KR101839186B1 - 망막세포 재생효과를 갖는 군소 추출물의 용도 - Google Patents
망막세포 재생효과를 갖는 군소 추출물의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 망막질환 예방 및 치료 효과가 있는 군소 유래 추출물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 군소 유래 추출물은 망막색소상피세포의 증식을 효과적으로 유도하여 망막질환을 효과적으로 치료 및 개선할 수 있고, 식품인 군소 유래인 것으로 세포 독성이 없어 인체에 안정성이 보장되고 부작용이 없다. 따라서, 본 발명의 군소 유래 추출물은 기존의 화학적으로 제조된 망막질환에 대한 치료 또는 개선용 인공 물질을 대체할 수 있다는 점에서 관련 산업에 폭넓게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 망막세포 재생효과를 갖는 군소 추출물의 약학적 용도 및 식품학적 용도에 관한 것이다.
최근 glycosaminoglycan(GAG)의 여러 가지 생물학적 활성이 알려짐에 따라 의약픔, 화장품 및 기능성식품의 소재로 화용하고 있으며, 기능성 분자로서 가치가 증가하고 있다(Volpi, 2006; Stephan, 2002). GAG는 성장인자와 사이토카인 생성을 조절하고(Day et al., 2009) 조직의 결합이나 특수한 조직의 성숙에 영향을 미치며 생물학적인 필터로서 역할을 수행하고 콜라겐 섬유합성과 피부의 인장강도를 조절할 뿐 아니라 암세포의 성장과 침윤에도 영향을 미친다(Izzo, 1998).
군소는 약탈자에 대하여 자신을 방어하고 서로의 정보 전달을 위해 복잡한 화학물질을 분비하는 패각이 없는 해산 패류이며, 이들이 분비하는 화학물질의 독특한 대사산물로 인하여 오랫동안 주목을 받았다(Barsby, 2006)Aplyronine A, B, Csms HeLa-S3 세포에 대하여 IC50이 각각 0.48, 3.11, 21.2 ng/mL인 강력한 세포독성을 나타내며, 특히 A는 항암작용이 있어서 항암제의 후보물질이다(Makoto et al., 2007; Hirata et al., 2006; Kuroda et al. 2006). 그러나 군소의 수용성 추출물에 대한 연구는 암세포의 세포사멸을 보고한 60 kDa의 잉크단백질(Butzke et al., 2004), 항암조성물에 대한 연구(KR102010002201, 1020100052254), 렉틴을 이용한 기질 특이적 GAG의 분리(Dawsar et al., 2009), 군소에서 GAG의 추출과 기능특성과 면역 조절효과(윤 등, 2010; 윤 등, 2010; 박 등, 2011)을 제외하고는 거의 이루어지지 않았으며, 특히 눈건강 기능성 화합물과 관련하여 군소의 육색소에 대한 연구는 이루어져 있지 않은 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 군소 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 다른 목적은 군소 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 개선용 건강기능성식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 군소 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 군소 추출물은 군소 유래 색소 추출물 또는 군소육 추출물인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 망막질환은 노화 관련 황반 변성 또는 녹내장인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 군소 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 군소 추출물은 군소 유래 색소 추출물 또는 군소육 추출물인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 망막질환은 노화 관련 황반 변성 또는 녹내장인 것일 수 있다.
본 발명의 망막질환 예방 및 치료 효과를 가지는 군소 추출물은 망막색소상피세포의 증식을 효과적으로 유도하여 망막질환을 효과적으로 치료 및 개선할 수 있고, 식품인 군소 유래인 것으로 세포 독성이 없어 인체에 안정성이 보장되고 부작용이 없다. 따라서, 본 발명의 군소 유래 추출물은 기존의 화학적으로 제조된 망막질환에 대한 치료 또는 개선용 인공 물질을 대체할 수 있다는 점에서 관련 산업에 폭넓게 이용될 수 있다.
본 발명은 망막질환 예방 및 치료 효과를 가지는 군소 추출물을 제공한다는 점에 그 특징이 있다.
특히 본 발명에서 제공하는 망막질환 예방 및 치료 효과를 가지는 군소 추출물은 군소 유래 색소 추출물 또는 군소육 추출물이다.
본 발명의 군소 유래 색소 추출물은 군소로부터 직접 분리하여 제조할 수 있다. 간략하게는 군소를 끓는 물에 블랜칭하여 유출되는 색소액을 회전진공증발기를 이용하여 농축한 뒤, 동결건조하여 군소 유래 색소 추출물 시료를 제조할 수 있다.
본 발명의 군소육 추출물은 군소를 끓는 물에 블랜칭 한 뒤의 군소육의 내장을 분리하여 제거 후 동결건조하여 분말화한 뒤, 군소육에 주정을 가하여 침지한 후 추출하고, 침전물을 여과한 후 여과액을 회전진공증발기로 농축하여 동결 건조하여 군소육 추출물 시료를 제조할 수 있다.
최근 보조 식품 및 대체 의약으로서 천연물 유래 생물 분자들의 개발과 수행을 위한 요구가 증가하고 있으며, 제약산업 연구를 위한 후보 물질로 사용되고 있다. 특히 천연 자원에서 얻은 이들 새로운 분자들은 일반 식품에서 유래하여 안전하기 때문에 유력한 치료제로 간주되고 있다.
군소의 수용성 추출물에 대한 연구는 암세포의 세포사멸을 보고한 60 kDa의 잉크단백질(Butzke et al., 2004), 항암조성물에 대한 연구(KR102010002201, 1020100052254), 렉틴을 이용한 기질 특이적 GAG의 분리(Dawsar et al., 2009), 군소에서 GAG의 추출과 기능특성과 면역 조절효과(윤 등, 2010; 윤 등, 2010; 박 등, 2011)을 제외하고는 거의 이루어지지 않았으며, 특히 눈건강 기능성 화합물과 관련하여 군소의 육색소에 대한 연구는 이루어져 있지 않은 실정이다.
따라서, 본 발명자들은 망막질환 치료 효과를 갖는 천연물 유래 소재에 관하여 연구하던 중, 군소 추출물이 망막질환을 예방 및 치료하는 효과가 매우 우수하다는 것을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 망막색소상피세포를 대상으로 군소 유래 색소 추출물, 군소육 추출물, 군소 점액다당 추출물을 각각 농도별로 처리한 결과, 3가지 추출물 모두 200 ug/mL의 농도까지 세포독성을 보이지 않음을 확인하였고, 이를 통해 본원발명의 군소 추출물은 세포독성이 없어 인체에 안정함을 확인하였다(표 1 참조).
또한 본 발명의 일실시예에 따르면, 망막색소상피세포를 대상으로 군소육 추출물, 군소육 추출물, 군소 점액다당 추출물을 농도별로 각각 처리하여 세포 증식능을 측정한 결과, 군소육 추출물은 1일과 3일 배양시 100 ug/mL의 농도에서 높은 증식효능을 보였으나, 3일째 200 ug/mL의 농도에서 세포독성을 나타내 증식능은 현저히 감소하였다. 그러나 군소 색소 추출물은 200 ug/mL의 농도에서 1일과 3일 배양까지 모두 농도 증가에 따라 증식능은 증가하는 경향을 보였고 3일 배양시 155.2%에 달하는 매우 높은 세포 증식효능을 보였다. 한편 군소 점액다당은 전 농도 범위에 걸쳐 유의적인 증식효능을 확인할 수 없었다. 이와 같은 결과를 통해 군소 체액의 색소 성분의 망막세포 재생효능을 확인하였고, 본원발명의 군소 추출물은 망막질환 예방 및 치료 효과가 우수함을 확인하였다(표 2 참조).
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 군소 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 군소 추출물은 군소 유래 색소 추출물 또는 군소육 추출물인 것일 수 있다.
상기 망막질환이란 노화 관련 황반 변성 또는 녹내장인 것일 수 있다.
상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 에탄올에서 선택되는 약학적 희석제중 1종 이상 포함할 수 있으며, 희석제는 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 투여목적 및 질병에 따라 상이하게 적용될 수 있다. 실질적으로 투여되는 활성 성분의 양은 다양한 관련 요소, 즉 치료하고자 하는 질병, 환자상태의 정도, 다른 약제(예를 들어 주화성 약제)와 공동 투여여부, 환자의 나이 성별, 체중, 음식, 투여시간, 투여경로, 및 조성물의 투여비율(ratio)을 고려하여 결정하여야한다. 상기 조성물은 투여량 및 투여경로가 질병의 형태 및 심각성에 따라 조절될 수 있으며, 하루에 한번 또는 1 내지 3번 나누어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 경구이외의 투여경로, 즉 직장, 정맥, 복막 및 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구, 및 피하를 통한 약제 투여를 의미한다.
상기 조성물은 경구 투여 형태, 주입 가능한 용액 또는 국소제제와 같은 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다.
제제화는 경구 및 주입 가능한 투여(진용액(true solution), 현탁액 또는 에멀젼)에 적합하도록 제조되는 것이 바람직하며, 정제, 캡슐, 연질캡슐, 수성 약제, 환제, 과립 등과 같은 경구 형태로 제조되는 것이 가장 바람직하다.
상기 제제화에서 본 발명의 추출물은 부형제(excipient)없이 연질 캡슐에 충전될 수 있고, 담지체와 혼합되거나 희석된 후에 적당한 제제로 만들어질 수도 있다. 적합한 담지체의 예로는 전분, 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 등이 있다.
상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물로 응용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류일 수 있다. 상기 포유류는 인간, 돼지, 소 또는 염소 등일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 약학 조성물은 본 발명에 따른 상기 추출물을 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제,글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 본 발명의 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
상기 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 본 발명의 추출물을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있다.
구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일예로, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 추출물을 기준으로 할 때, 0.000001 mg/kg/day 내지 1000 mg/kg/day로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은, 유효성분인 상기 본 발명의 추출물 이외에 공지의 망막질환 치료효과를 갖는 화합물, 특히 식품으로 사용되는 천연물 유래 물질을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 유효성분 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 100 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 본 발명의 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다.
본 발명의 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이며, 바람직하게는 껌 또는 캔디일 수 있다.
본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류, 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 기능성 식품은 망막질환의 예방 또는 개선에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 첨가제는 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 100,000 중량부, 바람직하게는 0.00001 내지 10,000 중량부 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 기능성음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 중량부 내지 20 중량부, 바람직하게는 1 중량부 내지 18 중량부, 더욱 바람직하게는 5 중량부 내지 12 중량부 포함될 수 있다.
또한, 망막질환의 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 본 발명의 추출물 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
실험 준비
<1-1>
재료 준비
본 발명의 실험에 사용한 군소(Aplysia kurodai)는 2014 11월부터 2015년 1월에 걸쳐 경남 통영 인근의 해역에서 해녀가 채집한 것으로, 살아있는 상태에서 구입하여 본 실험에 사용하였다.
<1-2>
세포배양 준비
본 발명의 실험에 사용한 망막색소상피세포 ARPE-19는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포주를 10 cm well plate에서 배양하여 1주일에 2-3회 계대하였으며, 배지는 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Lonza, Valais, Switzerland) medium을 함유한 성장배지를 이용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 배지는 2일에 한번 씩 교환하였다. 이때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline-EDTA(PBS-EDTA, Gibco, CA, USA)로 세척한 후 트립신 처리하여 계대 배양하였으며, 배지는 48시간마다 교환하여 세포를 배양하였다.
<1-3>
통계처리
모든 실험 결과는 3회 이상 반복한 실험값의 평균으로 표시하였다. 통계분석은 Student's t-test를 이용하였고, 대조군에 대한 통계적 유의성은 p<0.05수준에서 각 실험군 평균값 간의 유의성을 검증하였다.
<실시예 2>
<2-1>
군소육 색소 추출물의 제조
본 발명의 군소육 색소 추출물을 제조하기 위하여 살아있는 군소를 구입한 즉시 끓는 물에서 10 분 동안 불랜칭하여 유출되는 색소액을 40℃ 이하에서 회진진공증발기로 농축하여 동결건조한 후 군소색소 시료로 사용하였다.
<2-2>
군소육 시료의 제조
블랜칭 후의 군소의 육은 내장을 분리하여 제거한 후 동결건조하여 분말 상태로 20℃의 냉동고에 보관하였고, 군소육 시료를 제조하기 위해 동결건조 후 분말화 한 군소육에 5배량의 주정을 가하여 실온에서 7일 동안 추출하고, 4겹의 가아제로 침전물을 여과한 후 여과액은 40℃ 이하에서 회진진공증발기로 농축하여 동결 건조하여 군소육 시료로 사용하였다.
<2-3>
군소 유래 점액다당 추출물의 제조
군소 점액다당은 블랜칭하여 분리한 육을 meat grinder로 마쇄한 후, 5배의 물과 2%의 Flavozyme을 가해 60℃에 2시간 가수분해하고 30분간 끓여 효소를 불활성화시켰다. 효소 가수분해물을 원심분리(3,000 x g, 30분)하여 얻은 상등액을 40℃ 이하에서 회전진공증발기로 Brix 10 정도까지 농축한 후 5배량의 주정을 가해 단백질을 침전시켜 4겹의 가아제로 여과하여 제거하고 여액을 동결건조하여 점액다당 추출물로 사용하였다.
<실시예 3>
군소 유래 추출물의 세포 독성 측정
본 발명자들은 실시예 1-2의 세포를 대상으로 세포 독성 측정 실험을 수행하였다. 즉 세포 배양용 플라스크에 배양한 raw 264.7을 10% FBS(Lonza, Valais, Switzerland)가 함유된 DMEM/F12로 배양하였다. ARPE-19을 96 well plate에 2×105 cells/well의 농도로 100 μL씩 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. 시료의 최종 농도가 0.01, 0.1, 1, 10, 100 및 200 μg/mL가 되도록 조제한 배지를 분주한 세포에 100 μL씩 가하여 24시간 동안 배양하고 세포 생존률을 측정하였다. 세포주의 생존률을 측정하기 위해 Cell Titer 96 Aqueous One solution cell proliferation assay(Promega, WI, USA)을 이용하여 세포의 생존률을 측정하였다. 시약을 처리한 후 microplate reader(Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.
ARPE-19 세포주에 대하여 군소육 추출물, 군소육 추출물, 군소 점액다당 추출물을 농도별로 각각 처리하여 세포독성을 측정한 결과, 군소육 추출물, 군소육 추출물, 군소 점액다당 추출물 모두 200 ug/mL의 농도까지 세포독성을 보이지 않았다(표 1 참조).
| Sample(ug/ml) | Cell toxicity(%) | |
| Control | 100.0 ± 24.6 | |
| 군소육 | 0.1 | 125.6 ± 22.3 |
| 1 | 95.6 ± 17.4 | |
| 10 | 116.6 ± 4.9 | |
| 100 | 116.8 ± 14.9 | |
| 200 | 124.0 ± 15.9 | |
| 군소색소 | 0.1 | 122.1 ± 2.3 |
| 1 | 137.8 ± 6.7 | |
| 10 | 128.9 ± 13.4 | |
| 100 | 146.6 ± 15.4 | |
| 200 | 157.2 ± 13.3 | |
| 군소 점액다당 | 0.1 | 123.7 ± 12.4 |
| 1 | 114.1 ± 9.8 | |
| 10 | 115.7 ± 6.9 | |
| 100 | 122.7 ± 5.3 | |
| 200 | 100.2 ± 4.4 | |
<실시예 4>
군소 유래 추출물의 세포 증식능 측정
본 발명자들은 실시예 1-2의 세포를 대상으로 세포 증식능을 측정하였다. 즉, 세포 배양용 플라스크에 배양한 ARPE-19 세포주를 10 mL 피펫으로 세포를 플라스크에서 떼어내어 계대하였고, 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM/F12 배지로 배양하였다. ARPE-19 세포주를 0.5×105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고, 24시간 동안 35℃, 습도 95%, CO2 5%로 조절된 CO2 배양기에서 배양하였다. 새로운 배지에 시료를 최종 농도가 0.1, 1, 10, 100 및 200 μg/mL이 되도록 녹여 세포주에 처리한 후 1일, 3일, 5일 동안 배양하였다. 세포주의 증식능을 측정하기 위해 Cell Titer 96 Aqueous One solution cell proliferation assay(Promega, WI, USA)을 이용하여 세포의 생존률을 측정하였다. 시약을 처리한 후 microplate reader(Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하였다.
ARPE-19 세포주에 대하여 군소육 추출물, 군소육 추출물, 군소 점액다당 추출물을 농도별로 각각 처리하여 세포 증식능을 측정한 결과, 군소육 추출물은 1일과 3일 배양시 100 ug/mL의 농도에서 높은 증식효능을 보였으나, 3일째 200 ug/mL의 농도에서 세포독성을 나타내 증식능은 현저히 감소하였다. 그러나 군소 색소 추출물은 200 ug/mL의 농도에서 1일과 3일 배양까지 모두 농도 증가에 따라 증식능은 증가하는 경향을 보였고 3일 배양시 155.2%에 달하는 매우 높은 세포 증식효능을 보였다. 한편 군소 점액다당은 전 농도 범위에 걸쳐 유의적인 증식효능을 확인할 수 없었다. 이 같은 결과를 통해 군소 체액의 색소 성분의 망막세포 재생효능을 확인하였다(표 2 참조).
| Sample(ug/ml) | Cell viability, % | ||
| 1day | 3day | ||
| Control | 100.0 ± 8.1 | 100.0 ± 11.4 | |
| 군소육 | 0.1 | 130.6 ± 17.4* | 125.7 ± 17.9 |
| 1 | 130.2 ± 9.8* | 130.4 ± 9.5* | |
| 10 | 105.9 ± 11.7 | 152.7 ± 18.3* | |
| 100 | 122.6 ± 10.0* | 175.6 ± 19.8* | |
| 200 | 122.4 ± 19.4 | 67.6 ± 20.9* | |
| 군소색소 | 0.1 | 116.5 ± 8.4 | 103.9 ± 4.3 |
| 1 | 126.2 ± 11.4* | 100.4 ± 9.9 | |
| 10 | 120.3 ± 3.3* | 106.8 ± 0.2 | |
| 100 | 119.7 ± 5.2* | 121.3 ± 12.8 | |
| 200 | 131.5 ± 0.7* | 155.2 ± 9.3* | |
| 군소 점액다당 | 0.1 | 92.5 ± 22.2 | 106.7 ± 15.1 |
| 1 | 100.8 ± 11.0 | 126.2 ± 6.9 | |
| 10 | 103.3 ± 20.7 | 103.4 ± 14.8 | |
| 100 | 118.7 ± 3.7* | 115.2 ± 18.4 | |
| 200 | 86.2 ± 9.5 | 97.0 ± 11.0 | |
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (6)
- 군소 추출물을 유효성분으로 함유하는 망막색소상피세포 배양용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 군소 추출물은 군소 유래 색소 추출물 또는 군소육 추출물인 것을 특징으로 하는 망막색소상피세포 배양용 배지 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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|---|---|---|---|---|
| KR20230011167A (ko) | 2021-07-13 | 2023-01-20 | 임수복 | 손상된 망막상피세포에 대하여 세포사 억제 효과를 갖는 조성물 및 그 제조 방법 |
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| KR101173993B1 (ko) | 2012-01-13 | 2012-10-25 | 주식회사 내추럴솔루션 | 군소의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 항알러지 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법 |
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| KR20240041881A (ko) | 2021-07-13 | 2024-04-01 | 임수복 | 황반변성 치료 또는 예방용 조성물 |
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