KR101556444B1 - 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 면역억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마크로파지 세포의 활성을 조절할 수 있는 산초의 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 산초추출물 또는 그의 분획물은 안전하면서도 효과적으로 마크로파지 세포의 활성을 억제할 수 있으므로, 면역억제제로 사용가능하며, 그에 따라 과도하게 활성화된 면역기능에 의하여 유발되는 자가면역질환의 새로운 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.

Description

산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 면역억제용 조성물{Composition for immunosuppressing comprising alcohol extract of chinese pepper or fraction thereof}

본 발명은 산초 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 면역억제용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 마크로파지 세포의 활성을 조절할 수 있는 산초의 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

인간의 면역계는 인체에 침입한 외부 항원으로부터 신체를 보호하는 역할을 하나, 자기 관용성(self tolerance)이 있어서 자기 조직을 공격하지는 않는다. 그러나, 면역계의 자기 관용성이 파괴되어 자신의 유전자에 의해 정상적으로 발현되는 단백질을 면역세포가 공격대상으로 인식하여 항체를 만들거나 T 세포 반응을 일으키면, 결과적으로는 정상조직을 파괴하게 되며, 이러한 증상을 나타내는 질환을 자가면역질환이라고 한다. 대체로 상기 자가면역질환은 체내의 면역체계가 정상적이고 건강한 조직이나 기관 또는 기타 체내 성분 등을 공격하게 되므로, 상기 자가면역질환을 치료할 경우에는 정상적인 면역체계를 교란시킬 우려가 있어, 이의 치료가 극히 어려운 것으로 알려져 있다. 가장 이상적인 치료방법은 자가면역질환을 유발하는 원인을 제거하는 방법이지만, 상기 자가면역질환은 단일한 원인에 의해 발생하는 것이 아니라 여러 가지 유전적, 환경적요인 및 개인의 면역적 환경에 의해서 결정되기 때문에, 현재까지는 이의 진행을 억제하거나 지연시킬 수 있을 뿐, 이를 완치시키는 것은 불가능하다고 알려져 있다. 그러나, 자가면역질환의 진행을 억제하거나 지연시키는 것만으로도 환자의 삶의 질을 현저히 향상시킬 수 있기 때문에, 이를 개발하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다.

상기 자가면역질환 치료제는 기본적으로는 면역활성을 억제하는 면역억제제로서 사용될 수 있는데, 현재까지는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 대다수를 차지하고 있고, 최근에는 종양 괴사인자 알파(tumour necrosis factor-alpha: TNF-alpha) 저해제가 점차 시장점유율을 확장시키고 있다. 그외에도 천연물로부터 유래된 면역억제제가 개발되고 있다. 예를 들어, 한국특허공개 제2009-47851호에는 쑥추출물을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 치료제가 개시되어 있고, 한국특허공개 제2009-128119호에는 골풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 치료제가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2007-106336호에는 고삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 치료제가 개시되어 있다. 그러나, 이러한 천연물 유래 자가면역질환 치료제는 대부분 T 세포의 활성을 억제하여 면역억제효과를 나타내는데, 이처럼 T 세포의 활성을 억제하면, T 세포에 의하여 유지되는 세포성 면역체계가 교란될 우려가 있다는 근본적인 문제점이 있으나, 이에 대한 해결책은 제시하지 못한다는 단점이 있다.

한편, 산초는 한방에서 찬 기운으로 인한 복통, 설사와 치통, 천식, 요통, 옴, 버짐, 음부가려움증, 음낭습진 등의 증상을 치료하는 약재로서 사용하였다. 최근에 들어, 산초의 약리활성을 규명한 결과, 국부마취작용, 장관연동작용, 항균작용, 면역증강작용 등이 보고되었다. 예를 들어, 한국특허공개 제2012-21994호에는 산초추출물을 함유하는 면역증강제가 개시되어 있고, 한국특허공개 제2011-76285호에는 도라지, 오디, 산초, 천마를 유효성분으로 함유하는 한약재 발효 와인이 면역증강효과를 나타냄이 개시되어 있다. 그러나, 상기 산초 추출물과 면역억제활성간의 관련성에 대하여는 전혀 알려지지 않았다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 T 세포의 활성을 억제하는 면역억제제의 단점을 극복한 면역억제제를 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 산초 추출물 또는 그의 분획물이 마크로파지 세포의 활성을 억제하므로, 종래의 면역억제제의 단점을 극복한 새로운 면역억제제로서 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 면역억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 T 세포의 활성을 억제하는 면역억제제의 단점을 극복한 면역억제제를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 산초에 주목하게 되었다. 산초추출물은 천연물로부터 유래되어 부작용이 없으면서도, 면역체계를 담당하는 B-세포의 증식을 증가시킴으로써 생체의 면역능력을 활성화시키고, 염증성 사이토카인인 IL-1β의 분비를 억제하는 효과를 나타낸다고 알려져 있어, 상기 산초추출물을 사용하여 면역시스템과 염증반응에 관여하는 마크로파지 세포의 활성을 조절할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다. 이에, 산초를 100% 에탄올, 70% 에탄올 또는 증류수로 추출하여 수득한 각 추출물을 대상으로 마크로파지 세포의 NO 생성 억제율을 검토함으로써, NO 생성 억제 활성이 제일 높은 70% 에탄올 추출물을 선택하고, 상기 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 증류수로 분획하여 각각의 분획물을 수득하였다. 상기 수득한 추출물과 각 분획물의 효과를 검증한 결과, 상기 추출물과 헥산 및 에틸아세테이트 분획물은 높은 수준의 NO 생성 억제능을 나타내면서도 높은 생존율을 나타내어 안전성과 항염증활성을 모두 만족시켰고, 마크로파지 세포의 탐식능을 효과적으로 억제하였으며, 염증성 사이토카인의 생산을 조절하여 염증반응을 억제할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 산초 알코올 추출물에 포함된 유효성분을 검색한 결과, 하이페린(hyperin)이 유효성분임을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 산초 알코올 추출물은 마크로파지의 활성을 조절하여 염증반응을 억제할 수 있으므로, 면역억제용 약학 조성물 또는 마크로파지 활성 억제용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "산초(Zanthoxylum piperitum)"란, 천초(川椒), 화초(花椒), 촉초(蜀椒), 남초(南椒), 대초(大椒), 육발(陸拔), 점초(点椒), 진초(秦椒), 파초(巴椒), 한초(漢椒) 등의 다양한 명칭을 갖는 운향과의 초피나무(Zanthoxylum piperitum De Candolle) 또는 동속 식물의 열매 또는 과피를 의미하며, 상기 과피는 한방에서 찬 기운으로 인한 복통, 설사와 치통, 천식, 요통, 옴, 버짐, 음부가려움증, 음낭습진 등의 증상을 치료하는 약재로서 사용하였다. 최근에 들어, 산초의 약리활성을 규명한 결과, 국부마취작용, 장관연동작용, 항균작용 등이 보고되었다.

본 발명의 용어 "산초의 알코올 추출물"이란, 상기 산초를 저급알코올인 메탄올 또는 에탄올을 단독으로 사용하거나 또는 이들 저급알코올을 물과 혼합하여 수득한 혼합용매를 사용하여 추출한 추출물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 산초 알코올 추출물은 면역억제용 또는 마크로파지 활성 억제용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는데, 바람직하게는 물과 에탄올의 혼합용매를 사용하여 산초를 추출함으로써 수득할 수 있으며, 가장 바람직하게는 70% 에탄올을 사용하여 산초를 추출함으로써 수득할 수 있다.

상기 용매를 이용하여 추출하는 방법은 당업계에서 공지된 방법에 따라 수행할 수 있고, 바람직하게는 산초 또는 산초의 건조물을 상기 용매에 침지하고, 10 내지 25℃의 상온에서 추출하는 냉침추출법, 40 내지 100℃로 가열하여 추출하는 가열추출법, 환류냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 통하여 수행될 수 있다.

본 발명의 용어 "분획물"이란, 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 분획물은 산초 알코올 추출물을 다양한 분획방법에 적용하여 수득할 수 있는데, 상기 분획방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법 등이 될 수 있다. 특히, 용매 분획법에 사용되는 용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상술한 극성 용매 또는 비극성 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 비극성 용매를 사용하며, 가장 바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 용매 분획법은 비극성 수준이 높은 용매로부터 낮은 용매를 사용하여 상기 산초 알코올 추출물을 순차적으로 분획하는 방식으로 수행될 수 있는데, 바람직하게는 헥산 또는 에틸아세테이트을 이용하여 상기 산초 알코올 추출물을 순차적으로 분획하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "면역억제"란, 생체내에서 과도하게 활성화된 면역기능을 억제하여 정상적인 상태를 유지하도록 조절하는 활성을 의미한다. 통상적으로, 면역기능이 활성화되면 외래물질을 신속하게 제거하여 생체의 항상성을 유지하게 되지만, 상기 면역기능에 이상이 발생하여 과도하게 활성화되면, 생체내의 물질을 외래물질로 잘못 인식하여, 생체내의 물질에 대한 항체를 생성하고, 상기 생성된 항체는 생체내의 물질과 결합하여 결합체를 형성하며, 상기 결합체를 마크로파지 세포가 탐식하거나 또는 손상시키게 되어, 결과적으로는 자가면역질환과 같은 면역질환이 발생하게 된다. 이 같은 자가면역 질환을 치료하기 위하여는 과도하게 활성화된 면역기능을 억제시켜야 하는데, 이같이 과도하게 활성화된 면역기능을 억제하기 위하여는 면역기능에 이상을 유발하는 원인물질을 제거하거나, 생체내의 물질에 특이적으로 반응하는 항체의 생성을 억제하거나, 마크로파지 세포의 활성을 억제하여 항체가 결합된 생체내 물질의 손상을 억제하는 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 면역억제 활성을 나타내기 위한 일례로서 산초추출물 또는 그의 분획물을 사용하여 마크로파지 세포의 활성을 억제함으로써, 마크로파지 세포의 탐식능을 억제하는 방법을 사용하였는데, 상기 산초추출물 또는 그의 분획물은 마크로파지 세포의 탐식능을 억제할 수 있으므로, 본 발명에서 제공하는 산초추출물 또는 그의 분획물은 비정상적으로 높은 수준의 탐식능을 갖는 마크로파지 세포 활성을 수반하는 자가면역질환 등의 치료제로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 산초를 100% 에탄올, 70% 부탄올 또는 열수를 사용하여 각각의 추출물을 수득하고, 마크로파지 세포에서 상기 수득한 각 추출물의 NO 생성 억제능을 비교한 결과, 70% 에탄올 추출물이 가장 우수한 NO 생성 억제능을 나타냄을 확인하였다(도 1). 상기 산초의 70% 에탄올 추출물 및 상기 추출물의 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 증류수 분획물을 각각 수득하고(실시예 2-1), 상기 수득한 추출물 또는 분획물의 특성을 분석한 결과, 상기 추출물과 헥산 및 에틸아세테이트 분획물은 마크로파지 세포에서 NO 생성을 억제할 뿐만 아니라 마크로파지 세포의 생존에 별다른 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 2 내지 도 6). 이러한 상기 추출물과 헥산 및 에틸아세테이트 분획물의 효과를 대조군인 아스피린의 효과와 비교한 결과 상기 추출물이 아스피린 보다도 낮은 농도에서 NO 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다(도 7).

아울러, 상기 추출물 또는 그의 분획물이 마크로파지 세포의 탐식능에 미치는 영향을 분석한 결과, 상기 추출물과 헥산 및 에틸아세테이트 분획물은 마크로파지 세포의 탐식능을 농도의존적 및 시간의존적으로 억제함을 확인하였다(도 8 내지 도 12). 또한, 상기 추출물 또는 그의 분획물이 마크로파지 세포로부터 발현되는 염증성 사이토카인의 생성에 미치는 영향을 분석한 결과, 상기 추출물 또는 그의 분획물은 염증반응 억제성 사이토카인으로 알려진 IL-10는 생산량을 증가시킨 반면, 염증반응 촉진성 사이토카인으로 알려진 TNF-α 및 IL-1β는 생산량을 감소시켜서, 염증반응을 억제할 수 있음을 확인하였다(도 13).

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 산초추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 산초추출물 또는 그의 분획물은 마크로파지 세포의 탐식능을 억제할 수 있으므로, 마크로파지 세포의 과다한 탐식능을 수반하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "자가면역질환(autoimmune disease)"이란, 자기의 장기조직이나 그 성분에 대한 항체가 생산되는 알레르기 질환을 의미한다. 통상적으로, 항체가 생성되면 목적하는 항원에 결합하여 계면장력을 저하시킴으로써(opsonization), 마크로파지 세포에 의하여 탐식될 가능성을 향상시키게 되는데, 자가면역질환이 발병된 환자에서는 자기의 장기조직이나 그 성분에 대한 항체가 생성됨으로서 마크로파지 세포에 의하여 자신의 장기조직이나 그 성분이 손상되는 증상이 나타난다. 본 발명에서 제공하는 산초추출물은 마크로파지 세포의 탐식능을 저하시킴으로서, 자가면역질환에 의하여 생성된 항체로 인한 손상을 최소화시켜서, 자가면역질환의 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있다. 이때, 상기 자가면역질환은 마크로파지 세포의 탐식능 저하로 인하여 예방 또는 치료될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 섬유근염, 루프스병, 경피증, 강직성 척추염, 류마티스 관절염, 베테츠병, 쇼그랜 증후군, 길리안바레 증후군, 원형탈모증, 크론병, 궤양성 대장염, 결절성 다발 동맥염, 재발성 다발 연골염, 다발성 경화증 등이 될 수 있다.

한편, 본 발명의 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 산초 알코올 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 상기 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1 내지 20 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 자가면역질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물은 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있으므로, 상기 조성물은 자가면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체"란 자가면역질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.

본 발명의 자가면역질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여시에는 위산에 의하여 상기 추출물 또는 분획물이 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 자가면역질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물은 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함된다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.

한편, 상기 산초 알코올 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 자가면역질환 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다.

구체적인 예로, 상기 식품 조성물을 이용하여 자가면역질환을 예방 또는 개선시킬 수 있는 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육륙가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예들 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "기능성 식품(functional food)"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 자가면역질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 산초추출물 또는 그의 분획물은 안전하면서도 효과적으로 마크로파지 세포의 활성을 억제할 수 있으므로, 면역억제제로 사용가능하며, 그에 따라 과도하게 활성화된 면역기능에 의하여 유발되는 자가면역질환의 새로운 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 마크로파지 세포의 NO 생성에 미치는 산초의 70% 에탄올 추출물(A), 1000% 에탄올 추출물(B) 및 열수 추출물(C)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 산초의 70% 에탄올 추출물의 농도에 따른 NO 생성에 미치는 효과 및 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 NO 생성능을 나타내고, (B)는 세포생존율을 나타낸다.
도 3은 산초 헥산 분획물의 농도에 따른 NO 생성에 미치는 효과 및 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 NO 생성능을 나타내고, (B)는 세포생존율을 나타낸다.
도 4는 산초 에틸아세테이트 분획물의 농도에 따른 NO 생성에 미치는 효과 및 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 NO 생성능을 나타내고, (B)는 세포생존율을 나타낸다.
도 5는 산초 부탄올 분획물의 농도에 따른 NO 생성에 미치는 효과 및 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 NO 생성능을 나타내고, (B)는 세포생존율을 나타낸다.
도 6은 산초 증류수 분획물의 농도에 따른 NO 생성에 미치는 효과 및 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 NO 생성능을 나타내고, (B)는 세포생존율을 나타낸다.
도 7은 아스피린의 농도에 따른 NO 생성에 미치는 효과 및 세포독성을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 NO 생성능을 나타내고, (B)는 세포생존율을 나타낸다.
도 8은 산초 추출물의 농도에 따른 마크로파지 세포 탐식능을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 30분 동안 반응시킨 결과를 나타내고, (B)는 18시간 동안 반응시킨 결과를 나타낸다.
도 9는 산초 헥산 분획물의 농도에 따른 마크로파지 세포 탐식능을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 30분 동안 반응시킨 결과를 나타내고, (B)는 18시간 동안 반응시킨 결과를 나타낸다.
도 10은 산초 에틸아세테이트 분획물의 농도에 따른 마크로파지 세포 탐식능을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 30분 동안 반응시킨 결과를 나타내고, (B)는 18시간 동안 반응시킨 결과를 나타낸다.
도 11은 산초 부탄올 분획물의 농도에 따른 마크로파지 세포 탐식능을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 30분 동안 반응시킨 결과를 나타낸다.
도 12는 산초 증류수 분획물의 농도에 따른 마크로파지 세포 탐식능을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 30분 동안 반응시킨 결과를 나타낸다.
도 13은 산초추출물의 농도에 따른 마크로파지 세포에서 발현되는 염증성 사이토카인의 생산능을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (A)는 IL-10을 나타내고, (B)는 TNF-α를 나타내며, (C)는 IL-1β를 나타낸다.
도 14는 산초 알코올 추출물의 HPLC 분석결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 15는 하이페린의 온도변화에 따른 안정성의 변화를 나타내는 크로마토그램으로서, (A)는 가열하지 않은 하이페린을 나타내고, (B)는 30℃로 20분동안 가열한 하이페린을 나타내며, (C)는 100℃로 20분동안 가열한 하이페린을 나타낸다.
도 16은 하이페린의 pH 변화에 따른 안정성의 변화를 나타내는 크로마토그램으로서, (A)는 pH 3의 환경에서 1주동안 방치한 하이페린을 나타내고, (B)는 pH 3의 환경에서 2주동안 방치한 하이페린을 나타내며, (C)는 pH 5의 환경에서 1주동안 방치한 하이페린을 나타내고, (D)는 pH 5의 환경에서 2주동안 방치한 하이페린을 나타내며, (E)는 pH 6의 환경에서 1주동안 방치한 하이페린을 나타내고, (F)는 pH 6의 환경에서 2주동안 방치한 하이페린을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 마크로파지 세포의 NO 생성에 미치는 산초 추출물의 효과

산초를 100% 에탄올, 70% 에탄올 또는 열수를 사용하여 추출하여, 100% 에탄올 추출물, 70% 에탄올 추출물 또는 열수추출물을 각각 수득하였다.

구체적으로, 2.4Kg의 산초를 100% 에탄올 또는 70% 에탄올 12L에 침지하고 상온에서 12시간 동안 방치한 다음, 고형분을 제거하여 1차 액상성분을 수득하였다. 이어 상기 제거된 고형분을 100% 에탄올 또는 70% 에탄올 12L에 침지하고 상온에서 12시간 동안 방치하고 액상성분을 수득하는 과정을 2회 반복수행하여, 2차 및 3차 액상성분을 수득하였으며, 상기 수득한 1차 내지 3차 액상성분을 혼합하고, 감압농축 및 동결건조하여 산초의 100% 에탄올 추출물 또는 70% 에탄올 에탄올 추출물을 각각 수득하였다.

또한, 100% 에탄올 또는 70% 에탄올 대신에 100℃의 열수를 이용하는 것을 제외하고는 상술한 바와 동일한 실험을 수행하여, 산초의 열수 추출물을 수득하였다.

한편, 상기 수득한 각 추출물이, 마크로파지 세포에서 수행되는 NO 생성에 어떠한 역할을 미치는지를 확인하고자 하였다.

먼저, RAW 264.7 마우스 마크로파지 세포를 배양배지(10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지)에 접종하고, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 배양된 세포를 1×10⁶ cells/㎖의 농도로 96 웰 플레이트에 접종하여 배양하고, 1 ㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 NO(nitric oxide)의 생성을 유도함과 동시에 상기 수득한 각 산초 추출물을 농도별(0, 50, 100, 200 및 400㎍/㎖)로 처리하였다. 이어, 배양물로부터 수득한 배양 상등액으로부터 NO 생성능을 확인하였다. 구체적으로, 상기 각 산초 추출물이 처리된 배양물로부터 수득한 배양상등액 100 ㎕와 Greiss 시약 100 ㎕를 혼합하고, 10분간 반응시킨 후, 540 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도를 표준곡선에 적용하여 생성된 NO의 농도를 산출하였다. 이때, Greiss 시약은 증류수에 용해시킨 0.2% NED(N-(1-naphthyl)ethylenediamine)와 5% H₃PO₄ 용액에 용해시킨 1% sulfanilamide를 동량씩 혼합한 것을 사용하였다(도 1).

도 1에서 보듯이, 산초의 70% 에탄올 추출물과 100% 에탄올 추출물은 마크로파지 세포에서 NO 생성량을 현저하게 감소시켰으나, 이에 반하여 산초의 열수 추출물은 마크로파지 세포에서 NO의 생성량을 오히려 증가시킴을 확인하였다. 또한, 산초의 70% 에탄올 추출물과 100% 에탄올 추출물의 효과를 비교하면, 100% 에탄올 추출물 보다는 70% 에탄올 추출물이 마크로파지 세포에서 NO(Nitric oxide) 생성량을 더욱 감소시킴을 확인하였다.

따라서, 이하의 실시예에서는 산초의 70% 에탄올 추출물을 시료로서 사용하였다.

실시예 2: 마크로파지 세포의 NO 생성 및 세포독성에 미치는 산초 추출물 및 분획물의 효과

실시예 2-1: 산초 추출물로부터 분획 물의 수득

상기 실시예 1에서 수득한 산초의 70% 에탄올 추출물을 다른 용매로 분획하여 분획물을 수득하였다.

구체적으로, 산초 에탄올 추출물을 2L의 증류수에 가하여 현탁액을 수득하고, 상기 현탁액에 2L의 헥산을 가하고 분별추출하여, 증류수 분획과 헥산 분획을 분리하였다. 상기 증류수 분획에 다시 2L의 헥산을 가하고 분별추출하여 헥산 분획을 수득하는 과정을 9회 반복실시하고, 상기 분별추출을 통해 얻어진 헥산 분획을 모두 혼합하고 감압농축 및 동결건조하여 68.7g의 산초 헥산 분획물을 수득하였다.

상기 분별추출을 통해 얻어진 증류수 분획에 2L의 에틸아세테이트를 가하고 분별추출하여, 증류수 분획과 에틸아세테이트 분획을 분리하였다. 상기 증류수 분획에 다시 2L의 에틸아세테이트를 가하고 분별추출하여 에틸아세테이트 분획을 수득하는 과정을 9회 반복실시하고, 상기 분별추출을 통해 얻어진 에틸아세테이트 분획을 모두 혼합하고 감압농축 및 동결건조하여 50.7g의 산초 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다.

상기 분별추출을 통해 얻어진 증류수 분획에 2L의 부탄올을 가하고 분별추출하여, 증류수 분획과 부탄올 분획을 분리하였다. 상기 증류수 분획에 다시 2L의 부탄올을 가하고 분별추출하여 부탄올 분획을 수득하는 과정을 9회 반복실시하고, 상기 분별추출을 통해 얻어진 부탄올 분획을 모두 혼합하고 감압농축 및 동결건조하여 45.5g의 산초 부탄올 분획물을 수득하였다.

끝으로, 상기 분별추출을 통해 얻어진 증류수 분획을 감압농축 및 동결건조하여 56g의 산초 증류수 분획물을 수득하였다.

실시예 2-2: NO 생성 억제능 및 세포 독성에 미치는 산초추출물 및 분획 물의 효과

상기 실시예 1에서 수득한 산초의 70% 에탄올 추출물과 상기 실시예 2-1에서 수득한 각각의 산초의 분획물을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 방법을 이용하여 마크로파지 세포의 NO 생성 활성에 미치는 상기 추출물 및 분획물의 효과를 비교하였다.

한편, 상기 추출물 및 분획물이 마크로파지 세포에 대하여 독성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 배양되고 산초 추출물 또는 분획물이 처리된 각 마크로파지 세포로부터 배양상등액을 제거하고, 200 ㎕의 배양배지를 가하고, WST-1 solution 20 ㎕를 가한 다음, 30분동안 반응시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군(con)으로는 LPS를 처음부터 처리하지 않고 배양한 마크로파지 세포를 사용하였다(도 2 내지 도 6).

도 2 내지 도 6에서 보듯이, NO 생성에 미치는 효과를 비교하면, 산초 추출물은 농도의존적으로 NO 생성을 억제하였으나, 산초의 각 분획물은 일부만이 NO 생성을 억제하는 효과를 나타내었다. 구체적으로, 산초의 헥산 분획물과 에틸아세테이트 분획물은 농도의존적으로 NO 생성을 억제하였고, 특히 100㎍/㎖ 보다 낮은 농도로 처리한 상기 산초 추출물 및 분획물은 우수한 NO 생성 억제효과를 나타내었으나, 산초의 부탄올 분획물과 증류수 분획물은 NO 생성을 억제하지 못하였다.

반면, 세포독성에 대하여는, 모든 산초 추출물과 분획물이 마크로파지 세포에 대하여 별다른 독성을 나타내지 않고, 대부분의 세포생존율이 높은 수준으로 유지됨을 확인하였으므로, 상기 산초 추출물 또는 그의 분획물은 충분히 안전한 물질임을 알 수 있었다.

실시예 2-3: NO 생성 억제능 및 세포 독성에 미치는 아스피린의 효과

상기 실시예 2-2의 결과와 비교하기 위하여, 종래에 마크로파지 세포에서 농도의존적으로 NO 생성을 억제한다고 알려진 물질인 아스피린을 사용하여 NO 생성 억제능과 세포독성을 측정하였다(도 7).

도 7에서 보듯이, 아스피린은 농도의존적으로 마크로파지 세포에서 NO 생성을 억제하였고, 세포독성도 나타내지 않음을 확인하였다. 그러나, NO 생성 억제효과를 산초의 70% 에탄올 추출물의 것(도 2)과 비교하면, 산초의 70% 에탄올 추출물이 아스피린 보다도 현저히 낮은 농도에서 NO 생성 억제능을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3: 마크로파지 세포의 탐식능에 미치는 산초추출물 및 분획물의 효과

마크로파지 세포를 활성화시키는 지모산 입자에 FITC를 결합시킨 복합체를 사용하여, 마크로파지의 탐식능을 측정함으로써, 마크로파지의 활성에 산초 추출물 또는 각 분획물이 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

먼저, 지모산 입자에 FITC를 결합시킨 복합체를 다음과 같이 제작하였다: 10 mg FITC를 0.1 ml의 DMSO에 용해시키고, 이에 0.9 ml의 결합완충액(0.25 M sodium carbonate 및 0.1 M sodium chloride, pH 9.0)를 가한 다음, 0.2 ㎛ 여과지를 사용하여 여과함으로써, FITC 용액을 수득하였다. 또한, 지모산(40 mg)을 1 ㎖의 PBS에 용해하여 지모산 용액을 수득하였다. 그런 다음, 상기 FITC 용액 0.2 ㎖와 상기 지모산 용액 0.7 ㎖를 혼합하고, 차광조건 및 4℃에서 하룻밤동안 교반하며 반응시켰다. 상기 반응물을 PBS로 세척하여 결합하지 않은 FITC과 지모산을 제거하여 지모산 입자와 FITC가 결합된 복합체를 수득하고, 상기 복합체에 비가열성 불활성화 혈청(non-heat-inactivated serum)을 가한 다음, 37℃에서 60분간 반응시켜, 상기 복합체를 옵소닌화(opsonization)시켰다. 끝으로, 상기 옵소닌화 반응물을 PBS로 세척하여, 지모산 입자에 FITC를 결합시킨 복합체를 제작하였다. 상기 제작된 지모산 입자에 FITC를 결합시킨 복합체는 -20℃에 보관하였다.

다음으로, 상기 실시예 2의 방법으로 배양된 RAW 264.7 마우스 마크로파지 세포에 산초 추출물 또는 각 분획물을 농도별로 처리하고 배양한 다음, 60%의 포화도(confluence)를 나타내는 시점에서 serum-free DMEM 배지로 교체하고, 상기 제작된 복합체를 배양물의 5%(w/v)의 농도로 가하고 30분 또는 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 반응물에 포함된 마크로파지 세포를 PBS로 세척하여, 마크로파지 세포에 흡수되지 않은 복합체를 제거하고, 상기 마크로파지 세포를 2 ㎖의 PBS에 현탁시킨 다음, 형광광도계로 형광도를 측정(ex 490nm, em 520nm)하였다. 이때, 마크로파지 세포의 탐식능은 10 uM crystal violet의 형광을 기준으로 산출하였다(도 8 내지 도 12).

도 8 내지 도 12에서 보듯이, 마크로파지 세포의 탐식능에 미치는 효과를 비교하면, 산초 추출물(도 8)은 농도 및 시간의존적으로 마크로파지 세포의 탐식능을 억제하는 효과를 나타내었으나, 산초의 각 분획물은 일부만이 마크로파지 세포의 탐식능을 억제하는 효과를 나타내었다. 구체적으로, 산초의 헥산 분획물(도 9)과 에틸아세테이트 분획물(도 10)은 농도 및 시간의존적으로 마크로파지 세포의 탐식능을 억제하였으나, 산초의 부탄올 분획물(도 11)과 증류수 분획물(도 12)은 마크로파지 세포의 탐식능을 억제하지 못하였다.

상술한 바와 같이, 마크로파지 세포는 생체내에서 외래 물질 및 이를 인식하는 항체가 결합된 물질을 탐식함으로써, 면역시스템을 유지하는 중요한 역할을 수행한다. 다만, 과도하게 활성화된 면역시스템에서는 생체내의 물질과 항체가 결합된 결합체까지도 탐식하거나 손상시켜서 자가면역질환을 유발하게 되는데, LPS 처리에 의하여 과도하게 활성화된 마크로파지 세포의 탐식능을 억제할 수 있는 상기 산초 추출물 또는 그의 분획물은 면역억제 활성을 나타냄으로써 과도하게 활성화된 면역시스템에 의하여 발병되는 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다.

실시예 4: 마크로파지 세포의 사이토카인 생성능에 미치는 산초추출물의 효과

마크로파지 세포는 다양한 자극에 의하여 다양한 사이토카인을 생산하며, 상기 생산된 사이토카인은 면역반응, 염증반응 등을 조절하는데 사용된다고 알려져 있다. 마크로파지 세포에서 생산되는 사이토카인 중에서 염증반응을 조절하는 염증성 사이토카인으로 알려진 IL-10, TNF-α 및 IL-1β의 생산에 산초추출물이 미치는 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2의 방법으로 산초추출물과 LPS가 처리된 마크로파지 세포배양물을 수득하고, 이로부터 각각의 배양상등액을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 배양상등액 100 ㎕를 ELISA kit(KOMA Biotech, Seoul, Korea)에 포함된 96웰 플레이트에 분주하고, 2시간 동안 방치시킨 다음, 바이오틴이 결합된 항-IL-10 항체, 항-TNF-α 항체 또는 항-IL-1β 항체를 각각 가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 스트렙타비딘이 결합된 HRP를 가하여 30분 동안 반응시키고, 기질을 포함하는 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidin) 용액 100 ㎕를 가하여 15분동안 발색반응을 수행하였으며, 반응이 종료된 후, 반응물로부터 450 nm의 흡광도를 측정하였다(도 13).

도 13에서 보듯이, LPS를 처리하지 않은 경우에 비하여 LPS를 처리한 경우에는 모든 염증성 사이토카인의 생산량이 증가되었으나, 염증반응 억제성 사이토카인으로 알려진 IL-10는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도로 산초추출물을 처리할 경우, LPS만을 처리한 대조군에 비하여 생산이 증가되고, 염증반응 촉진성 사이토카인으로 알려진 TNF-α 및 IL-1β는 산초추출물을 처리할 경우, LPS만을 처리한 대조군에 비하여 생산이 억제됨을 확인하였다.

따라서, 산초추출물은 마크로파지 세포에서 염증성 사이토카인의 생산을 조절하여 염증반응을 억제하는 효과를 나타내며, 이러한 효과는 산초추출물이 상기 효과를 나타내는 면역활성 조절물질을 포함하기 때문인 것으로 분석되었다.

실시예 5: 산초추출물에 포함된 면역활성 조절물질의 분리

상기 실시예 4의 결과에서 보듯이, 산초추출물은 염증성 사이토카인의 생산을 조절하여 염증반응을 억제하는 면역활성 조절물질을 포함하는 것으로 분석되었으므로, 상기 산초추출물로부터 면역활성 조절물질을 분리하고자 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 산초추출물을 HPLC에 적용하여 면역활성 조절물질을 분석하였다. 이때, 분석조건은 Gradient mode : 0min-A:100 B:0, 10min-A:50 B:50, 20min-A:0 B:100, 20min-stop, 용매는 A:1% HCCOH, B:MeCN, 유속은 1.0 ㎖/min 으로 설정하였다(표 1 및 도 14).

산초추출물 내 하이페린 상대 함량

Ret. time	Area (%)
9.127 9.552 (Hyperin) 10.285 10.535 10.798 12.805 13.155 14.189 18.366 18.624 20.461 22.074 23.732	9.2180 6.4416 19.5184 2.6422 3.8189 1.1894 1.0415 3.0366 39.1739 6.1222 1.7124 3.2020 2.8829
Total	100

도 14 및 표 1에서 보듯이, 산초추출물로부터 하이페린(hyperin)이 검출되었다.

실시예 6: 하이페린의 안정성 분석

상기 실시예 5의 결과에서 보듯이, 산초추추출로부터 하이페린이 검출되었으므로, 상기 하이페린의 안정성을 확인하고자 하였다.

실시예 6-1: 온도 안정성

하이페린을 가열하지 않거나, 30℃로 20분동안 가열하거나 또는 100℃로 20분동안 가열한 다음, 이를 실시예 5와 동일한 조건으로 HPLC 분석에 적용하였다(도 15).

도 15에서 보듯이, 하이페린은 온도변화에 대하여 안정성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 6-2: pH 안정성

하이페린을 pH 3 내지 6의 환경에서 1주 내지 2주 동안 방치한 다음, 이를 실시예 5와 동일한 조건으로 HPLC 분석에 적용하였다(도 16).

도 16에서 보듯이, 하이페린은 pH 변화에 대하여 안정성을 나타냄을 알 수 있었다.

Claims (10)

1. 산초(Zanthoxylum piperitum) 에탄올 추출물의 헥산 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 면역억제용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   마크로파지 세포의 활성을 조절하는 것인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 산초 에탄올 추출물은 산초를 에탄올, 또는 에탄올과 물의 혼합용매를 사용하여 추출한 추출물인 것인 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 분획물은 산초 에탄올 추출물을 용매 분획법, 한외여과 분획법, 크로마토그래피 분획법 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 적용하여 수득한 분획물인 것인 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

Images