KR20130087174A - 브로콜리 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
브로콜리 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 브로콜리의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 브로콜리의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 건강기능성식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 브로콜리의 열수 추출물은 염증질환의 원인이 되는 산화질소의 생성을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라 이러한 산화질소의 생성을 유도하는 iNOS 단백질의 발현을 억제하는 활성이 우수한 특징이 있으므로 과도한 산화질소 유발에 의해 발병하는 각종 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제 및 건강기능성 식품으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 항염증의 제공을 위해 브로콜리 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 조직 또는 세포의 손상이나 외부감염원, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질 등에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상이 나타난다.
정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상인 과민성질환과 만성 염증이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.
생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제 (nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin; PGs)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제(NOS)나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 시클로옥시게나제(COX)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 표적이 되고 있다.
최근의 연구 결과에 따르면, 니트릭옥사이드 신타제(nitric oxide synthase; NOS)는 몇 가지 종류가 존재하는데, 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질로 인해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다.
따라서 염증 질환을 치료하기 위한 치료제 및 치료 방법으로 iNOS에 의해 발생되는 산화질소의 생성을 차단하는 방법 및 치료제들이 개발되고 있는데, 특히 이러한 종래 기술로는 대한민국등록특허 제1070324 호에 “마크로락틴 에이 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항염제 조성물”에 대한 내용이 개시되어 있으며, 대한민국공개특허 제2009-0015766 호에는 “8 - 토실아미노퀴놀린을 함유하는 염증성 질병, 면역질환 또는 종양의 예방 또는 치료용 조성물”에 대한 내용이 개시되어 있고, 대한민국등록특허 제0846437호에는 “테오페더린 유도체를 함유하는 약제학적 조성물, 건강식품 조성물 및 유발형 산화질소합성효소 활성 억제제 조성물”에 대한 내용이 개시되어 있다.
한편, 종래 개발된 산화질소 생성 차단을 통한 염증질환 치료제들은 대부분이 합성 화합물로서 체내에서 예상치 못한 부작용이 일어나는 등 다양한 문제점이 일어나고 있어, 체내에 대해 안정성이 인정된 천연물로부터 새로운 염증 질환 치료제의 개발이 시도되고 있다.
천연물로부터 산화질소 생성 차단을 통한 염증질환 치료제를 개발하려고 시도되고 있는 종래 기술을 살펴보면, 대한민국공개특허 제2010-0032134호에는 “녹차씨 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물“에 대한 내용이 개시되어 있고, 대한민국공개특허 제2011-0063627호에는 “죽력 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물”에 대한 내용이 개시되어 있으며, 대한민국공개특허 제2004-0084376호에는 “클로렐라 추출물을 함유하는 항염증용 약학 조성물”에 대한 내용이 개시되어 있다.
그러나 아직까지 브로콜리를 염증 치료제의 약제로 사용할 수 있는 내용에 대해서는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 천연물인 브로콜리를 이용하여 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 약제를 개발하기 위해 연구하던 중, 브로콜리의 열수 추출물이 염증을 유발시키는 원인인 산화질소의 생성을 억제하고 iNOS의 단백질 발현을 효과적으로 억제함을 통해 항염 활성을 갖는 다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 브로콜리 열수 추출물은 브로콜리 건조 분쇄물 중량에 대해 5~15배 중량에 해당하는 증류수를 첨가한 후, 20~121℃의 온도에서 1~2시간 동안 열수 추출하여 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 브로콜리 열수 추출물은 35~45℃의 온도에서 1~2시간 동안 열수 추출하여 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 브로콜리 열수 추출물은 iNOS(inducible NO synthease)의 발현을 감소시켜 산화질소의 생성을 억제함을 통해 항염 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증질환은 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염, 만성 부비동염, 급성화농성 중이염, 만성화농성 중이염, 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴, 바이러스성 폐렴, 급성 또는 만성 위염, 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증질환은 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염, 만성 부비동염, 급성화농성 중이염, 만성화농성 중이염, 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴, 바이러스성 폐렴, 급성 또는 만성 위염, 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 브로콜리의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 건강기능성식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 브로콜리의 열수 추출물은 염증질환의 원인이 되는 산화질소의 생성을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라 이러한 산화질소의 생성을 유도하는 iNOS 단백질의 발현을 억제하는 활성이 우수한 특징이 있으므로 과도한 산화질소 유발에 의해 발병하는 각종 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제 및 건강기능성 식품으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 RAW 264.7 대식세포를 대상으로 브로콜리의 각 추출물에 대한 산화질소 생성 저해능과 세포독성 결과를 그래프로 나타낸 것으로서, (A)는 80% 메탄올 추출물, (B) 20℃ 열수 추출물, (C) 40℃ 열수 추출물, (D) 60℃ 열수 추출물, (E) 80℃ 열수 추출물, (F) 100℃ 열수 추출물, (G) 121℃ 열수 추출물에 대한 결과를 나타낸 것이고, 막대그래프를 세포 생존율을 검은 선은 산화질소 생성 저해능을 나타낸 것이다.
도 2는 RAW 264.7 대식세포를 염증인자인 LPS로 염증을 유발시킨 후, 브로콜리의 40℃ 열수 추출물을 처리한 다음, 세포 내에서 iNOS 단백질 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것으로서, (A)는 웨스턴 블럿을 통한 iNOS 단백질 발현정도를 나타낸 것이고, (B)는 베타-액틴으로 값을 보정한 뒤, 상대적인 iNOS의 발현량을 %로 환산하여 나타낸 결과이다.
도 2는 RAW 264.7 대식세포를 염증인자인 LPS로 염증을 유발시킨 후, 브로콜리의 40℃ 열수 추출물을 처리한 다음, 세포 내에서 iNOS 단백질 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것으로서, (A)는 웨스턴 블럿을 통한 iNOS 단백질 발현정도를 나타낸 것이고, (B)는 베타-액틴으로 값을 보정한 뒤, 상대적인 iNOS의 발현량을 %로 환산하여 나타낸 결과이다.
본 발명은 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서는 염증질환을 치료하기 위한 새로운 치료제를 천연물로부터 발굴하기 위해 연구하던 중, 치료제의 주원료로서 브로콜리를 사용하였는데, 브로콜리는 브로컬리는 로마시대부터 양배추류의 녹색 꽃줄기(green shoot)가 이용되었고, 주요 성분으로는 글루코라파닌(glucoraphanin)과 설포라페인(sulforaphane)이 있는데 위암, 위궤양의 원인인 헬리코박터 파이로리균에 대한 항균 활성을 나타내며 암 발생의 위험성을 감소시키는 효과가 보고되고 있다. 또한 브로콜리는 레몬의 2배 정도의 비타민C를 함유하고 있으며 비타민B1, 비타민B2, 비타민E, 칼륨 및 칼슘도 풍부하게 함유하고 있어 오늘날 바쁜 현대인들을 위한 웰빙식품으로서 자리 잡고 있다.이에 본 발명자들은 이러한 브로콜리를 염증 질환 치료제로 사용할 수 있는지를 확인하기 위해, 본 발명의 일실시예에서는 브로콜리를 대상으로 유기용매를 이용하여 수득한 추출물 및 추출 온도를 달리하여 수득한 열수추출물을 대상으로 염증 질환을 유발하는 산화질소의 생성 억제 정도와 산화질소의 생성을 유도하는 iNOS 의 발현 억제 정도를 분석하였다.
그 결과, 브로콜리의 유기용매 추출물(즉, 메탄올 추출물)과 열수 추출물 모두 산화질소의 생성을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었고, 특히, 본 실험 결과에 의하면 80% 메탄올을 이용하여 얻은 유기용매 추출물과 열수 추출물 중에서 40℃의 온도에서 수득한 열수추출물이 산화질소 생성 억제 효과가 매우 우수한 것으로 나타났다(도 1 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 브로콜리의 열수 추출물을 염증 질환의 예방 또는 치료용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 40℃의 온도에서 수득한 열수추출물의 경우 염증질환의 치료 용도로 사용하기에 매우 적합하다는 것을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 이러한 브로콜리 추출물들이 세포에 대해 독성을 가지지 않아 체내 안정성을 가지고 있는지 확인하기 위해 세포 독성 실험을 수행하였는데, 본 발명의 일실시예에 따른 결과에 의하면 세포독성이 상당히 낮아 체내 안정하게 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다(표 2 참조).
한편, 앞서 종래기술에서도 기재되어 있듯이, 생체에 있어서 염증의 발생원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있는데, 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 산화질소(NO)를 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다.
특히 대식세포에서 리포다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산한다. 이러한 산화적 스트레스는 염증반응의 전사인자인 NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, p50과 p65의 이형이합체(heterodimer)로 구성된 NF-κB는 활성화된 후 핵으로 이동하여 iNOS와 COX-2 등의 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있고, 따라서 이러한 NF-κB 활성을 저해하면 염증반응을 억제시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Baeuerle P. et al., Annu. Rev. Immunol., 12, pp141-179, 1994; Allenm R. et al, Free Radic. Biol. Med., 28, pp463-499, 2000).
또한, 이러한 산화질소는 3가지 주요한 NOS 이성질체(isoform)인 neuronal NOS(nNOS), endothelial NOS(eNOS), inducible NOS(iNOS)에 의해 아르기닌(arginine)으로부터 생성되는 자유라디칼로서, nNOS와 eNOS는 Ca2+/칼모듈린(calmodulin)에 의해 조절되지만, iNOS는 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), LPS와 같은 염증성 자극에 의해 전사 수준에서 조절된다.
nNOS나 eNOS에 의해 소량 생성된 산화질소는 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 정상적인 생리기능을 담당하지만, 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히고, 염증성 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 NF-κB를 활성화시켜 염증반응, 동맥경화 등 만성질환에 관련하는 것으로 알려져 있다(Lawrence T. et al., Nat Med., 7, pp1291-1297, 2001; Riehemann K. et al., FEBS Lett., 442, pp89-94, 1999; Kang JL. et al., Mol. Cell. Biochem., 215, pp1-9, 2000; El-Mahmoudy A. et al., International Immunopharmacology, 2, pp1603-1611, 2002). 또한, 대식세포에서 산화질소의 생성은 iNOS의 발현과 직접적으로 연관되어 있고, LPS는 그람(Gram) 음성 세균의 세포벽 물질로서 면역 세포 등을 자극하여 산화질소의 생성을 상승적으로 증가시킨다.
이에 본 발명자들은 본 발명에서 수득한 브로콜리의 열수 추출물이 갖는 산화질소 억제활성이 iNOS의 발현과 연관되어 있는지 확인하기 위해, 본 발명의 일 실시예에서는 온도를 달리하여 얻은 브로콜리의 열수 추출물 중, 특히 산화질소 생성 억제능이 가장 우수한 40℃의 열수 추출물을 LPS로 자극된 대식세포에 처리하여 iNOS의 발현을 웨스턴블럿을 통해 확인하였다.
그 결과, 대식세포를 LPS로만 처리한 군에서는 예상대로 iNOS의 발현이 LPS를 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 증가된 것으로 나타났으며, 반면, LPS로 염증 반응이 자극된 대식세포에 40℃의 브로콜리 열수 추출물을 처리한 군의 경우, iNOS의 발현이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 브로콜리의 열수 추출물이 염증 인자로 자극된 세포내에서 iNOS의 발현 억제를 통해 산화질소의 생성을 억제하는 작용을 한다는 것을 알 수 있었고, 이러한 작용 기작을 통해 항염 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 염증질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약리성분으로서 브로콜리의 열수 추출물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분인 상기 브로콜리 열수 추출물은 브로콜리 건조 분쇄물 중량에 대해 5~15배 중량에 해당하는 증류수를 첨가한 후, 20~121℃의 온도에서 1~2시간 동안 열수 추출하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 35~45℃의 온도에서, 가장 바람직하게는 40℃의 온도에서 1~2시간 동안 열수 추출하여 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 브로콜리 열수 추출물이 치료 및 예방할 수 있는 상기 염증질환은 이에 제한되지는 않으나, 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염, 만성 부비동염, 급성화농성 중이염, 만성화농성 중이염, 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴, 바이러스성 폐렴, 급성 또는 만성 위염, 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 브로콜리 열수 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 브로콜리 열수 추출물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 염증질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물은 염증질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 브로콜리의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 조성물은 우수한 산화질소 생성 억제능 및 iNOS의 발현 억제 활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 세포에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있어 체내에 대해 매우 안정한 특징이 있다.
따라서 본 발명의 조성물은 염증질환 증상의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물을 염증질환 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명의 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 식품용 조성물은 염증 질환 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있으므로, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 염증질환 증상의 예방 또는 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 염증질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 염증질환 증상의 예방 및 개선용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 염증질환 증상의 예방 또는 개선용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
브로콜리 추출물의 제조
<1-1> 메탄올 추출물의 제조
실험에 사용한 브로콜리는 2011년 11월에 제주시 애월읍 상가리 지역에서 채집한 것을 사용하였다. 먼저 채집한 브로콜리를 수돗물로 3번 씻어내고 동결건조기를 사용하여 완전히 건조한 후 파쇄기로 미세하게 파쇄시킨 후 브로콜리 건조물 5 g에 80% 메탄올(MeOH) 50 mL를 가하여 상온에서 24시간 동안 추출하여 상층액을 회수하였고, 이러한 과정을 2회 반복한 후 얻어진 상층액을 모아 감압 농축하여 브로콜리 메탄올 추출물을 수득하였다.
<1-2>
열수
추출물의 제조
앞서 준비한 채집되어 파쇄된 브로콜리 건조물을 증류수 50 mL에 현탁시킨 후에 각각 20, 40, 60, 80, 100, 121℃에서 1시간 동안 추출하여 상층액을 수득한 후, 이를 감압 농축하여 브로콜리의 각 온도별 열수 추출물을 수득하였다, 이후 각 시료들은 에탄올 : PBS(1:1) 용액에 녹이고 시린지필터(pore size 0.45 μm)로 여과하여 하기 실험에 사용하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 <1-1>과 <1-2>의 방법을 통해 수득한 브로콜리 추출물에 대해 추출수율을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 추출 용매 | 시료 사용량(g) | 추출물의 양(g) | 추출수율(%) |
| 80% 메탄올 | 5.01 | 0.775 | 15.4 |
| 20℃ 열수추출물 | 5.02 | 2.051 | 40.8 |
| 40℃ 열수추출물 | 5.02 | 2.868 | 57.1 |
| 60℃ 열수추출물 | 5.11 | 2.941 | 57.5 |
| 80℃ 열수추출물 | 5.06 | 2.924 | 57.7 |
| 100℃열수추출물 | 4.98 | 2.909 | 58.4 |
| 121℃ 열수추출물* | 5.04 | 3.302 | 65.5 |
| *121℃, 1.5 atm 멸균조건에서 1시간동안 처리 | |||
각 조건을 달리하여 수득한 브로콜리 추출수율을 살펴본 결과, 80% 메탄올을 사용한 경우, 추출수율이 15.4%인 반면, 20∼100℃의 열수추출법을 통해 수득한 추출물은 40.8∼58.4%의 추출수율을 보였고, 121℃ 열수 추출물은 65.5%로 나타나, 열수 추출법이 80% 메탄올 추출법에 비해 추출수율이 약 2.6∼4.2배 높은 것으로 나타났다. 또한, 121℃ 열수 추출법에 의한 수득한 추출물은 다른 온도의 열수 추출물보다 추출수율이 더 높은 것으로 나타났는데, 이는 20∼100℃ 조건으로 추출한 방법은 상압에서 추출하였으나, 121℃는 1.5기압의 압력을 가하여 준 것으로써 추출효율이 보다 증대된 것을 알 수 있었다.
<
실시예
2>
산화질소 생성
저해능과
세포독성 분석
산화질소는 대식세포에서 iNOS 에 의해 L-아르기닌으로부터 만들어지며 과도한 양의 산화질소는 염증과 종양을 유발하며, 조직의 손상과 유전자 변이 미 신경 등의 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 대식세포로서 Murine macrophage 세포주인 RAW 264.7 세포를 사용하였고 이 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며 10% fetal bovine serum(FBS)과 100 uint/mL penicillin-stretomycin(GIBCO Inc, NY, USA)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, GIBCO Inc, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 또한, 염증유발 인자로 Lipopolysaccharide(LPS. E. coli serotype 0111:B4)는 Sigma로부터 구입하여 사용하였다.
먼저 세포 독성 실험은 상기 배양된 RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 96 웰 마이크로 플레이트에 1× 106cells/mL로 분주하고, 18시간 배양 후 여러 가지 농도의 시료와 LPS의 최종농도가 100 ng/mL이 되도록 첨가한 후, 전 배양조건과 동일하게 24시간 배양하였다. 이후 WST-1(EZ-CyTox enhanced cell viability assay kit; DaeiLab Service, Seoul, Korea) 분석법을 이용하여 세포생존율을 측정하였으며, 각 실험당 3회 반복하여 검체를 분석하였다. 각 시료의 농도에 대한 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 RAW 264.7 세포에 대한 시료의 세포 독성 정도를 평가하였다.
또한, 산화질소의 생성 양을 측정하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였는데, RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 배지를 이용하여 1×106 cells/mL로 조절한 후 96 well plate에 접종하고 여러 가지 농도의 브로콜리 추출물을 1시간 동안 전 처리한 후 LPS 100 ng/mL를 가하여 24시간 배양하였다. 생성된 산화질소(NO)의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 아질산염(nitrite)의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약[1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% N-1-naphylethylen diamine in 2.5(v/v) phosphoric acid] 100 μL를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite(NaNO2)를 표준화하여 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 2와 도 1에 나타내었다. 또한, LPS(100 ng/mL)로 처리한 RAW 264.7 세포에서 NO 생성 저해 활성은 Griess 시약으로 측정한 후 NO 생성을 50% 저해하는 값(IC50)으로 나타내었는데, 세포독성의 지표인 WST-1 억제활성은 ELISA법으로 측정하였고 50% 세포독성을 나타내는 값(TC50)으로 나타내었다. 선택지수(selectivity index)는 TC50을 IC50으로 나눈 값으로 나타내었다.
분석 결과, 80% 메탄올을 사용하여 수득한 추출물과 20, 40, 60, 80, 100℃의 온도에서 열수 추출법에 의해 수득한 추출물 모두는 산화질소의 생성을 억제하는 활성을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 특히 40℃ 열수 추출물은 농도 의존적으로 현저한 저해효과를 나타내었다(도 1 참조). 또한, 50%의 세포독성을 나타내는 TC50 값은 80% 메탄올 추출물이 1584.8인 것으로 나타났고, 40℃ 열수 추출물은 1669.8 μg/mL인 것으로 나타났으며, 60℃ 이상의 온도에서는 2000 μg/mL까지 세포독성이 관찰되지 않았다.
또한, 선택지수 값은 40℃ 열수 추출물이 5.01로 80% 메탄올 추출물의 2.55나 60℃ 열수 추출물의 2.31보다 월등히 높은 값을 나타내었다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 온도조건을 달리하여 수득한 브로콜리 추출물 중에서 특히 40℃ 열수 추출물이 산화질소 생성 억제 활성이 가장 활발하여 항염활성이 가장 우수한 것을 알 수 있었다.
| 추출용매 | 50% NO 생성 저해 농도(IC50, μg/mL)(A) |
50% 세포독성 농도 (TC50, μg/mL)(B) |
선택지수 (B/A) |
| 80% 메탄올 | 621.0±5.4 | >1584.8±24.8 | 2.55 |
| 20℃ 열수 | >2000 | >2000 | 1.00 |
| 40℃ 열수 | 333.2±7.9 | 1669.8±53.5 | 5.01 |
| 60℃ 열수 | 863.1±14.3 | >2000 | 2.31 |
| 80℃ 열수 | 1222.5±177.7 | >2000 | 1.63 |
| 100℃ 열수 | 1642.1±24.2 | >2000 | 1.21 |
| 121℃ 열수 | >2000 | >2000 | 1.00 |
<
실시예
3>
iNOS
의 발현에 미치는 영향분석
산화질소의 생성에 미치는 영향을 주는 iNOS에 대해 본 발명의 상기 실시예들을 통해 제조된 브로콜리 추출물들 중 산화질소 생성 억제능이 가장 우수한 40 ℃ 열수 추출물을 가지고 iNOS 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 웨스턴 블럿을 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, RAW 264.7 세포(1.0×106cells/mL)를 6 well plate에 넣고 18시간 전 배양을 하였다. 이 후 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도의 40 ℃ 브로콜리 열수추출물을 LPS(100 ng/mL)와 배지에 동시 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 세포를 3회 PBS(phosphate Buffered Saline)로 세척 후 100 μL의 RIPA lysis buffer(Upstate Biotechnology Inc.)에 0.1 M PMSF, 0.1 M NaO4, 0.1 M NaF, 5 μg/mL aprotinin과 leupeptin를 첨가한 다음, 1시간 동안 용해시킨 후, 원심분리(15,000 rpm, 15 min)하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질의 농도는 BSA(bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad protein assay kit를 사용하여 정량하였다. 30 μg/mL의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리한 후 poly vinylidene difluoride(PVDF) membrane (Immunobilon-P; Milipore Corp., Bedford, MA,. USA)에 200 mA로 90분 동안 단백질을 흡착시켰다. PVDF membrane을 5% skim milk가 첨가된 blocking buffer(Tirs-buffered daline-0.1%(w/v) Tween-20 : TBS-T)로 상온에서 1시간 동안 반응시키고, anti-nitric oxide synthase(1134-1144), inducible Rabbit pAb(Calbiochem, San Diego, CA, USA)를 하루 밤 동안 4℃에서 반응 시킨 후 TBS-T로 3회 세정하고, 2차 항체로는 2ndAntibody peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA)를 1:5,000으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, TBS-T로 3회 세정하여 ECL detection reagent (Amersham Biosciences, Piscataway,. NJ, USA)과 5분 동안 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다. 각 결과에 대한 분석은 LabWorks Imaging and Analysis Software(UVP LABWORKS, Upland, CA)로 분석하고 monoclonal anti-β-actin clone AC-74(Sigma, USA)으로 보정하여 그래프화 하였다. 또한, RAW 264.7 세포에 각각 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL의 브로콜리 열수추출물을 처리한 군을 LPS만 단독처리한 군과 비교하였는데, 이때 대조군으로는 LPS를 처리하지 않은 군을 사용하였다.
분석 결과, LPS를 처리하지 않은 군에서는 iNOS 단백질의 발현이 전혀 관찰되지 않았고, LPS만을 단독 처리한 군에서는 iNOS 발현이 반대로 증가됨을 알 수 있었다. 한편, LPS 처리 군들을 대상으로 본 발명의 브로콜리 열수 추출물을 처리한 군에서는 처리 농도에 비례하게 iNOS의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 특히, 100 μg/mL의 브로콜리 추출물을 처리한 경우, iNOS 단백질의 발현은 약 79.7%로 매우 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이로보아 40℃의 열수 조건에서 수득한 브로콜리 열수추출물은 iNOS 단백질의 효과적인 발현 감소를 통해 산화질소의 생성을 억제하고 이로써 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (7)
- 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 브로콜리 열수 추출물은 브로콜리 건조 분쇄물 중량에 대해 5~15배 중량에 해당하는 증류수를 첨가한 후, 20~121℃의 온도에서 1~2시간 동안 열수 추출하여 수득한 것임을 특징으로 하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 브로콜리 열수 추출물은 35~45℃의 온도에서 1~2시간 동안 열수 추출하여 수득한 것임을 특징으로 하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 브로콜리 열수 추출물은 iNOS(inducible NO synthease)의 발현을 감소시켜 산화질소의 생성을 억제함을 통해 항염 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 염증질환은 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염, 만성 부비동염, 급성화농성 중이염, 만성화농성 중이염, 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴, 바이러스성 폐렴, 급성 또는 만성 위염, 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 브로콜리 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
- 제6항에 있어서,
상기 염증질환은 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염, 만성 부비동염, 급성화농성 중이염, 만성화농성 중이염, 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴, 바이러스성 폐렴, 급성 또는 만성 위염, 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염, 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200011166A (ko) | 2018-07-24 | 2020-02-03 | 서원대학교산학협력단 | 브로콜리 추출물을 포함하는 항염증 조성물 |
| US20200046788A1 (en) * | 2016-11-22 | 2020-02-13 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for treatment of intestinal inflammation and colon cancer |
-
2012
- 2012-01-27 KR KR1020120008255A patent/KR20130087174A/ko not_active Application Discontinuation
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