KR101173993B1

KR101173993B1 - 군소의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 항알러지 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101173993B1
Application number: KR1020120004561A
Authority: KR
Inventors: 장문식; 정욱순; 유근실; 조은주
Original assignee: 주식회사 내추럴솔루션; 장문식
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2012-10-25

Abstract

본 발명은 군소(Aplysia kurodai)의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 항알러지 기능성 화장료 조성물과 건강기능성 식품조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

군소의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 항알러지 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법 {An anti-oxidant, anti-inflammatory or anti-allergic composition for cosmetics comprising essentially Aplysia kurodai ferments as an effective component and production method of the same}

본 발명은 군소(Aplysia kurodai)의 발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 항알러지 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 상기 군소의 육질부분을 동결건조한 군소를 80~100℃ 온도에서 1시간 동안 열수처리하여 수득한 추출물을 30~60℃, pH5.5~8.5의 조건에서 Bacillus subtilis 균주를 접종하여 24시간 발효시켜 121℃에서 30분간 스팀살균한 다음 4배수 부피의 정제수와 혼합하여 60℃에서 1시간 교반하여 여과하여 얻은 여액을 함유하는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

화장품 산업은 경기 침체속에서도 성장을 계속하고 있는 경기 방어적인 성격이 매우 강하다. 기능성 화장품은 기초 화장품 다음으로 높은 점유율을 나타내고 있으며, 기능성 화장품 중에서도 미백 화장품이 2001년부터 2006년 사이에 가장 높은 성장률을 나타내었다.

최근의 소비자 추세는 화학 합성된 기능성 화장품보다 천연물 소재의 기능성 화장품을 선호하고 있다. 이는 천연물이라는 이미지가 소비자에게 매우 친환경적이고 친근할 뿐만 아니라 그 효능, 효과 역시 오랜 시간 사람들이 직접 사용하여 어느정도 검증되어 구전되어 왔고, 다양한 천연물 소재가 존재하므로 선택의 폭이 넓기 때문으로 보인다.

그러나, 천연물 소재는 재배, 보관에 따라 성분 및 품질의 동질성 확보가 어렵고, 그 결과 유효성분의 함량이 균일하지 않을 수 있으며, 유효성분 또는 약리작용 성분이 불분명하며, 저장이 곤란하고, 대량 생산에 적합하지 않은 단점이 있다.

이에 공산품처럼 일정 품질의 식물 생산이 가능한 시스템적인 농업형태로서 식물 공장이 제안되었는데, 이는 최신 기술인 LED, 환경제어시스템, 로봇 자동화 공정 등을 도입한 첨단 IT기술이 융합된 농업형태이다.

군소(Aplysia kurodai)는 연체동물문 복족강 군소목 군소과에 속하는 연체동물이다.

군소와 관련하여, 대한민국 특허출원 제10-2011-0056283호 '군소추출물을 함유하는 피부보습 및 주름개선용 화장료 조성물'에서는 군소육질을 단백분해효소 flavozyme으로 가수분해시켜 원심분리한 상등액에 유기산을 첨가하여 단백질 분해 산물을 얻은 후 다시 유기용매를 첨가하여 불용성 물질을 그 화장료 조성물로 이용하는 발명에 대하여 기재하고 있다.

그러나 상기 선행기술은 제조과정이 복잡할 뿐더러 수분보유능에 따른 보습효과는 우수하나 특히 항산화 및 항알러지 기능 관련한 주름개선효과에 대하여 더 연구할 필요가 있었다.

본 발명은 상기한 점을 감안하여 안출한 것은 항산화, 항염 및 항알러지 기능성이 우수한 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기목적은 군소(Aplusia kurodai) 육질부의 열수추출물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 군소 열수추출물을 Bacillus subtilis 균주 1000cfu/g가 되도록 접종하여 24시간 고체발효한 다음 스팀살균한 군소 육질부의 고체발효물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명에 따르면 상기 고체발효물에 4배수 부피의 정제수로 60℃에서 1시간 동안 교반한 다음 원심분리하여 정제한 군소발효액을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명에 따르면 상기 군소발효액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명에 따르면, 항산화, 항염증 및 항알러지 기능성이 있는 화장품 원료용 군소(Aplysia kurodai) 육질부의 열수추출물과 그의 바실러스 서브틸리스(B.subtilis) 균주유래의 고체발효물을 제공하는 효과가 있다. 그뿐 아니라, 본 발명은 상기 고체발효물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증및 항알러지 기능성 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명 군소의 발효물을 발효전 추출물과 대비하여 대조구(control)와 함께 항산화 실험결과를 낸 그래프이다.
도 2는 본 발명 군소의 발효물을 발효전 추출물과 대비하여 항염증 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 군소의 발효물을 발효전 추출물과 대비하여 항알러지 실험결과를 나타낸 그래프이다.

본 명세서에서 사용되는 군소추출물이란 용어는 군소의 육질부를 동결건조한 후에 미생물 오염 차단 및 활성성분의 용출을 쉽게 하기 위해 80~100℃에서 1시간 동안 10배수의 열수로 추출한 후 여과한 것을 의미한다. 본 발명에서 군소의 원산지는 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 국내산 군소를 사용한다.

또, 본 명세서에서 사용되는 군소 발효물이란 용어는 상기 군소의 열수추출물을 60℃에서 제이인산칼슘으로 pH5.5로 조정한 완충용액(buffer solution)을 상기 추출물 기준 10%(v/v)를 분산시켜 Bacillus subtilis 균주를 1,000cfu/g가 되도록 접종하여 24시간 발효시킨 후 121℃에서 30분간 steam 살균하여 제균단계를 거친 후 여기에 다시 4배수 부피의 정제수(H₂O)를 첨가하고 60℃에서 1시간 교반 후 여과하여 회수한 것이다.

본 발명에서 발효방법으로는 당업계에 통상적으로 사용되는 발효 방법, 예컨대 고체 발효법을 적용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 군소 추출액을 바실러스 서브틸리스 균주로 발효시키면, 발효시키지 않은 대조군에 비해 피부 침투 활성이 크게 증가하였다.

본 발명의 군소 발효물은 조성물 100중량%를 기준으로 0.01 내지 5중량%로 화장료 조성물 또는 기능성 건강식품 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 군소 발효물을 포함하는 화장료 조성물은 통상적으로 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포움, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오즈 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 스프레이인 경우에는 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 다이메틸 에테르와 같은 촉진제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용된다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정질 셀룰로오즈 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 1일에 1회 내지 수회에 걸쳐 얼굴 등에 도포하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 건강식품 조성물은 조성물 100중량%를 기준으로 군소 발효물 0.01 내지 5중량%를 포함하는데, 만일 군소 발효물 0.01중량% 미만이 사용되면 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없고, 5중량%를 초과하여도 효과향상이 나타나지 않아 바람직하지 않다. 또한, 본 발명에 따른 기능성 건강식품 조성물은 비타민 E, L-시스틴, 글루타치온 및 셀레니움 고함유 효모 또는 이들의 추출물, 산화아연 및 황산아연 중에서 선택된 1종 이상의 보조성분을 추가로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 건강식품 조성물은 경구투여에 적합한 제형으로서, 예컨대 연질캅셀, 경질캅셀, 과립, 정제 등의 형태로 제형화할 수 있다. 이러한 조성물은 단위투여 제형으로 되는 것이 바람직하며, 이때 각 투여제형은 소정량의 유효성분과 함께 보조성분을 함유하는데, 약제 조성에 통상적인 제형방법에 따라 적당한 희석제, 담체 또는 기타 부형제를 선택하여 함께 혼합시켜 제형화할 수 있다. 가령, 정제는 활성충전제 외에 통상의 과립화제, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 안정화제, 착색제, 차광제, 감미제 및 조미제를 함유할 수도 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이므로, 본 발명을 이에 한정하는 것으로 해석해서는 안 된다.

본 발명에 사용된 군소는 시중에 유통되는 중국산 군소 및 대한민국에서 포획한 군소 동결건조물 100g을 미생물 오염차단 및 활성성분의 용출을 용이하게 하기 위해 80~100℃에서 1시간 10배수의 물로 추출한 후 여과한 열수추출물과 Bacillus subtilis균주를 접종하여 고체 발효한 발효물을 실험에 사용하였다. 군소 발효물은 상기 열수추출물을 60℃에서 제2인산칼슘으로 pH5.5가 되도록 조정한 buffer solution에 10%(v/v)분산하여 여기에 통상의 Bacillus subtilis 균주 1,000cfu/g가 되도록 접종하여 24시간 동안 고체 배양한 후 121℃에서 30분간 스팀살균하였다.

상기 멸균단계를 거친 군소 발효물에 4배수 부피의 정제수(H₂O)로 60℃에서 1시간 교반하여 여과액을 회수하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 효과를 실험 및 실시예를 통하여 확인한다.

<실시예 1> Nitric Oxide(NO) 저해능

염증의 발현 기전에는 다양한 매개체가 관여하고 있으며, 그 병의 원인도 다양하다. 대식세포에 endotoxin으로 알려져 있는 LPS(lipopolysachride)를 처리하면, iNOS(inducible NOS)발현에 의해 NO 생합성이 증가하며 염증반응이 유도된다. NO는 많은 세포들이 분비하는 병리적인 2차 신호전달 물질이며, COX의 활성을 조절하고 염증반응에 상승적으로 작용한다. Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NOS에 의해 생성되는 NO를 측정함으로써 추출물의 염증반응 억제 효과를 판정할 수 있다.

Mouse macrophage cell인 Raw 264.7 세포에 염증 유발 물질인 LPS를 인위적으로 처리한 후 염증 억제 효과가 있는지를 평가하였다. 96 well plate에 well 당 2 x 10⁵cell이 되도록 분주한 다음, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. Overnight 한 다음, 새로운 배지로 교환해주고, LPS(1㎍/mL)와 추출물을 1㎍/mL ~ 100㎍/mL 범위의 농도별로 투여하여 24시간동안 배양하였다. 배양 후, 배지 상층액을 취해 13,000 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 상등액만 모은 후, Griess reagent 시약과 1:1로 반응시키고, 570㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

<실험예 2> 항산화 활성 시험

세포에서의 에너지 생산에서는 미토콘드리아 호흡에 의한 부산물인 활성 산소종(ROS, reactive oxygen species)의 생성이 수반되며 이것은 단백질, 지방 및 핵산에 손상을 가져온다.

이러한 손상으로부터 세포 자체를 보호하기 위해 세포 내의 방어체계가 작동을 하지만 유리 라디칼의 생성과 항산화 체계의 균형이 깨어지면 산화스트레스가 세포에 작용하게 되어 신체노화를 비롯한 각종 성인병과 암의 주요 원인으로 작용한다.

따라서, 피부친화적이고 안정적인 식물을 원료로 항산화제 개발을 위해, 세포 내에 형성된 활성산소의 양을 측정하여 추출물에 대한 항산화능을 평가한다. DCFH-DA(2`,7`-dichlorofluorescin-diacetate)를 이용한 fluorimetric assay가 대표적인 평가법으로 DCFH-DA는 비극성분자로 용이하게 세포 내로 들어갈 수 있으며 세포 내의 esterase에 의해 비형광성 극성분자인 DCFH로 분리된 후 세포 내의 활성산소에 의해 산화되면 형광성 DCF(2`,7`-dichlorofluorescin)로 전환되게 되고 이를 fluorometer로 측정하는 방법이다.

피부 섬유아세포(HDFn)를 DMEM(10 % 혈청 첨가, 1 % 항생제 포함) 배지에 현탁하여 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 배양하고 대수기에서 성장하는 세포를 주로 실험에 사용하였다. Well당 약 1 x 10⁵세포 수가 되도록 96 well에 각각 접종한 후에 시료 추출물을 여러 dose로 처리한 후 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 20 분간 배양하였다. 그 다음, 산화스트레스 유발 물질인 H₂O₂ 1mM을 첨가하고, DCFH-DA(stock 20 mM) 20 μM를 가한 후 spectrofluorophotometer(excitation 485 nm, emission 535 nm)로 측정한다. 37 ℃에서 90분 동안 반응을 관찰하였다. 시료를 넣지 않고 활성 산소종 (Reactive oxygen species)의 형성만을 측정한 것을 대조군으로 정하고, 시료를 넣어 활성 산소종을 소거시키는 시료 처치군과 비교하여 활성 산소종 저해율을 구하고 모든 실험은 3번 반복하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

활성 산소종 저해율 (%) = (대조군 OD - 시료 처치군 OD) / 대조군 OD x 100

<실험예 3> 항알러지 시험

아토피성 피부염에서 혈중 호산구수와 혈청 IgE 양의 증가가 나타나며, 이는 아토피성 피부염의 대표적인 지표로서 아토피성 피부염의 초기반응은 항원의 자극에 의해 항체 IgE가 생산된 후 항체가 비만세포 표면의 high affinity receptor에 결합하였을 때 항원이 재침입하면 수용체와 결합하고 있는 항체와 결합하여 비만세포 내로 신호를 빠르게 전달하여 알러지를 일으키는 화학적 매개물질 (cytokine, histamine, leukotrienes)을 분비한다. Histamine 등의 매개물질에 의해서 혈관 투과성을 증가시키고, 혈관을 확장시키고, 평활근을 수축시키며, 분비선의 기능을 항진시키는 특징적인 반응을 일으키게 되며, 동반되는 염증반응에는 비만세포, 호산구, T세포에서 분비되는 인터루킨 등 여러가지 사이토카인에 의해 호산구가 염증 부위로 이동하는 것이 중요하다. Histamine과 함께 중요한 매개체로 작용하는 것으로 ß-hexosaminidase가 있으며, 세포로부터 ß-hexosaminidase 의 방출 또한 면역세포 탈과립의 지표로 사용된다.

비만세포의 탈과립 억제 시험(항알러지 시험) : RBL-2H3 cell을 10% FBS를 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 현탁시킨 후 24 well plate에 각 well당 2 x 10⁵cell이 들어가도록 처리한 다음 각 well당 100ng/mL의 mouse monoclonal IgE로 감작시킨 후 5% CO₂ incubator에서 24 시간동안 배양하였다. 세포를 well당 Tyrode buffer 500㎕를 사용하여 헹구어내고, 농도별로 혼합 추출물을 처리한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 15분간 배양하고, 한 시간 동안 DNP-BSA 100ng/mL를 처리하였다. 상층액에 substrate(1mM p-nitrophenyl-N-acetyl-ß-D-glucosaminide) 50㎕ 처리 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 한 시간 동안 incubation 한 후 ELISA reader를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었으며, 이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 항알러지 효능은 실험 최고 농도인 100㎍/mL의 농도에서 40~50%의 저해 활성을 나타내었다.

배합실시예 : 화장료 조성물의 제조

하기 구성성분을 사용하여 당업계에서 통상적인 방법에 따라 화장료 조성물을 제조하였다:

군소 발효물 3.0 중량%

부틸렌글리콜 2.0 중량%

프로필렌글리콜 6.0 중량%

카르복시비닐폴리머 0.5 중량%

밀납 2.0 중량%

바셀린 7.0 중량%

폴리솔베이트 60 2.0 중량%

솔비탄세스퀴올레이트 2.5 중량%

스쿠알란 3.0 중량%

유동파라핀 10.0 중량%

트리에탄올아민 0.5 중량%

토코페릴아세테이트 0.1 중량%

향료, 방부제 미량

정제수 잔량

Claims

군소(Aplysia kurodai) 열수추출물의 Bacillus subtilis 균주에 의한 발효물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 염증 및 알러지 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
군소 열수추출물의 Bacillus subtilis 균주에 의한 발효물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화 기능성건강식품 조성물.
삭제
청구항 1 기재의 약학적 조성물이 크림, 겔, 스프레이 중 어느 하나임을 특징으로 하는 피부질환 예방 및 치료제.