 높아진다. 또한, NF-κB, Akt 또는 MAPKs 경로를 통하여 대식세포의 활성을 자극하여 면역반응을 증강시킨다.

결과적으로, 포스비틴과 리소자임을 모두 포함하면서, 포스비틴이 리소자임보다 높은 함량으로 포함되는 본 발명의 조성물은 면역증강용 약학적 조성물, 건강기능식품 내지 대식세포 활성화용 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 포스비틴과 리소자임은 계란에서 직접 분리 및 정제하여 사용할 수 있으며, 화학적으로 합성하여 사용하거나 시판되는 상품을 구입하여 사용할 수 있다.

상기 포스비틴 및 리소자임은 본 발명의 면역증강용 조성물에 모두 포함되여, 포함되는 포스비틴의 함량은 리소자임의 함량보다 높게 포함될 수 있다. 바람직하게는 포스비틴 및 리소자임이 1:1 내지 5:1의 농도비로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 포스비틴 및 리소자임이 1.2:1 내지 4:1의 농도비로 포함될 수 있고, 가장 바람직하게는 포스비틴 및 리소자임이 1.4:1 내지 2:1의 농도비로 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 대식세포의 NO, iNOS 및 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 분비를 증가시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 대식세포의 NO 및 iNOS의 분비를 증가시키는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 대식세포의 NO의 분비를 증가시키는 것이 바람직하다. 산화질소(NO)는 전염증인자로서 바이러스에 감염된 세포, 암세포 내지 병원균을 사멸시킬 수 있으며, iNOS는 산화질소합성효소(NOS) 중에서 유도성 산화질소합성효소(inducible NOS)이고 염증 발생시 활성화된다.

본 발명의 상기 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)은 TNF-α 또는 IL-1β인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 TNF-α는 초기 면역 반응을 자극하여 대식세포를 활성화시켜 다양한 사이토카인을 분비하도록 하며 IL-1β은 대식세포의 식세포 활성을 자극한다.

본 발명의 상기 조성물은 대식세포의 식세포 활성(phagocytic activity)를 증강시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식세포 활성이 증가하는 경우 병원균이나 암세포와 같은 외부 물질에 대한 초기 면역반응의 활성이 증가한다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 피부외용으로 사용한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양, 즉 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 포스비틴 및 리소자임의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 500 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 포함하는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다.

상기 포스비틴 및 리소자임은 상기 약학적 조성물에서 사용된 것과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.

본 발명에 따른 건강기능식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 첨가하여 제조할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 영양보조제로는 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 첨가하여 제조할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건강기능식품으로는 예를 들면, 본 발명의 포스비틴 및 리소자임 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 포스비틴 및 리소자임을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 포스비틴 및 리소자임과 면역증강 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 포스비틴 및 리소자임을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01

0.04 g, 바람직하게는 약 0.02

0.03 g 이다.

또한, 본 발명의 포스비틴 및 리소자임은 면역증강용 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 면역증강작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 포스비틴 및 리소자임과 함께 면역증강용 조성물에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 추가적으로 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가적으로 함유할 수 있다. 상기 추가적으로 함유될 수 있는 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 함유 비율은 본 발명의 포스비틴 및 리소자임 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 용이한 수준에서 조절될 수 있다.

상기 ‘대식세포 활성화’는 상기 조성물을 대식세포에 처리하는 경우, 대식세포가 자극되어 조성물을 처리하기 전에 비하여 대식세포의 산화질소(NO), iNOS, TNF-α 또는 IL-1β의 생산량을 증가시키거나, 식세포 활성의 증가 등 대식세포의 활동이 증가되는 것들을 모두 포함하는 의미일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

세포주 및 배양의 준비

포스비틴(Phosvitin) 및 리소자임(lysozyme) 혼합물의 대식세포에 대한 면역증강효과를 측정하고자 하였다.

구체적으로, 한국세포주 은행(Seoul, Korea)으로부터 마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포주를 분양받아 사용하였다. 포스비틴과 리소자임(순도: 97%)은 계란으로부터 직접 분리하여 사용할 수도 있으나, 본 발명에서는 미국의 아이오와주립대학교(Iowa State University)로부터 제공받아 사용하였다.

세포주 배양에 필요한 DMEM 배지, FBS(Fetal bovine serum, 소태아혈청)은 하이클론 레바토리(HyClon Laboratories, Inc.; Logan, MI, USA)에서 구입하였으며, 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 등은 깁코-BRL(Gibco-BRL; Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다. 세포 생존률 측정을 위한 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 3-[4,5-다이메틸티아졸-2-일]-2,5-다이페닐 테트라졸륨 브로마이드) 시약과 N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민(N-(1-naphthyl)-ethylenediamine), 술파닐아미드(sulfanilamide), 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS), 암모늄 피롤리딘 다이티오카바메이트(ammonium pyrrolidine dithiocarbamate, NF-κB 억제자), LY 294002(PI3K 억제자) 및 SP 600125(MAPKs 억제자)는 시그마 케미칼(Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 그 외의 실험에 사용된 모든 용매 및 시약은 일급 이상의 것을 사용하였다. 세포 배양을 위해 DMEM 배지에 10% FBS, 100 unit/㎖의 페니실린(penicillin), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 인큐베이터(MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

대식세포에 대한 세포독성 측정

포스비틴(phosvitin)의 대식세포에 대한 세포독성 내지 세포생존률을 측정하기 위하여 MTT 분석을 실시하였다.

구체적으로, 활성화된 RAW 264.7(대식세포) 세포주를 2 × 10⁵ cells/well로 96 웰 플레이트(well plate)에 각각 분주하고, 포스비틴을 농도별(12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. PBS 완충액에 녹인 MTT(2.5 mg/㎖) 용액을 50 ㎕씩 각 웰에 첨가하여 4시간 추가 배양하며 포르마잔(formazan) 형성을 유도시키고, 반응 후 웰 바닥에 형성된 포르마잔이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 200 ㎕ 첨가하여 녹이고 마이크로플레이트 리더(microplate reader; Model 680, BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존률은 하기 수식과 같이 계산하였다.

그 결과, [도 1]에 나타나는 바와 같이 첨가농도와 무관하게 포스비틴은 대식세포에 세포독성을 보이지 않는 것으로 확인되었다.

대식세포의 산화질소(NO) 생성 측정

<3-1> 포스비틴 단독의 대식세포에 대한 효과

대식세포의 산화질소(nitric oxide, NO) 생성에 대한 포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme) 혼합물의 영향을 확인하고자 하였다.

구체적으로, RAW 264.7(대식세포) 세포주를 2 × 10⁵ cells/well로 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 4시간 동안 전 배양을 실시하였다. 포스비틴을 농도별(12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 양성대조군으로 LPS(lipopolysaccharide; 지방다당질, 10 ng/㎖)을 사용하였다. 발생된 산화질소는 그리스 시약(griess reagent; 증류수에 0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민 디하이드로클로라이드(N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride) 및 5% 인산(phosphoric acid)에 1% 술파닐아미드(sulfanilamide))를 이용하여 정량하였다. 상등액과 그리스 시약을 100 ㎕씩 혼합하고 15분 뒤 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 산화질소의 농도는 질산나트륨(sodium nitrate) 표준물질을 이용하여 얻은 표준곡선(standard curve)를 이용하여 정량하였다.

그 결과, [도 2]에 나타나는 바와 같이 포스비틴은 모든 농도에서 대식세포에서 NO 내지 iNOS(inducible NOS, 유도 NOS)의 생성량을 증가시키는 것을 보여주었다(P < 0.001).

<3-2> 포스비틴 및 리소자임의 대식세포에 대한 효과

구체적으로, 포스비틴과 리소자임을 각각 100 ㎍/㎖로 세포 배양배지에 녹인 후, 포스비틴과 리소자임을 2:8, 4:6, 5:5 및 6:4의 농도비로 혼합하여 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 대식세포에 처리한 후 NO 수준을 측정하였다. 이와 비교하기 위하여 포스비틴 또는 리소자임 단독의 효과도 확인하고자 혼합물에 해당하는 희석 배율만큼 희석한 각각의 시료를 대식세포에 단독으로 처리한 후 NO 수준을 측정하였다. 예를 들어, 혼합물의 농도비가 2:8 인 경우 포스비틴을 20 ㎍/㎖로(2:0), 리소자임을 80 ㎍/㎖로(0:8) 희석한 시료를 대식세포에 각각 처리한 후 NO 수준을 측정하였다. 대조군(control)은 시료 비처리군이다.

그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이 리소자임 단독으로 대식세포에 처리하는 경우 이의 NO 생성량에 거의 영향을 미치지 않았으며, 리소자임보다 포스비틴의 영향이 대부분 강하게 나타났다. 그러나, 포스비틴 및 리소자임이 6:4의 농도비로 포함되는 경우 양자 시너지 효과가 발생하여 대식세포의 NO 생성량이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

대식세포의 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 발현능 측정

대식세포의 TNF-α 또는 IL-1β 등의 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 발현에 대한 포스비틴(phosvitin)의 영향을 확인하기 위해 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR; qRT-PCR)을 이용하여 측정하였다.

RAW 264.7(대식세포) 세포주를 1 × 10⁶ cells/well로 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 24시간 동안 전배양을 실시하였다. 포스비틴을 농도별(12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간을 배양하였다. 양성대조군으로 LPS(10 ng/㎖)을 사용하였다. 배양이 끝난 뒤, RNeasy 미니 키트(RNeasy mini kit; Qiagen, Milan, Italy)를 이용하여 전체 RNA를 분리하였고, 리버트 에이트 제1가닥 cDNA 합성 키트(revert aid first strand cDNA synthesis kit; Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. SYBR 그린 키트(SYBR green kit; Phile Korea, Daejeon, Korea)를 이용하여 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 비교 정량하였다. 실험에 사용된 전염증 사이토카인의 프라이머 서열은 하기 [표 1]에 제시하였다. qRT-PCR은 다음 단계로 진행하였다. 95℃, 2분 (폴리머레이즈 활성화; polymerase activation); 40 cycle - 95℃, 5초(변성, denaturation); 65℃, 30초 (결합(annealing)/신장(extension)). 증폭 결과는 델타-델타 Ct(delta-delta Ct)법을 이용하여 확인하였고, β-엑틴을 하우스키핑(housekeeping) 유전자로 사용하였다.

유전자	설명	프라이머 서열		서열번호
iNOS	Inducible nitric oxide synthase	정방향	5'-cttggtgaggggactggact-3'	1
iNOS	Inducible nitric oxide synthase	역방향	5'-ggggttttctccacgttgtt-3'	2
TNF-α	Tumor necrosis factor-α	정방향	5'-atgagaagttcccaaatggc-3'	3
TNF-α	Tumor necrosis factor-α	역방향	5'-gaattttgagaagatgatctgagtg-3'	4
IL-1β	Interleukin-1β	정방향	5'-gttgacggacccaaccgat-3'	5
IL-1β	Interleukin-1β	역방향	5'-aaggtccacgggaaagacac-3'	6
β-Actin	-	정방향	5'-gattactgctctggctccta-3'	7
β-Actin	-	역방향	5'-atcgtactcctgcttgct-3'	8

그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이, 포스비틴의 첨가농도가 증가함에 따라 TNF-α, IL-1β의 발현이 함께 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 포스비틴가 50 ㎍/mL 인 경우, 양성대조군인 LPS와 유사하거나 그 이상임을 확인할 수 있었다.

대식세포의 식세포 활성(phagocytic activity) 측정

대식세포의 식세포 활성(phagocytic activity)에 대한 포스비틴(phosvitin)의 영향을 확인하기 위해 뉴트럴 레드 업테이크(uetral red uptake)법을 활용하여 측정하였다.

구체적으로, RAW 264.7(대식세포) 세포주를 2 × 10⁵ cells/well로 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 4시간 동안 전배양을 실시하였다. 포스비틴을 농도별(12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하고 24시간을 배양한 뒤, 상등액을 제거하고 0.075%의 뉴트럴 레드 용액(neutral red solution)을 100 ㎕ 처리한 뒤 30분을 추가 배양하였다. PBS를 이용하여 3번 세척 후 100 ㎕의 용해 완충용액(lysis buffer; ethanol: 0.01% glacial acetic acid= 1:1, (v/v))로 처리 한 후 15분 뒤 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, [도 5]에 나타나는 바와 같이, 포스비틴은 유의하게 대식세포의 식세포 작용을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다 (P < 0.001). 대조군과 비교하여 모든 실험 농도에서 식세포 작용이 증가하였으며, 특히 양성대조군으로 사용한 LPS보다도 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다. 포스비틴으로 인한 식세포 작용 활성의 증가는 포스비틴을 포함하는 경우 대식세포의 병원성균이나 암세포와 같은 외부 물질에 대한 초기 면역 반응의 활성을 증가시킬 수 있을 것으로 사료 된다.

포스비틴(phosvitin)의 대식세포 자극 경로(pathway) 확인

포스비틴(Phosvitin)이 대식세포를 활성화 시키는 경로(pathway)를 확인하기 위하여 NF-κB, Akt, MAPKs 억제자를 사용하여 실험을 진행하였다.

구체적으로, NF-κB 억제자인 PDTC(20 μM), Akt(PI3K) 억제자인 LY294002 (10 μM), MAPKs(JNK) 억제자인 SP600125 (20 μM)를 1% DMSO가 포함된 DMEM 배지에 녹여 RAW 264.7 대식세포 세포주에 4시간 선 처리 후, 포스비틴(100 ㎍/㎖)을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 대식세포가 생성한 산화질소(nitric oxide)의 양을 상기 [실시예 3]과 동일한 방법으로 정량하였다.

그 결과, [도 6]에 나타나는 바와 같이 NO의 발생량이 각각 45.09, 52.84, 27.09% 감소하는 것을 확인하였다. 이는 포스비틴의 대식세포 활성이 NF-κB, Akt, MAPKs 경로를 통함을 보여주었다.

통계 처리

모든 실험 결과는 평균과 표준편차로 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복을 수행하였으며, 각 실험마다 3회의 반복수를 진행하였다. 시료 간의 유의적인 차이를 확인하기 위하여 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)를 실시하였으며, SPSS 윈도우 버젼 18.0(SPSS Windows version 18.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였다.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP WithBio Inc. <120> Pharmaceutical and functional food composition comprising phosvitin and lysozyme for enhancing immunity <130> 1063137 <150> KR 10-2018-0033133 <151> 2018-03-22 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_iNOS_F <400> 1 cttggtgagg ggactggact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_iNOS_R <400> 2 ggggttttct ccacgttgtt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_TNFalpha_F <400> 3 atgagaagtt cccaaatggc 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_TNFalpha_R <400> 4 gaattttgag aagatgatct gagtg 25 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_IL-1beta_F <400> 5 gttgacggac ccaaccgat 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_IL-1beta_R <400> 6 aaggtccacg ggaaagacac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_beta-actin_F <400> 7 gattactgct ctggctccta 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_beta-actin_R <400> 8 atcgtactcc tgcttgct 18

Claims

포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 1.5:1 의 중량비로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물로서,
상기 조성물은 대식세포의 NO 의 분비를 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 조성물은 대식세포의 식세포 활성(phagocytic activity)를 증강시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
포스비틴(phosvitin) 및 리소자임(lysozyme)을 1.5:1 의 중량비로 포함하는 면역증강용 건강기능식품으로서,
상기 건강기능식품은 대식세포의 NO 의 분비를 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능식품.
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