KR20140067826A

KR20140067826A - 모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20140067826A
Application number: KR1020120135576A
Authority: KR
Inventors: 안동현; 김민지; 김꽃봉우리
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2014-06-05

Abstract

본 발명은 모자반(Sargassum fulvellum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 모자반 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않으면서 세포 염증성 매개 물질의 생성을 억제하고, 전사인자인 NF-κB의 활성을 저해함으로써 염증 매개성 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제함으로써 항염증 효과를 나타낸다. 또한 크로톤 오일로 유도된 마우스의 귀 부종에 대해 귀 부종 완화 효과가 있어, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising Sargassum fulvellum extract for preventing or treating inflammatory diseases}

본 발명은 모자반(Sargassum fulvellum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 경제성장의 발전과 더불어 평균수명의 연장과 함께 고령자 인구의 비율도 날로 증가하고 있는 추세이다. 또한 풍요로운 식생활은 수산물이나 야채 등과 같은 식품 소재를 주로 이용하던 전형적인 우리나라 식문화를 변화시켜 암, 당뇨병, 고혈압, 비만 및 혈관성 질환 등의 생활습관 병이 차지하는 비율이 매년 증가하고 있다. 이와 더불어, 면역 조절 이상으로 인하여 유발된 염증이 지속됨으로써 발생되는 염증성 질환의 발병률 또한 최근 10년 사이에 서양에서 뿐만 아니라 한국에서도 급증하고 있는 실정이다. 이에 따라 근래에 이르러 건강과 장수에 대한 관심이 증가되고, 건강기능성 소재나 제품에 대한 소비자들의 수요가 많아지고 있다. 이는 건강기능성 식의약품 시장의 규모 확대 등으로 이어지고 있어 천연자원으로부터 새로운 기능성 소재를 발굴하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 염증으로 인해 생길 수 있는 질병을 파악하고, 이를 예방하거나 치료하는데 목적을 둔 항염증효능 소재 발굴 연구도 중요한 부분을 차지하고 있다.

염증반응은 생체 혹은 조직에 기질적 변화를 가져오는 화학적 물질, 세균 감염 및 물리적 작용에 의해 발생된 손상 부위를 재생하려는 복구기전이다. 유해한 자극, 감염 및 외상 등에 의해 염증이 발현되면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 염증을 유발하는데, 이와 같은 염증반응이 지속되면 오히려 점막손상을 촉진함에 따라 발적, 발열, 종창, 동통, 기능장애 등으로 인한 류마티스 관절염, 동맥경화증, 위염, 천식 등의 염증성질환을 유발할 수 있다.

이러한 염증반응은 사이토카인(cytokines), 프로스타글란딘E2(prostagrandins E2, PGE2), 유리라디칼(free radicals) 등 다양한 매개물질이 관여하고 있다. 특히, 대식세포에서는 사이토카인, 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 자극에 의해 염증반응의 전사인자인 NF-κB(nclear factor-κB)를 활성화시키며, 그 결과 유도성 산화질소(inducible nitiric oxide synthase, iNOS), 사이클로옥시제나아제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)를 발현시켜 과량의 산화질소(NO)와 프로스타글라란딘 E2를 생성하여 염증을 일으키게 된다.

대식세포는 선천면역뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 대하여 항상성 유지에 관여하며, 염증 반응 시에는 산화질소 및 다양한 사이토카인을 생산하여 감염 초기에 생체방어에 중요한 역할을 하는 세포이다. RAW 264.7과 같은 대식세포 또는 단핵구는 그람 음성균의 세포외막에 존재하는 내독소인 리포폴리사카라이드의 자극에 의해 종양괴사인자-α, 인터루킨-1β(IL-1β) 및 인터루킨-6(IL-6)과 같은 염증매개성 사이토카인들의 분비를 촉진한다. 이러한 염증 매개 물질들의 형성은 아라키돈산(arachidonic acid)이 사이클로옥시제나아제(COX)의 작용을 거쳐 류코트리엔(leukotriene), 트롬복산(thromboxane), 프로스타글란딘(prostaglandin) 등으로 바뀌는 과정 및 산화질소(NO)의 대량 생성에 관여함으로써 염증매개에 큰 역할을 하며, 숙주에 치명적 결과를 초래한다고 알려져 있다. COX는 세포막의 인지질로부터 아라키돈산이 유리된 후 프로스타글란딘으로의 변화를 촉진시키는 효소로써 사이클로옥시제나아제-1, 사이클로옥시제나아제-2의 이형(isoform)이 존재한다. 사이클로옥시제나아제-1은 대부분의 조직에서 발현되어 인체의 항상성 유지에 관하여하는 반면 사이클로옥시제나아제-2는 성장인자(growth factors), 사이토카인 및 리포폴리사카라이드 등의 다양한 자극에 의해서 대식세포(macrophage)나 단핵구(monocyte) 등의 세포에서만 다량 발현되며, 이로 인해 발생된 프로스타글란딘은 종양의 세포사멸을 억제하고 혈관생성을 유도하여 종양생성에 기여한다. 산화질소(NO)는 세포 내에서 L-아르기닌(L-arginine)을 기질로 하여 산화질소 신타아제(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 L-시트룰린(L-citruline)과 함께 생성되는 신경계, 면역계, 심장혈관계에서 주요 전달 물질로 신경독성 및 신경 보호성의 기능을 동시에 나타내고, 쇼크 및 여러 가지 신경 퇴행성 질병의 발생에도 관여하는 것으로 보고되고 있다. NOS는 세포의 종류에 따라 신경성 NOS(nNOS, NOS1), 유도성 NOS(iNOS, NOS2), 내피성 NOS(eNOS, NOS)로 분류되며(Tsao et al., 2002), 이중 유도성 iNOS는 세포내 칼슘 농도와 외부에서 주입된 칼모둘린(calmodulin)의 자극과는 무관하게 활성화된 세포에서만 활성을 보이며 다양한 세포에서 유도된다. 또한, 활성화된 핵전사인자(Nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB)는 TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 및 COX-2 등의 여러 염증 매개 물질의 전사를 촉진하는 전사인자로서 이들의 유전자 발현에 크게 영향을 미친다.

따라서 염증성 질환의 예방 및 치료제로서 염증매개 물질의 생성과 생성에 관여하는 효소의 발현을 조절할 수 있는 물질이 주목을 받고 있다. 특히, 천연물로부터 분리, 정제된 물질은 비교적 독성이 적어 의약품에 비해 장기간 섭취하여도 안전하다는 면 때문에 각종 염증성 질환의 치료제 및 치료보조제로서 각광받고 있다. 현재 천연물을 이용한 염증반응 완화에 대한 연구로는 삼백초, 오가피, 홍화, 금은화등 생약재의 항염증에 관한 연구들과 등골나물, 큰비쑥, 녹두 및 대두 등의 육상식물에 대한 연구들이 주를 이루고 있다.

해조류는 식물성 플랑크톤과 함께 해양 생태계의 일차생산자로서 다양한 해양생물의 산란장, 은신처 및 성육장의 역할을 하고 있으며 동양에서는 기원전 300-800년, 서양에서는 1,400년 전부터 식용과 약재로 사용되어온 주요한 해양생물자원의 하나이다. 우리나라 해조류 중에서 총 54종(녹조류 16종, 갈조류 17종, 홍조류 21종)이 약용종으로 알려져 있으며, 청각(Codium fragile)과 지충이(Sargassum thunbergii)는 식품으로 이용되면서 해충을 제거하는 효과가 있고, 미역(Undaria pinnatifida)은 자궁 수축 및 출산 후 손실된 혈액 보충을 위한 식용으로 사용되었다. 최근, 갈조류인 미역, 다시마, 감태 등의 열수 추출물에서 항혈액응고 활성 물질이 확인되었고, 새빨간검둥이(Neorhodomela aculeata)와 모란갈파래(Ulva conglobata)의 추출물은 항균, 항염증 및 항산화 효능을 보였다. 특히 갈조류에는 섬유소를 비롯하여 미네랄, 무기질, 비타민 및 단백질이 다량 함유되어 있고, 알긴산(alginic acid), 퓨칸(fucan), 라미나란(laminaran) 등의 수용성 다당류가 풍부하다. 이들 수용성 다당류는 다량 섭취 시 인체에 무해하며, 퓨칸과 알긴산 유도체들은 항염증, 항바이러스, 항종양 등의 효과가 있다고 알려져 있다. 또한, 갈조류로부터 추출한 알긴산의 항균효과와 해조류 성분의 항산화작용 등도 보고되고 있다. 이와 더불어 갈조류인 톳(Hizikia fusiforme), 괭생이(Sargassum horneri) 및 잔가시 모자반(Sargassum micracanthum) 에탄올 추출물의 항염증 효과가 알려져 있으며, 항염증 효과가 있는 물질로는 외톨개모자반(Myagropsis myagroides)에서 분리한 푸콕산틴(fucoxanthin)과 감태(Ecklonia cava)에서 분리된 플로로탄닌(phlorotannin) 등이 보고되고 있다. 이러한 여러 생리활성물질들을 포함하고 있음에도 불구하고 과거에는 열량소로서의 역할을 하지 못하는 해조류의 특성 때문에 이에 대한 활발한 연구가 이루어지지 않았다. 하지만, 최근 급격히 진행되는 경제발전과 생활수준 향상으로 인해 인체에 유용한 성분들이 함유되어 있고 비교적 안전한 천연물 유래물질로서 해조류에 대한 관심이 증가하고 있다.

한편, 모자반(Sargassum fulvellum)은 모자반목 모자반과에 속하는 갈조류로 우리나라 인근 해역에서 쉽게 채취할 수 있는 대표적인 식용해조류이다. 모자반에 관한 연구로는 항암, 항균 및 항산화효과에 관한 일부 연구가 수행되고 있으며, 비틀대 모자반에 관한 연구로는 항산화효과, 독성중금속인 Pb 및 Cr의 생체 흡착 효과에 대한 연구가 보고되어져 있을 뿐, 이외에 다양한 기능성을 가지고 있는 풍부한 자원에 비해 식품분야에 적용되는 연구가 미비한 실정이다.

이에 본 발명자들은 해조류를 이용한 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 모자반 추출물을 이용하여 LPS로 활성화 된 RAW 264.7 대식세포에서 염증 매개물질들의 생성 억제효과를 관찰하고, 마우스의 귀 부종완화 효과를 확인함으로써 각종 염증 관련 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 모자반(Sargassum fulvellum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 모자반(Sargassum fulvellum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 모자반(Sargassum fulvellum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 모자반(Sargassum fulvellum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 모자반 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않으면서 세포 염증성 매개 물질의 생성 억제 및 전사인자인 NF-κB의 활성을 저해함으로써 염증 매개성 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제함으로써 항염증 효과를 나타내고, 또한 크로톤 오일로 유도된 마우스의 귀 부종에 대해 귀 부종 완화 효과가 있어, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 모자반 추출물이 대식세포주인 RAW264.7 세포의 세포증식능에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 모자반 추출물에 의한 대식세포주인 RAW264.7 세포로부터 NO 생성 억제 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 모자반 추출물에 의한 대식세포주인 RAW264.7 세포로부터 TNF-α생성 억제 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 모자반 추출물에 의한 대식세포주인 RAW264.7 세포로부터 IL-6 생성 억제 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 모자반 추출물에 의한 대식세포주인 RAW264.7 세포로부터 IL-1β 생성 억제 활성을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 모자반 추출물에 의한 RAW264.7 세포로부터 NF-κB, iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 모자반 추출물이 크로톤오일로 유도된 마우스 귀 부종완화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분인 모자반(Sargassum fulvellum)은 자연에서 채취하여 이용할 수 있고, 양식하여 이용할 수도 있으며 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 모자반은 신선한 상태로 이용할 수도 있으며, 동결건조, 자연건조 등을 한 상태로 보관하여 이용할 수도 있다.

본 발명에 따른 모자반 추출물은 하기와 같은 방법으로 추출하여 사용한다.

건조된 분말 상태의 모자반에 모자반 총 중량에 대하여 5 내지 20배량, 바람직하게는 10배량의 용매를 가하여, 1 내지 3일 동안 교반기를 이용하여 추출물을 수득한다. 추출 방법은 실온에서 함침하거나 가온할 수 있다. 상기 추출 용매는 이에 제한되지 않으나, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올이다. 상기 추출물을 원심분리하여 상층액을 취한 후, 이를 감압 농축 및 건조하여 모자반 추출물을 수득한다.

본 발명의 모자반 추출물은 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6로 구성되는 군으로부터 선택되는 염증성사이토카인의 생성을 저해하거나, IκB-α, NF-κB의 p65 또는 p50 단백질, ERK 단백질, JNK 단백질 또는 p38단백질 등을 저해하는 효과가 우수하여, 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 염증성 질환은 퇴행성 신경관절염, 류마티스성 관절염, 물리적 손상으로 인한 신경관절염, 염증성 창자염, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증, 동맥경화, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두퉁 및 관절통과 같은 통증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 염증성 요통을부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 모자반 추출물을 유효성분으로 하는 조성물과 함께 염증성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 1mg/kg 내지 1000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서,‘건강기능식품’이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역,병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

본 발명의 모자반 추출물은 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 모자반 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 모자반 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 모자반 추출물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 모자반 추출물의 제조

건조된 분말상태의 모자반(Sargassum fulvellum)에 모자반 총 중량에 대해 10배량의 80% 에탄올을 가한 후, 교반기를 이용하여 실온에서 24시간 동안 추출하였다. 상기 추출물을 원심분리하고 상층액을 취한 후, 감압농축기로 농축한 후 건조하여 모자반 추출물을 얻어 시료로 사용하였으며, 이를 -20℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.

실험예 1. 세포독성

본 발명의 모자반 추출물에 대한 세포독성을 평가하기 위해서, MTT assay를 수행하였다.

MTT assay를 수행하기 20시간 전에 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 1x10⁵cells/mL씩 웰 플레이트에 분주하여 배양한 후, 1 μg/mL의 LPS와 모자반 추출물을 농도별(0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL)로 첨가하여 37℃, 5% CO₂-배양기(MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양 후, 모자반 추출물의 농도별로 처리된 각 웰에 5 mg/mL 농도의 MTT 시약을 첨가하여 2시간 재 배양하고, 이를 4℃, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리(UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea)하여 상층액을 제거하였다. 그 후, 각 웰에 DMSO를 첨가하고 이를 microplate reader(Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도(obtical density (O.D))를 측정하였다. 세포증식능은 하기의 식에 의해 계산하였다.

※ 세포증식능(%) = 시료 흡광도/ 대조군 흡광도 x 100

모자반 추출물에 대한 세포독성 평가에 대한 MTT assay 수행 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 모자반 추출물이 RAW264.7 세포에 미치는 세포독성을 나타낸 것으로, 모자반 추출물을 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 첨가하여 배양한 결과, RAW 264.7 세포의 증식능이 대조군(시료를 처리하지 않은 군)에 비해 모든 실험군(시료를 처리한 군)에서 세포의 증식이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 모자반 추출물이 RAW 264.7 세포의 증식을 유도하는 것을 관찰하였다. 따라서, 본 발명의 모자반 추출물이 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였다.

실험예 2. 산화질소(Nitric Oxide) 생성량 측정

본 발명의 모자반 추출물에 의한 RAW264.7 세포로부터의 NO 생성 저해능을 확인하기 위해서, 산화질소(Nitric Oxide) 생성량을 측정하였다.

산화질소(NO)의 농도는 배양액 내의 아질산염(nitrite) 농도를 글리스(griess) 반응(Lee et al., 2000)을 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 세포는 DMEM 배지를 이용하여 2.5x10⁵ cells/mL로 조절한 후 24 웰 플레이트에 접종하고, 5% CO₂ 배양기(MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 20시간 동안 배양하였다. 세포에 1 μg/mL의 LPS와 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/m의 모자반 추출물을 처리하여 24시간 동안 재배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후, 동량의 griess 시약(1% 술파닐아미드(sulfanilamide) + 0.1% 나프틸렌디아민 디하이드로클로라이드(naphthylendiamine dihydrochloride), 1:1)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시키고, microplate reader(Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite, NaNO₂)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, LPS로 유도된 RAW264.7 세포로부터 모자반 추출물이 가지는 NO 생성 저해능을 확인한 결과, LPS 처리 후 NO 생성량은 정상세포에 비해 3배 이상 증가되었으며, 모자반 추출물을 처리하였을 경우, NO 생성량이 LPS 처리군 보다 유의적으로 감소함을 확인하였다. 특히, 모자반 추출물 0.1 μg/mL의 낮은 농도 처리에서도 현저히 낮은 NO 분비량을 보여, 모자반 추출물이 NO 생성 저해에 미치는 효과가 탁월함을 관찰하였으며, 모자반 추출물을 각각 50 μg/mL과 100 μg/mL으로 처리하였을 때 모자반 추출물을 처리하지 않은 군에 비해서 약 50% 이상의 높은 NO 생성 저해능을 보임을 확인하였다.

실시예 3. 염증 매개성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)분비량 측정

본 발명의 모자반 추출물이 염증 유발 원인이 되는 주요 사이토카인의 생성 억제에 미치는 영향을 확인하기 위해서, LPS(1 μg/mL)로 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 분비된 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 사이토카인 분비량을 ELISA kit(Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, USA)를 이용하여 측정하였다.

3-1. TNF-α

구체적으로는, ELISA 마이크로플레이트(microplate)에 capture antibody로 anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β 를 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅(coating)시켰다. 코팅된 플레이트를 0.05% Tween 20이 포함된 인산완충액(PBS-T)으로 세척하고, 10% FBS용액으로 차단(blocking)하였다. PBST로 세척한 뒤, 각 microplate에 상기 실험예 2에서 NO를 측정하였던 것과 동일한 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 뒤 희석한 biotinylated anti-mouse TNF-α와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD 용액을 첨가하여 실온에서 30분 동안 암반응 시켰다. 2 M H₂SO₄로 반응을 종료시킨 후, microplate reader(Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모자반 추출물에 의한 RAW264.7 세포로부터의 TNF-α 분비량을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 모자반 추출물을 처리하였을 경우, 모든 농도 처리구에서 TNF-α의 생성이 감소되었으며, 10 μg/mL 이상의 농도에서 37% 이상 그 분비량이 감소됨을 확인하였다. 따라서 모자반 추출물이 TNF-α 생성 억제에 효과적임을 확인하였다.

3-2. IL-6

ELISA 마이크로플레이트(microplate)에 capture antibody로 anti-mouse IL-6를 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅(coating)시켰다. 코팅된 플레이트를 0.05% Tween 20이 포함된 인산완충액(PBS-T)로 세척하고, 10% FBS용액으로 차단(blocking)하였다. PBST로 세척한 뒤, 각 microplate에 상기 실시예 3에서 NO를 측정하였던 것과 동일한 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 뒤 희석한 비오틴결합(biotinylated) anti-mouse IL-6 detection antibody와 스트렙타아비딘-홀스래디쉬 과산화효소 공액(streptavidin-horseradish peroxidase conjugate)을 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD 용액을 첨가하여 실온에서 30분 동안 암반응 시켰다. 2 M H₂SO₄로 반응을 종료시킨 후, microplate reader(Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

모자반 추출물에 의한 RAW264.7 세포로부터의 IL-6 분비량을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 모자반 추출물에 의한 IL-6 분비량은 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 특히, 모자반 추출물을 0.1 μg/mL을 처리하였을 때, IL-6 분비량이 각각 354.09±15.8 및 271.03±6.6으로 낮은 값을 나타내었다. 또한, LPS 단독 처리 시 IL-6 분비량이 587.38±10.56인 것과 비교해 볼 때, 모자반 추출물이 IL-6 분비 억제에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

3-3. IL-1β

ELISA 마이크로플레이트(microplate)에 캡쳐항체(capture antibody)로 anti-mouse IL-1β 를 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅(coating)시켰다. 코팅된 플레이트를 0.05% Tween 20이 포함된 인산완충액(PBS-T)로 세척하고, 10% FBS용액으로 차단(blocking)하였다. PBST로 세척한 뒤, 각 microplate에 상기 실시예 3에서 NO를 측정 하였던 것과 동일한 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 뒤, biotinylated anti-mouse IL-1β detection antibody를 첨가하고 1시간 반응 후, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30분 반응 시켰다. 그 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD 용액을 첨가하여 실온에서 30분 동안 암반응 시켰다. 2 M H₂SO₄로 반응을 종료시킨 후, microplate reader(Model 550, Bio-rad, Richmond, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모자반 추출물에 의한 RAW264.7 세포로부터의 IL-1β 분비량을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 나타낸 바와 같이, 모자반 추출물을 비교적 낮은 농도인 0.1 μg/mL로 처리하였을 때부터 약 50% 이상 높은 분비량 감소를 보였다. 특히, 모자반 추출물을 최고농도인 100 μg/mL의 농도로 처리하였을 경우, LPS와 모자반 추출물 모두 처리하지 않은 대조군과 유사한 분비량을 보여 높은 IL-1β 분비 억제 활성을 나타내었다.

실험예 4. 염증 매개성 효소 및 전사인사의 활성 측정

본 발명의 모자반 추출물이 세포 염증성 매개 물질의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해서, LPS(1 μg/mL)로 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 단백질 발현을 웨스턴블롯으로 확인하였다.

LPS(1 μg/mL)로 활성화된 RAW 264.7 세포에 모자반 추출물을 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 첨가하여 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 인산완충액(PBS)으로 세척한 후, 세포 용해 완충액을 첨가하여 30분간 4℃에서 세포를 용해시킨 후, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit(Pierce, IL, USA)를 사용하여 정량하였으며, 30 μL의 용해물(lysate)을 Laemmli(1970)의 방법을 사용하여 8-10% SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 Towbin 등(1979)의 방법을 참고하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) membrane(Bio-rad, CA, USA)에 200 mA에서 2시간 동안 전사시킨 후, 5% 탈지유(skim milk)가 포함된 TBST(tris buffered saline; pH7.5) 용액으로 상온에서 2시간 동안 차단하였다. iNOS, COX-2 및 NF-κB(p65)의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, anti-mouse COX-2 및 anti-NF-κB(p65)를 각각 사용하여, TBST 용액으로 희석하고 상온에서 2시간 반응시킨 후, TBST로 3회 세정하였다. 2차 항체로 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TBST로 3회 세정하여 ECL 기질과 1-3분 간 반응 후 X-ray 필름(Kodak X-Omat blue film, Perkinelmer, Waltham, USA)에 감광하였다. 모자반 추출물에 의한 iNOS, COX-2, NF-κB 단백질 발현을 관찰한 웨스턴블롯의 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 모자반 추출물이 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 알아본 결과, LPS에 의해 증가된 iNOS, COX-2, NF-κB의 단백질 발현 양이 모자반 추출물 농도 의존적으로 감소됨을 나타내었고, 특히 모자반 추출물 10 μg/mL 이상의 농도에서 COX-2 단백질 발현이 크게 억제됨을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 모자반 추출물의 처리가 염증반응에 있어 COX-2 단백질 발현 양을 감소시켜 염증성 물질인 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생성과 분비를 효과적으로 억제함으로써 항염증 효과를 나타냄을 의미하는 것이다. 또한, 전사인자인 NF-κB의 활성을 저해하여 LPS로 활성화 된 RAW264.7 대식세포로부터의 염증 매개성 사이토카인을 비롯하여 효소인 COX-2 및 iNOS의 분비량을 억제시킴으로써 항염증효과를 보인다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 마우스의 귀 부종 측정

급성염증반응에 대한 모자반 추출물의 염증성부종 완화 효과를 확인하기 위해, 크로톤오일로 유도된 마우스 귀 부종완화 실험을 수행하였다.

ICR계 마우스(8주령, 20-50g)는 일정한 조건(22±1℃, 12시간 밤/낮 주기)으로 7일간 적응시켰으며, 각 군당 5마리씩 사용하였다. 시료를 경구 투여하고 1시간 뒤 2.5% 크로톤오일(croton oil)을 이용해 마우스의 우측 귀 안과 밖에 20 μL씩 도포하여 크로톤오일로 유도된 마우스 귀 부종 모델을 확립하였다. 크로톤오일 처리 5시간 후 귀의 두께를 측정하고 크로톤오일을 처리하지 않은 대조군의 귀의 두께에 대한 백분율로 표시하였다. 급성염증반응에 대한 모자반 추출물의 염증성부종 완화 효과의 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군으로 항염증제인 프레드니솔론을 사용하였을 경우, 10 및 50 mg/kg으로 경구투여 했을 때 36-58% 완화정도를 보였다. 이와 비교 시, 모자반 추출물을 250mg/kg으로 투여했을 경우, 귀 부종이 46% 까지 감소함을 확인했으며, 이는 프레드니솔론과 유사한 항염증 효과를 보임을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 경구독성 측정

본 발명의 모자반 추출물에 대한 경구독성 테스트를 수행하였다.

시험군은 대조군과 투여군으로 BALB/c(10주령, 20-25g) 마우스를 5마리씩 사용하였다. 경구독성 실험 전 6시간 동안 절식하고, 모자반 추출물(5 g/10 mL의 5% tween-80/kg 체중)을 5000 mg/kg, 2000 mg/kg, 300mg/kg의 용량으로 경구투여하였다. 그 후 6시간 동안 가려움, 졸림 등 이상행동에 대한 관찰을 하였으며, 2주에 걸쳐 사망수를 관찰하여 경구독성을 측정하였다. 모자반 추출물에 대한 경구독성 결과를 표 1에 나타내었다.

모자반 에탄올 추출물 경구투여 후 사망 후 측정

	경구 투여 후 사망 수 측정일
	0	2	4	6	8	10	12	14
대조구	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
300 mg/kg	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
2000 mg/kg	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
5000 mg/kg	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5

표 1에 나타낸 바와 같이, 모자반 추출물을 5 g/kg의 농도로 경구투여 하고 2주 동안 경구독성 측정 결과, 어떠한 독성도 보이지 않음을 관찰하였다. WHO에 따르면 LD₅₀이 5 g/kg 보다 낮은 경우 독성이 있다고 명시하고 있다. 따라서, 모자반 추출물은 독성이 없고 안전한 물질로서 사용 가능함을 확인할 수 있었다.

이하 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제제

1-1. 산제의 제조

본 발명의 모자반(Sargassum fulvellum) 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

모자반 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캡슐제의 제조

모자반 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

모자반 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4·2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

모자반 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 조성물의 제제

2-1. 건강식품의 제조

모자반 추출물 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 μg

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg

비오틴 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 μg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2-2. 건강음료의 제조

모자반 추출물 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

모자반(Sargassum fulvellum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 모자반 추출물은 모자반 에탄올 가용 추출물인 것을 특징으로 하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 퇴행성 신경관절염, 류마티스성 관절염, 물리적 손상으로 인한 신경관절염, 염증성 창자염, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증, 동맥경화, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두퉁 및 관절통과 같은 통증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 염증성 요통으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
모자반(Sargassum fulvellum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.