KR101379427B1

KR101379427B1 - 디메틸푸마레이트를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101379427B1
Application number: KR1020130015431A
Authority: KR
Inventors: 이인규; 박근규; 오창주
Original assignee: 경북대학교병원; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-02-13
Filing date: 2013-02-13
Publication date: 2014-03-28
Also published as: US9724320B2; US20160067206A1; WO2014126285A1; JP2016509020A

Abstract

본 발명은 디메틸푸마레이트(Dimethylfumarate, DMF)를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 디메틸푸마레이트는 Nrf2를 활성화시켜 TGF-β/Smad 신호를 저해시킴으로써 신섬유증을 감소하는 우수한 치료 효과가 있어, 신섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

디메틸푸마레이트를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating renal fibrosis comprising dimethylfumarate}

본 발명은 디메틸푸마레이트를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

섬유증(fibrosis)은 피부, 폐, 심장, 간장, 신장 등의 장기에서 세포외 기질 대사 이상이 관여하는 결합 조직 단백질의 과잉 침착을 특징으로 하는 질병이다. 섬유증은 임의의 기관 또는 조직내의 건강한 세포를 감소시킬 수 있고, 섬유증성 연결 조직의 덩어리가 증가하여, 결국 기관 또는 조직의 정상적인 구조를 손상시킬 수 있다. 이러한 손상은 영향을 받는 기관 또는 조직의 생리학적 및 생화학적 기능을 약화시킬 수 있고, 기관을 완전히 못쓰게 할수 있다. 기관 및 조직 섬유증에 대한 병원론, 진단 방법, 예방 및 치료 방법이 광범위하게 연구되어져 왔다. 그러나, 특히 효과적 치료제의 개발 분야에 있어서, 여전히 많은 과제가 있다.

섬유증의 발병 메카니즘은 현재 시점에서 충분하게 해명되었다고는 할 수 없지만 일반적으로, 기관 또는 조직의 섬유증은 복합적 인자, 예컨대 염증, 면역학적 반응, 허혈, 혈동력학적 변화 등(이는 연(軟)조직 세포의 염증성 변성 및 괴사를 일으킴)에 의해 야기된다. 이에 따라 손상된 연조직 세포는 대식세포를 활성화시켜 다수의 사이토카인 및 성장 인자를 방출하는데, 이중 TGF-β(transforming growth factor-beta)가 중요하다. TGF-β는 정지 세포외 기질성분(extracellular matrix: ECM)을 활성화시켜 세포를 생성하고, 이들을 근섬유아세포로 변환시킬 수 있다. 새롭게 형성된 섬유아세포는 ECM의 핵심 단백질인 콜라겐의 생성을 증가시킬 뿐만 아니라, ECM의 파괴를 감소시킨다. 순 결과는 세포외 기질성분의 축적이고, 이는 기관 또는 조직의 섬유증을 유도한다. 따라서, 기관 또는 조직 섬유증의 개시 및 진행은 염증성 반응 및 염증성 사이토카인, 주로 TGF-β의 생성의 결과이다. ECM 축적, 및 기관 또는 조직 섬유증의 형성에 대한 TGF-β의 결정적인 역할에 기인하여, 논리적으로, 항-섬유증 약물의 초기 개발에 있어서의 중요한 목표중 하나는 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인, TGF-β(transforming growth factor-beta)의 생성을 저해할 수 있는 화합물을 조사하는 것이다.

한편, 디메틸푸마레이트(Dimethylfumarate, DMF)는 외부 산화적스트레스 (oxidative stress)에 대항하여 세포 내 항산화효소(antioxidant enzymes) 및 phase Ⅱ 독소제거효소(phase Ⅱ detoxification enzymes) 생산에 중요한 전사조절인자인 Nrf2를 활성화시키는 물질로 알려져 있다. 또한 피부질환인 건선 (psoriasis) 치료에 사용되는 약물로 다발성신경병증(multiple sclerosis)치료에 효과가 있으며 현재 임상단계에 있다. 그리고 암 전이(metastasis)를 저해하는 것과 함께 암세포의 증식을 억제한다는 보고가 있지만, 디메틸푸마레이트가 신섬유증 치료와 개선에 관한 연구는 아직 보고된바 없다.

이에 본 발명자들은 신규한 신섬유증 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 디메틸푸마레이트가 Nrf2를 활성화시켜 신섬유증 감소효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 디메틸푸마레이트(Dimethylfumarate, DMF)를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 디메틸푸마레이트를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 디메틸푸마레이트를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 발명은 디메틸푸마레이트를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 디메틸푸마레이트는 Nrf2를 활성화시켜 TGF-β/Smad 신호를 저해시킴으로써 신섬유증을 감소하는 우수한 치료 효과가 있어, 신섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 디메틸푸마레이트가 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴 및 콜라겐Ι 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 디메틸푸마레이트가 TGF-β/Smad3 신호경로 감소에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 Nrf2가 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴 및 콜라겐Ι의 발현 억제에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 Nrf2가 TGF-β/Smad3 신호경로 감소에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 항산화 효소인 NQO1 및 HO-1과 TGF-β/Smad 신호경로의 연관성을 나타낸 도이다.
도 6은 디메틸푸마레이트가 UUO에 의해 동물 모델에서 유도된 신섬유증 (renal fibrosis)에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

본 발명은 디메틸푸마레이트를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 디메틸푸마레이트는 Nrf2 발현을 증가시킴으로써 TGF-β/Smad3을 감소시키고, 세포외 기질(Extracellular matrix)의 발현을 억제하여 신섬유증을 감소시킨다. 따라서 본 발명에 따른 디메틸푸마레이트는 신섬유증의 예방 또는 치료에 유용한 의약품 또는 건강식품으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 디메틸푸마레이트와 함께 신섬유증의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 디메틸푸마레이트의 일일 투여량은 약 10~100㎎/㎏, 바람직하게는 약 25~50㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 신섬유증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 디메틸푸마레이트는 신섬유증에 대한 예방 또는 개선 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 디메틸푸마레이트를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 디메틸푸마레이트를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 바람직하게는 약 0.04~0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 디메틸푸마레이트의 TGF-β에 의해 증가된 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴 및 콜라겐Ι 발현 억제 확인.

1. 디메틸푸마레이트 처리시 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴 및 콜라겐Ι의 발현량 확인

디메틸푸마레이트 처리시 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴 및 콜라겐Ⅰ의 발현을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 신장기질세포(renal fibroblast cell, NRK-49F)를 12시간 동안 굶긴 후에 디메틸푸마레이트를 1시간 동안 처리하였다. 그 후 TGF-β(transforming growth factor-beta)(2ng/ml)를 처리하여 PAI-1(plasminogen activator inhibitor 1), α-SMA(alpha-smooth muscle actin), 피브로넥틴(Fibronectin), 콜라겐Ι(Collagen typeΙ)과 같은 세포외 기질 (Extracellular matrix)의 발현이 디메틸푸마레이트(DMF)에 의해 감소되는지를 반정량적인(semi-quantitative) RT-PCR을 통하여 확인하였다. 이의 결과를 도 1A(6시간), B(24시간)에 나타내었다.

도 1A, B에 나타난 바와 같이, 디메틸푸마레이트가 처리되지 않은 대조군에 비하여 디메틸푸마레이트를 처리한 군의 경우 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴, 콜라겐Ι의 발현 양이 감소하는 것을 확인하였다.

2. 디메틸푸마레이트 처리시 PAI-1, α-SMA의 상대적인 mRNA 발현량 확인

NRK-49F 세포를 디메틸푸마레이트에 1시간 동안 처리 후에 TGF-β(2ng/ml)로 6시간 동안 자극하였다. 그 후 PAI-1, α-SMA의 mRNA 발현량을 실시간 RT-PCR 분석하여 디메틸푸마레이트의 효과를 확인하였다. 데이터는 독립적인 세번의 측정을 하였으며 평균±SEM(표준편차)은 다음과 같다. ^*P<0.01 vs. 대조군; ^**P<0.01, ^#P<0.001 vs. TGF-β 자극(도 1C 상단 그림); ^*P<0.001 vs. 대조군; ^**P<0.01, ^#P<0.001 vs. TGF-β 자극(도 1C 하단 그림). 이의 결과를 도 1C에 나타내었다.

도 1C에 나타난 바와 같이, 디메틸푸마레이트가 처리되지 않은 대조군에 비하여 디메틸푸마레이트를 처리한 군의 경우 PAI-1, α-SMA의 mRNA 발현량이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

3. 디메틸푸마레이트가 PAI-1 발현에 미치는 영향 확인

TGF-β에 의하여 자극된 NRK-49F 세포와 RMC(rat mesangial cell)에 디메틸푸마레이트를 처리하여 PAI-1의 발현을 웨스턴 블랏(Western blot) 분석법을 통해 확인하였다. 이의 결과를 도 1D(NRK-49F), E(RMC)에 나타내었다.

도 1D, E에 나타난 바와 같이, NRK-49F 및 RMC 세포 모두 디메틸푸마레이트가 처리되지 않은 대조군에 비하여 디메틸푸마레이트가 처리된 군은 PAI-1의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

[실시예 2] 디메틸푸마레이트의 TGF-β/Smad3 신호경로 감소 확인.

1. TGF-β에 의해 자극된 PAI-1-Luc와 (CAGA) ₉ MLP-Luc 리포터(reporter) 구조의 디메틸푸마레이트에 의한 효과 확인

AD-293 세포를 24시간동안 ALK5(TGF-β구조활성 타입Ⅰ수용체)가 있거나 없는 PAI-1-Luc 또는 (CAGA)₉MLP-Luc 플라스미드에 형질감염 시켰다. 상기 세포를 12시간동안 영양 결핍시킨 후 TGF-β(2ng/ml)로 5시간 동안 자극을 주었고, RLU 값을 측정하였다. 데이터는 독립적인 세번의 측정을 하였으며 평균±SEM은 다음과 같다. (A) ^*P<0.001 vs. 리포터(reporter) 단독; ^**P<0.001,^***P<0.01 vs. TGF-β 자극(도 2A 왼쪽). ^#P<0.05 vs. 리포터(reporter) 단독; ^**P<0.01,^***P<0.05 vs. ALK5 자극(도 2A 오른쪽). (B) ^*P<0.01 vs. 리포터(reporter) 단독; ^**P<0.01 vs. TGF-β 자극(도 2B 왼쪽). ^*P<0.01 vs. 리포터(reporter) 단독; ^**P<0.05,^***P<0.01 vs. ALK5 자극(도 2B 오른쪽). 이의 결과를 도 2A, B에 나타내었다.

도 2A, B에 나타난 바와 같이, PAI-1-Luc 및 (CAGA)₉MLP-Luc 형질감염된 경우 모두 디메틸푸마레이트를 처리하지 않은 대조군에 비하여 디메틸푸마레이트가 처리된 군은 RLU 값이 낮게 나왔다.

2. TGF-β에 의해 자극된 Smad3 인산화에 대한 디메틸푸마레이트의 영향 확인

TGF-β에 의해 자극된 Smad3 인산화에 대한 디메틸푸마레이트의 영향을 웨스턴 블랏을 통해 확인해 보았다. 결핍된 NRK-49F세포와 RMC(rat mesangial cell) 세포를 디메틸푸마레이트에 한시간동안 미리 처리해 둔 후, TGF-β(2ng/ml)로 1시간 동안 자극을 주었다. 데이터는 독립적인 세번의 측정을 하였으며 막대 그래프는 평균±SEM을 의미한다. (C)^*P<0.01 vs. 대조군, ^**P<0.05 vs. TGF-β 자극. (D) ^*P<0.001 vs. 대조군, ^**P<0.05, ^#P<0.01, ^##P<0.001 vs. TGF-β 자극. 이의 결과를 도 2C(NRK-29F), D(RMC)에 나타내었다.

도 2C, D에 나타난 바와 같이, TGF-β에 의해 증가된 Smad3의 인산화는 디메틸푸마레이트 농도의존적으로 감소함을 확인하였다.

[실시예 3] Nrf2의 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴, 콜라겐Ι의 발현 억제

1. 디메틸푸마레이트 처리 시 Nrf2 발현 증가 확인

혈청이 포함되지 않은 배지에서 굶긴 NRK-49F세포(Serum-starved cell) 및 RMC세포에서 항산화효소 발현의 전사인자인 Nrf2의 발현과 디메틸푸마레이트(40μmol/l)의 관계를 살펴보기 위해, 상기 두 세포의 Nrf2의 발현량을 서던블랏을 통해 시간대 별로 확인하였다. 이의 결과를 도 3A(NRK-49F 세포), E(RMC 세포)에 나타내었다.

도 3A, E에 나타난 바와 같이, 디메틸푸마레이트를 처리한 경우 Nrf2의 발현량이 증가함을 확인하였다.

2. Nrf2 과발현 시 세포외 기질성분의 발현 감소 확인

아데노신바이러스(Ad-Nrf2)를 이용하여 Nrf2를 과발현 시켰을때 콜라겐Ι을 비롯한 세포외 기질 성분의 발현에 미치는 영향을 RNA 수준에서 확인하기 위하여, 24시간 동안 결핍된 NRK-29F세포를 Ad-Nrf2로 감염시켰다. 그 후 TGF-β(2ng/ml)로 6시간, 12시간 또는 24시간 동안 자극을 주었다. 이의 결과를 도 3B(6시간), C(12시간), D(24시간)에 나타내었다.

도 3B, C, D에 나타난 바와 같이, Ad-Nrf2에 의하여 증가된 Nrf2가 콜라겐Ι을 비롯한 세포외 기질성분의 발현을 유의하게 감소함을 RNA 수준에서 확인하였다.

3. Nrf2 과발현 시 RNA 및 단백질 수준에서 세포외 기질성분 발현 감소 확인

아데노신바이러스(Ad-Nrf2)가 세포외 기질성분 발현에 주는 영향을 단백질 수준에서 확인하기 위하여, TGF-β에 의해 자극된 RMC 세포에 Ad-Nrf2를 감염시켜 서던블랏으로 PAI-1의 단백질 발현량을 확인하였다. 또한 TGF-β 또는 ALK5로 자극된 AD-293세포를 통해 Nrf2의 효과를 알아보았다. 여기서 AD-293 세포는 PAI-1-Luc 플라스미드와 Nrf2-발현 플라스미드, ALK5 발현 플라스미드가 있거나 제외한 것과 24시간 동안 상호감염(cotransfect) 한 후, 12시간 동안 혈청이 포함되지 않은 배지에서 굶기고 TGF-β에 5시간동안 자극을 주었다. 이의 결과를 도 3F,G에 나타내었다.

도 3F에 나타난 바와 같이, Ad-Nrf2가 PAI-1의 발현을 유의미하게 감소시킨다는 것을 확인하였다.

또한 도 3G에 나타난 바와 같이, Nrf2가 TGF-β 또는 ALK5에 의해 자극되어 발현이 촉진된 PAI-1-Luc의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다.

[실시예 4] Nrf2의 TGF-β/Smad3 신호경로 감소.

1. Ad-Nrf2가 Smad3 인산화에 미치는 영향 확인

NRK-49F세포와 RMC 세포를 24시간 동안 혈청이 포함되지 않은 배지에서 굶긴 후, Ad-GFP 또는 Ad-Nrf2에 감염시키고 TGF-β로 1시간 동안 자극하였다. 그리고, 두 세포에서 발현된 Smad3 인산화 정도를 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 데이터는 독립적인 세번의 측정을 하였으며, 막대 그래프는 평균±SEM를 의미한다. (A)^*P<0.01 vs. 대조군, ^**P<0.05 vs. TGF-β 자극. (B) ^*P<0.001 vs. 대조군, ^**P<0.05, ^#P<0.01 vs. TGF-β 자극.이의 결과를 도 4A(NRK-49F), B(RMC)에 나타내었다.

도 4A, B에 나타난 바와 같이, Ad-Nrf2의 양이 증가할 수록 Nrf2의 발현량은 증가하였고, p-Smad3(인산화 된 Smad3)의 발현량은 감소하는 것을 확인하였다(위쪽 그림). 그리고 Ad-Nrf2를 처리한 경우, p-Smad3/Smad3의 비율이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

2. Nrf2-siRNA에 의한 Nrf2 발현 증가 확인

디메틸푸마레이트에 의해 증가된 Nrf2가 세포외 기질 성분의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 먼저 Nrf2 siRNA(small interfering RNA)를 사용한 경우 Nrf2의 발현을 감소여부를 확인하였다. 실험은 AD-293세포를 Nrf2-siRNA와 대조군 (scrambled siRNA)으로 각각 감염시킨 후 24시간 동안 배양하였다. 그리고 혈청 없는 배지에서 12시간 동안 배양후 디메틸푸마레이트(40μmol/l)를 1시간 처리하고 반정량적인(semi-quantitative) RT-PCR을 하였다. 이의 결과를 도 4C에 나타내었다.

도 4C에 나타난 바와 같이, Nrf2-siRNA를 처리한 경우가 대조군에 비하여 NRf2의 발현이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

3. Nrf2-siRNA가 (CAGA) ₉ MLP-Luc 발현에 미치는 영향 확인

디메틸푸마레이트에 의해 억제된 (CAGA)₉MLP-Luc의 활성(TGF-β 처리됨)에 대한 Nrf2-siRNA의 효과를 알아보았다. AD-293세포를 12시간동안 혈청이 포함되지 않은 배지에서 굶긴 후에, (CAGA)₉MLP-Luc에 대조군-siRNA 또는 Nrf2-siRNA를 24시간 동안 상호감염(cotransfection)을 하였다. 그 후 TGF-β로 5시간 동안 자극을 준 후 디메틸푸마레이트(40μmol/l)로 1시간동안 처리하였다. 데이터는 독립적인 세번의 측정을 하였으며 막대 그래프는 평균±SEM을 의미한다. ^*P<0.01 vs. 리포터 (reporter) 단독, ^**P<0.05 vs. TGF-β 자극, ^***P<0.05 vs. 디메틸푸마레이트를 처리한 대조군-siRNA. 이의 결과를 도 4D에 나타내었다.

도 4D에 나타난 바와 같이, Nrf2-siRNA를 처리한 경우가 대조군에 비해 (CAGA)₉MLP-Luc의 RLU 값이 높은 것을 확인하였다.

4. Nrf2-siRNA의 콜라겐Ι mRNA발현에 대한 효과 확인

디메틸푸마레이트에 의해 억제된 콜라겐Ι mRNA 발현(TGF-β처리됨)에 대한 Nrf2-siRNA의 효과를 알아보았다. NRK-29F 세포를 24시간 동안 대조군-siRNA와 Nrf2-siRNA에 감염시킨 뒤, 12시간 동안 굶겼다. 세포들은 디메틸푸마레이트(10μmol/l)로 1시간동안 미리 처리하였고, TGF-β로 24시간동안 자극을 준 후에 반정량적인(semi-quantitative) RT-PCR 분석에 사용하였다. 이의 결과를 도 4E에 나타내었다.

도 4E에 나타난 바와 같이, Nrf2-siRNA의 첨가로 인해 콜라겐Ι의 발현량이 회복되는 것을 확인하였다.

[실시예 5] 항산화 효소인 NQO1 및 HO-1과 TGF-β/Smad 신호경로의 연관성

1. 디메틸푸마레이트와 HO-1, NQO1의 관계 확인

NRK-49F 세포에서 디메틸푸마레이트에 따른 활성화 효소인 HO-1(heme-oxygenase-1)와 NQO1의 발현량을 확인하였다. 세포는 디메틸푸마레이트(40μmol/l)을 처리하였으며 반정량적인(semi-quantitative) RT-PCR 분석을 수행하였다. 결과를 도 5A에 나타내었다.

도 5A에 나타난 바와 같이, 디메틸푸마레이트를 처리한 경우 NQO1, HO-1의 발현량이 증가한 것을 볼 수 있었다.

2. NQO1와 HO-1의 (CAGA) ₉ MLP-luciferase 활성의 하향조절(downregulation) 효과 확인

AD-293세포의 NQO1과 HO-1 mRNA 발현에 대한 siRNA의 효과를 반정량적인 (semi-quantitative) RT-PCR로 확인하였다.

또한, AD-293세포를 일시적으로 (CAGA)₉MLP-luc 리포터(reporter) 구조와 NQO1 또는 HO-1에 대한 siRNA에 감염시킨 후에 12시간 동안 혈청이 포함되지 않은 배지에서 굶겼다. 세포들은 1시간 동안 디메틸푸마레이트(40μmol/l)로 미리 처리되었으며 5시간 동안 TGF-β(2ng/ml)로 자극을 한 뒤 RLU값을 측정하였다. 데이터 평균±SEM은 세 번의 독립적인 측정에 의하였다. (C)^*P<0.05 vs. 리포터(reporter) 단독, ^**P<0.05 vs. TGF-β 자극, ^#P<0.05 vs. 디메틸푸마레이트 처리된 TGF-β 자극(도 5C 위); ^*P<0.05 vs. 리포터(reporter) 단독, ^**P<0.05 TGF-β 자극(도 5C 아래). 이의 결과를 도 5B,C에 나타내었다.

도 5B에 나타난 바와 같이, NQO1 및 HO-1 siRNA에 의하여 NQO1, HO-1의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 5C에서 나타난 바와 같이, 디메틸푸마레이트에 의해 감소된 (CAGA)₉MLP-luc 프로모터의 활성이 이들 siRNA에 의해 회복되지 않았다.

3. NQO1 및 HO-1 siRNA가 세포외 기질에 미치는 영향 확인

TGF-β로 자극된 NRK-49F 세포에서 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴의 mRNA 발현의 디메틸푸마레이트 매개성 억제가 NQO1 또는 HO-1에 의해 녹다운(knock-down) 되는지 알아보았다. NRK-49 세포는 NQO1 또는 HO-1에 대한 siRNA로 24시간 동안 감염시켰다. 혈청이 포함되지 않은 배지에서 굶긴 세포를 디메틸푸마레이트(40μmol/l)에 1시간 동안 미리 처리한 후 TGF-β(2ng/ml)로 6시간 동안 자극을 준 후에 반정량적인(semi-quantitative) RT-PCR을 수행하였다. 이의 결과를 도 5D에 나타내었다.

도 5D에 나타난 바와 같이, 대조군-siRNA를 처리한 군에 비교하였을때, NQO1-siRNA 및 HO-1-siRNA를 처리한 군의 경우 PAI-1, α-SMA, 피브로넥틴 모두 차이가 없는 것을 확인하였다. 이를 통해 디메틸푸마레이트에 의해 감소된 세포외 기질성분의 발현에는 이들 항산화 효소를 통한 활성산소(Reactive oxygen species, ROS)와는 관련이 없음을 확인하였다.

[실시예 6] 디메틸푸마레이트의 마우스에 발생한 UUO(Unilateral ureteral obstruction)에 의해 유도된 신섬유증(renal fibrosis)에 대한 효과 확인.

디메틸푸마레이트가 세포외 기질성분의 발현에 영향을 주는지 마우스 모델의 조직염색을 통해 확인하였다. 구체적으로는, Nrf2와 NQO1의 발현 정도는 면역조직화학염색(immunohistochemical staining)을 통해 확인하였고, 콜라겐Ι의 발현 정도는 시리우스-레드(Sirius-Red) 염색과 트리크롬 (Trichrome)염색을 통해 확인하였다. 동물실험은 UUO(Unilateral ureteral obstruction) 모델을 이용하였고, 경구투여(gavage)를 통해 디메틸푸마레이트를 먹인 그룹(25mg/kg)과 먹이지 않은 그룹으로 나누어, UUO 수술 뒤 일주일 뒤에 마취하여 그룹별로 신장을 얻었다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6A에 나타난 바와 같이, 디메틸푸마레이트를 먹인 그룹에서 Nrf2과 표적 단백질인 NQO1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

도 6B에 나타난 바와 같이, 디메틸푸마레이트를 먹인 그룹에서 콜라겐Ι의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.

도 6C에 나타난 바와 같이, 디메틸푸마레이트를 먹인 그룹에서 콜라겐Ι과 α-SMA의 발현이 감소함을 확인하였다.

도 6D에 나타난 바와 같이, 실시간 PCR을 통해 α-SMA, 피브로넥틴, 콜라겐Ι의 RNA 발현을 확인한 결과, 디메틸푸마레이트를 먹인 그룹에서 현저히 세포외 기질 성분의 발현이 감소함을 확인하였다.

도 6E에 나타난 바와 같이, 인산화된 Smad3의 발현이 디메틸푸마레이트를 먹인 그룹에서 감소함을 확인하였다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

디메틸푸마레이트 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

디메틸푸마레이트 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

디메틸푸마레이트 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 2 : 식품의 제조

본 발명의 디메틸푸마레이트를 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

디메틸푸마레이트 20~95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

디메틸푸마레이트 0.2~1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

디메틸푸마레이트 0.5~5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

디메틸푸마레이트 0.1~5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

디메틸푸마레이트 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

디메틸푸마레이트 5~10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 3 : 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여 본 발명의 디메틸푸마레이트을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 디메틸푸마레이트을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

디메틸푸마레이트 5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

디메틸푸마레이트 1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

Claims

디메틸푸마레이트(Dimethylfumarate, DMF)를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 디메틸푸마레이트는 Smad3 인산화를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 신섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 디메틸푸마레이트는 TGF-β/Smad 신호를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 신섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 디메틸푸마레이트는 Nrf2 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 신섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
디메틸푸마레이트를 유효성분으로 포함하는 신섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.