KR100836711B1

KR100836711B1 - 아라자임을 유효성분으로 하는 간기능 보호용 약학적조성물

Info

Publication number: KR100836711B1
Application number: KR1020060136706A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 신동하; 정규식
Original assignee: 주식회사 인섹트 바이오텍
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2008-06-10
Anticipated expiration: 2026-12-28

Abstract

본 발명은 아라자임을 유효성분으로 하는 간기능 보호용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임으로 구성되며 본 발명의 아라자임은 손상된 간에서 세포사멸을 억제하고, SMP30의 발현을 증가시키고, P-smad3 발현을 억제하며, 아라자임의 간보호 효능으로 중심정맥 주변의 간세포 손상의 억제화를 통해 간세포를 보호하므로 간기능 보호용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

아라니콜라 프로테오리티쿠스, 아라자임, 간기능 보호용 약학적 조성물, 간질환

Description

아라자임을 유효성분으로 하는 간기능 보호용 약학적 조성물{pharmaceutical composition containing arazyme for the prevention of liver dysfunction}

도 1은 정상(WT) 마우스와 SMP30 제거(KO) 마우스에서 급성으로 손상된 간의 조직학적 사진이다(H&E 염색, A: 보통배율 × 33, B: 보통배율 × 132):

G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; 빨간선 : 정맥중심(CV) 주위의 괴사성 부분; 및 화살표 : 손상된 간세포.

도 2는 간손상에 대해 조직생리학적으로 관찰된 수치를 나타낸 그래프이다:

G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; 간 손상 정도 0 : 손상의 형태적 증거가 없음; 간 손상 정도 1 : 중심정맥 주위 5개의 간세포에서만 흩어진 주변 괴사가 균등하게 보임; 간 손상 정도 2 : 손해를 당하지 않은 부분과 중심정맥 주위 5개의 간세포에서만 주변 괴사가 균등하게 보임; 및 간 손상 정도 3 : 중심정맥 5개의 간세포의 외의 중앙부까지 침범한 광범위한 간세포의 괴사.

도 3은 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 SMP30의 면역조직화학적 사진이다(보통배율 × 13.2 및 × 66):

G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리.

도 4는 SMP30의 면역조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다:

도 5는 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 SMP30의 면역블롯팅(Immunoblotting)을 나타낸 사진이다:

도 6은 SMP30의 면역블롯팅 발현 정도를 나타낸 그래프이다:

도 7은 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 P-smad3 의 면역조직화학적 사진이다(보통배율 × 132):

도 8은 P-smad3의 면역조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다:

G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염 화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리.

도 9는 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 P-smad3의 면역블롯팅을 나타낸 사진이다:

도 10은 P-smad3의 면역블롯팅 발현 정도를 나타낸 그래프이다:

도 11은 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 smad3의 면역조직화학적 사진이다(보통배율 × 66):

도 12은 Smad3의 면역조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다:

도 13은 Smad3의 면역블롯팅 발현 정도를 나타낸 그래프이다:

도 14는 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스에서 급성 간손상에 대한 CYP2E1의 면역조직화학적 사진이다(보통배율 × 66):

G1 : 정상 마우스, 올리브 처리; G2 : 정상 마우스, 사염화탄소 처리; G3 : 정상 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; G4 : 정상 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리; G5 : SMP30 제거 마우스, 올리브 처리; G6 : SMP30 제거 마우스, 사 염화탄소 처리; G7 : SMP30 제거 마우스, 비타민 C, 사염화탄소 처리; 및 G8 : SMP30 제거 마우스, 아라자임, 사염화탄소 처리.

도 15는 CYP2E1의 면역조직화학적 발현 정도를 나타낸 그래프이다:

본 발명은 아라자임을 유효성분으로 하는 간기능 보호용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임(arazyme)을 함유하는 간기능 보호용 약학적 조성물에 관한 것이다.

만성 간질환은 국내에서 성인병 및 사망의 중요한 원인으로 부각되고 있다. 간은 완충능력이 큰 기관으로 질환의 초기 단계에 자각증상이 없어 질병이 상당히 진전된 상태에 발견되는 경우가 많을 뿐 아니라 효과적인 치료제 및 진단방법이 부 족한 실정이다. 간 질환의 원인으로는 알코올, 약물, 화학약품, 바이러스성 간염, 담도질환과 같은 대사성 질환, 자가면역성 질환 등이 있으나 그 원인을 알 수 없는 경우도 많다. 또한 간은 인체에서 혈액의 저장과 순환, 혈액량 조절과 해독작용의 중추로서 최근 산업화에 따라 증가된 유해물질에 노출되는 기회가 증가되면서 끊임없는 해독작용에 시달리고 있으며 특히 정신적 스트레스의 증가와 과음, 흡연 등의 원인에 의해 간손상이 증가됨으로서 면역체계의 이상 초래와 더불어 다른 질병의 원인이 되는 경우가 증가하고 있다.

대부분의 만성 간질환에 있어서 질환의 예후에 중대한 영향을 미치는 여러 합병증과 간암 등은 일단 간섬유화(hepatic fibrosis)와 간경변으로 진행된 이후 발생하는 경우가 대부분이므로 간섬유화의 과정에 대한 이해와 간섬유화의 진전을 억제하는 치료제의 개발이 필요한 실정이다. 현재 임상에서 이용되고 있는 간질환 조절약으로는 1970년대 독일 마다우스(Madaus)사에서 분리한 실리마린(Silymarin), 미국 파크 데이비스(Park Davis)사의 아라-AMP(Ara-AMP), 이탈리아 셀비(Selvi)사의 카바이카(Carbaica) 및 1980년대 중국 중약연구소의 DDB 등이 이용되고 있으나 상기 약의 부작용이나 치료효과가 떨어지는 등의 문제점이 발견되고 있다. 따라서 보다 경제적이고 안전한 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

최근 간섬유화와 간경화는 세포, 사이토카인(cytokine) 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)간의 복잡한 상호작용에 의해 유발되는 것으로 알려 져 있다. 손상을 받은 간세포는 쿠퍼(kupffer) 세포에 의해 식세포작용이 일어나고 이로써 활성화된 쿠퍼 세포가 각종 사이토카인을 분비하여 간성상세포를 활성화시킨다는 것이 일반적인 기전인데 손상된 간세포가 직접적으로 간성상세포를 활성화시킨다는 자가분비(autocrine)에 대한 보고도 있다. 즉 여러 가지 원인에 의해 간세포가 손상을 받아 세포자멸사(apoptosis)가 일어나면 TGF-1이 발현되고 이로 인해 간성상세포가 활성화 되면, 활성화된 간성상세포에 의해 TGF-1이 다시 발현되어 간세포의 사멸이 더욱 유발되는 악순환이 진행될 수 있으므로 심각한 간질환이 유발될 수 있다(Sun F, et al ., Biochim Biophys Acta. 2001 Feb 14;1535(2):186-191; Jeong WI, et al ., Liver Int . 2004 Dec;24(6):248-254; Marcin Stopa, et al ., J. Biol . Chem . 2000 Sep;29308-29317; Jeong W.I, et al ., Anticancer Res. 2002 Mar-Apr;22(2A):869-877; Ishak ㎏, et al ., Alcohol Clin Exp Res . 1991;15:45-66; 대한민국특허 제 2001-0036463호).

지금까지 간기능 보호용 약학적 조성물을 탐색하기 위해서 미생물, 식물 및 화학 합성제 등을 이용하여 많은 연구가 이루어져 있으나 재료 확보의 어려움 등으로 인하여 상업화는 어려운 실정이다.

한편, 본 발명자들은 새로운 단백질 분해효소를 개발하고자 노력한 결과, 한국산 무당거미(Nephila clavata)로부터 신규 미생물인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3 균주(수탁번호 : KCTC 0268BP; WO 01/57222호) 를 분리하였으며, 본 균주로부터 신규한 단백질 분해효소인 아라자임(Arayzme)을 분리하였다. 아라자임(arazyme)은 저온과 높은 염 농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타낼 뿐 만 아니라 사람의 체온인 37℃에서 가장 높은 활성을 보였으며 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 것을 발견하고 본 단백질 분해효소의 유전자를 확인하였다(WO 01/57222호).

본 발명자들은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주에서 유래한 아라자임(arazyme)의 효과를 조사한 결과, 아라자임이 손상된 간을 효과적으로 보호하는 것을 확인하고 간기능 보호용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolycius)가 생산한 아라자임(arazyme)을 간기능 보호용 약학적 조성물로서의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 간기능 보호용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자 임을 유효성분으로 함유하는 간기능 보호용 건강식품을 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 세포사멸 억제제를 제공한다.

또한, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 P-smad3 발현억제제를 제공한다.

아울러, 아라자임을 유효성분으로 함유하는 중심정맥 주변의 간세포의 손상억제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 간기능 보호용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 아라자임은 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주가 생산하는 효소로서, 1) 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계; 2) 상기 배양액을 여과하여 상등액을 얻는 단계; 및 3) 상등액내 포함된 상기 아라자임을 수지를 이용하여 정제하는 단계로 제조할 수 있다(WO 01/57222호). 아라자임을 생산하는 미생물로서 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 이용하는 것이 바람직하며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 1996년 7월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCTC 0268BP호의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3를 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 거미 장내에서 분리한 호기성의 그람 음성 세균으로서, 0.5 ~ 0.8 ㎜ 크기의 구형이고 운동성을 가지고 있으며 카탈라아제(catalase)에는 양성 반응을, 옥시다아제(oxidase)에는 음성반응을 나타낸다(대한민국 특허 제 0220091호). 본 발명에서 는 상기와 같은 방법으로 수득된 아라자임을 이용하였다.

본 발명의 아라자임은, (a) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (b) 서열번호 1과 70% 이상 상동성을 가지며, (a)의 폴리펩티드와 생물학적으로 동등한 기능을 갖는 폴리펩티드; 및 (c) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 서열을 가지나, (a)의 폴리펩티드와 생물학적으로 동등한 폴리펩티드를 포함하는 단백질이어도 무방하다.

비타민 C(L-ascorbic acid)는 간에서 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 왔으며, 사염화탄소(carbon-tetrachloride, CCl₄)에 의한 급성 간손상을 유도했을 때 간내에 존재하던 비타민 C의 양의 감소됨과 동시에 사염화탄소의 산화적 스트레스가 간세포에 가해지고 이는 간세포의 세포사멸이나 괴사(necrosis)를 유발한다.

SMP30(Senescence Marker Protein 30)은 생체의 노화 표지 단백질로서 간세포, 신장 세뇨관, 상피세포에서 많이 발현된다. 랫트에서 SMP30은 출생 후 간에서 12주령까지 점차적으로 증가하여 12주령 때 그 발현 정도가 최고치에 이르고 그 이후로는 점차적으로 노화가 진행됨에 따라 발현량이 줄어드는 것으로 알려져 있고 노화 진행 중에 SMP30의 발현량 감소는 성호르몬과는 상관없이 독립적으로 진행되는 것으로 알려져 있다. 상기 단백질의 주된 기능은 세포자멸사로부터 세포를 보호하고 생체 내 비타민 C의 생합성과정에서 글루코놀락토나제(gluconolactonase) 역할을 수행함으로서 비타민 C 생성을 증가시키고 생체 내 비타민 C 생합성을 증가시킨다. 결과적으로 SMP30에 의해 증가된 비타민 C는 손상된 세포에서 항산화제 역할을 하게 되고 따라서 세포의 자멸사와 괴사를 감소시킨다. 또한 SMP30은 세포의 자멸사(apoptosis)시 세포질 내로 유입되는 칼슘을 세포 밖으로 배출시키는 기능을 수행함으로서 세포의 자멸사를 방지하는 기능도 가진다.

본 발명자들은 SMP30의 부재시 아라자임의 간보호 효능을 비타민　C와 비교 관찰하기 위하여 SMP30를 제거(knock out)한 마우스를 이용하였다. 정상의 C57BL/6(WT) 마우스와 SMP30 제거(Knock-out) C57BL/6(KO) 마우스에서 비타민　C와 아라자임을 투여하고 급성 간손상을 유도한 경우, 간세포의 괴사가 억제되는 것을 조직학적으로 관찰할 수 있었으며 이는 간손상이 적다는 것을 의미한다(도 1, 2 참조).

또한 SMP30 제거 마우스의 간세포에서는 SMP30의 면역반응이 관찰되지 않았으나 정상 마우스의 간세포에서는 특이적으로 SMP30 면역 양성 반응이 관찰되었으며 비타민 C와 아라자임을 처리한 마우스에서는 처리하지 않은 마우스에서보다 SMP30가 더 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3, 4, 5, 6 참조). SMP30는 세포손상에 있어서 칼슘의 세포질 내 축적 억제나 항산화 작용을 가지므로 아라자임을 처리한 마우스에서의 SMP30 단백질의 발현은 세포 자멸사와 괴사를 억제시키는 것으로 보인다.

P-smad3는 간에 손상이 가해져 염증과 섬유화가 진행될 때 발현이 높게 나타 난다. 간에 손상이 가해지면 TGF-1가 간세포, 임파구, 비만세포, 대식세포에서 합성되며 이 TGF-1는 간세포에 존재하는 TGF-1 수용체 Ⅱ(TGF-1 receptor II)에 결합하여 TGF-1 수용체 II을 활성화시키고, 활성화된 TGF-1 수용체 II는 TGF-1 수용체 I을 인산화시켜 활성화시킨다. 인산화된 TGF-1 receptor I는 Smad2, Smad3를 인산화시키고 인산화된 Smad2, Smad3(P-smad2/3)는 Smad4와 헤테로올리고머(heterooligomer)를 형성하여 간세포의 핵 내로 이동하여 표적 유전자(target gene)의 전사를 자극하게 된다. 그러므로 P-smad3가 강하게 발현되었다면 그것은 그만큼 간세포에 많은 손상이 왔음을 의미한다고 볼 수 있다.

정상 마우스 그룹에서는 비타민 C와 아라자임을 처리한 그룹(G3, G4)보다 사염화탄소만 투여한 그룹(G2)에서 P-smad3의 강한 면역반응이 관찰되었다. SMP30 제거 마우스에서는 아라자임을 처리한 그룹(G8)보다 사염화탄소 단독 또는 비타민 C를 투여한 그룹(G6, G7)에서 강한 면역 양성 반응이 관찰되었다(도 7, 8, 9, 10 참조). 사염화탄소에 의해 같은 손상을 가하더라도 SMP30이 발현되지 않은 SMP30 제거 마우스의 그룹에서 더 큰 간세포 손상을 일으킴을 알 수 있었다. 또한 비타민 C를 투여한 마우스에서보다 아라자임을 투여한 마우스의 간에서 P-smad3의 발현이 적게 나타나고 있다. 이는 아라자임이 TGF-에 의한 만성 염증자극을 억제한다는 것을 뒷받침하며 간세포 보호의 효능이 매우 뛰어남을 보여 준다. 반면, Smad는 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스의 간세포에서 별다른 차이없이 발현했다(도 11, 12, 13 참조).

CYP2E1의 발현은 아라자임을 투여한 마우스의 간세포에서만 증가하였다(도 14, 15 참조). 이는 아라자임을 처리하지 않은 그룹에서는 중심정맥 주변의 간세포가 이미 자멸사하였거나 괴사로 인해 CYP2E1이 발현되지 않고 아라자임의 간보호 효능으로 중심정맥 주변의 간세포에 어느 정도 손상만 가해져 CYP2E1이 발현된 것으로 사료된다.

사염화탄소의 대사과정에서 사이토크롬 P450(Cytochrome P450; CYP)에 의해 C-Cl 결합에서 전자가 이동하여 라디칼(radical)을 형성하는 것부터 대사가 시작된다. 트리클로로메틸 라디칼(Trichloromethyl radical)은 산화반응과 환원반응을 다 거칠 수 있으며 CYP2E1과 2B1/2B2이 사염화탄소를 불활성화시키며, 이 반응에 의해 CYP2E1의 단백질 총량이 감소하므로 결국은 CYP2E1의 발현을 지속적으로 증가시킨다.

위와 같이 아라자임을 처리하면 손상된 간세포에서 간세포의 괴사를 막고, SMP30의 발현이 증대되며 P-smad3의 발현은 감소했으며 아라자임의 간보호 효능으로 화학물질등으로 인한 중심정맥 주변의 간세포의 손상을 억제화하여 CYP2E1의 발현이 나타났다. 이로써 본 발명의 아라자임은 효과적으로 간을 보호함을 확인할 수 있었다. 또한 아라자임을 암컷 위스터(Wistar) 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 0, 1250, 2500 및 5000 ㎎/㎏ 농도에서 일반증상과 육안 병리 소견에서 아무런 이상 소견이 나타나지 않았다. 이상과 같이 경구 투여 독성시험 에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 5,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다. 그러므로 본 발명의 아라자임은 간기능 보호용 약학적 조성물로서 제공될 수 있으며, 간질환 예방 및 치료에 사용되는 간기능 보호용 약학적 조성물로서도 제공될 수 있다. 상기 간질환에는 급성간염, 만성간염, 지방간, 간경변증, 간성 혼수, 알코올성 간질환 및 간암 등이 포함된다.

본 발명의 아라자임에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 간기능 보호용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있 으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 아라자임의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 간기능 보호용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 식품 첨가물로 이용할 경우, 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 상기의 아라자임을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 이용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 이용될 수 있다. 아라자임은 상기와 같은 동일한 방법으로 수득하여 이용한다. 유효 성분의 혼합양은 이용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 이용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식 품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 이용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 이용되는 탄산화제 등에 첨가할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육에도 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 첨가할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또 는 이로부터 분리된 아라자임 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 세포사멸 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 P-smad3 발현억제제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 중심정맥 주변의 간세포의 손상억제제를 제공한다.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 아라자임 ( arazyme )의 제조

본 발명의 유효성분인 아라자임(arazyme)을 제조하기 위하여, 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP)를 배양배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화 나트륨 0.1 %, 염화 칼륨 0.05 %, 염화 칼슘 0.02 %, 황산 마그네슘 0.02 %)에서 22℃로 18 시간 동안 배양하였다. 배양액을 2 ㎛ 막여과를 이용해서 균체와 상등액을 분리한 다음 분리된 상등액을 10 kDa의 막 여과를 이용하여 농 축하였다. 본 발명의 아라자임은 기본적으로 음이온의 특성을 가지므로 농축액을 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 DEAE-셀룰로오즈(DEAE-cellulose)를 이용한 이온 교환 수지(ion exchange resin)와 20 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 세파덱스 G-75(Sephadex G-75)를 이용한 젤 여과 교환수지(gel filtration exchange resin)를 이용해 정제를 했다. 정제된 효소액은 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동(electrophoresis)을 하여 밴드 경향을 확인하였는데 그 결과 본 발명의 아라자임은 소단위를 갖지 않는 단일체(monomer)로서 약 51.5 kDa의 분자량을 갖는 밴드를 나타냄을 확인하였다. 단, 아라자임의 생산을 위한 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP)는 다양한 산업용 배지에서 생산을 할 수 있으며 생산된 배양액 또한 다양한 방법으로 분리 및 정제하여 이용할 수 있다. 본 발명의 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드 서열을 가지며, 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다.

< 실험예 1> 시험군의 구성 및 투여

SMP30은 중요한 노화 표지단백질이며 체내의 비타민 C 합성 과정에 관여해 비타민 C 합성을 증가시킴으로서 항산화제로서의 역할도 한다. 본 발명에는 12주령, 수컷, 정상의 C57BL/6(WT) 마우스와 SMP30 제거(Knock-out) C57BL/6(KO) 마우스를 이용해 사염화탄소에 의한 간손상시 SMP30과 아라자임(arazyme)의 연관성을 관찰하였다. SMP30 제거(Knock-out) C57BL/6(KO) 마우스는 도쿄 노인 대사 협 회(Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology)에서 SMP30 KO C57BL/6 마우스를 수컷 10두 및 암컷 20두를 분양받아 경북대학교 수의과대학 병리학교실 동물실에서 사육하였다. 사육을 통해 태어난 F1 마우스 중에 PCR을 이용한 꼬리 DNA 지노타이핑(tail DNA genotyping)을 통해 녹아웃(knock out) 마우스만을 선별 하였다.

정상 마우스는 입수 후 동물실에서 약 7일간 검역 및 순화시켰으며, 순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 선발하여 시험에 이용하였다. 정상 마우스와 SMP30 제거 마우스는 모두 12주령으로 그룹간의 주령의 차이는 배제하였다.

본 발명에서 이용된 랫트의 경우, 온도 22± 3℃, 상대습도 50± 10%, 조명시간 12 시간(08:00 점등 ~ 20:00 소등)으로 설정된 자동 온습도 조절 장치가 설치된 동물실에서 순화 및 사육되었다. 환경조건은 정기적(3개월 1회)으로 측정되었다. 환경 측정의 결과, 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 인정되지 않았다. 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자[240 W × 390 L × 175 H (mm)]에 5마리 이하씩 수용하였다. 개별 식별은 유성 매직펜을 이용한 피부표식법과 사육상자별 개체식별 카드표시법을 이용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(PMI Nutrition International, 505 North 4th Street Richmond, in 47374, USA)를 방사선 조사(13.2 kGy) 멸균하여 자유 섭취시켰다. 물은 카본 필터를 통해 정화된 상수도수를 물병을 이용하여 자유 섭취 시켰다. 본 발명의 간손상 물질로 이용된 사염화탄소는 0.4 ㎖/㎏의 농도로 올리브 오일(olive oil)에 희석하여 단회 투여하고 투여 후 24 시간째 부검을 실시하였다.

정상 마우스와 SMP30 제거 마우스를 각각 음성 대조군(G1, G5), 양성 대조군(G2, G6), 실험군 1(G3, G7), 실험군 2(G4, G8)의 8 그룹으로 5 마리씩 구분하였다(표 1). 음성대조군(G1, G5)의 마우스에는 올리브 오일을 복강으로 단회 투여하였고, 양성대조군(G2, G6)에는 사염화탄소(0.4 ㎖/㎏)를 단회 복강 투여하였다. 실험군 1(G3, G7)은 사염화탄소를 투여하기 하루 전에 비타민 C를 100 ㎎/㎏의 농도로 상수도수(tap-water)에 용해시켜 경구 투여 후 사염화탄소(0.4 ㎖/㎏)를 복강 투여하였다. 실험군 2(G4, G8)에는 역시 사염화탄소를 투여하기 1 일전에 아라자임을 100 ㎎/㎏의 농도로 상수도수에 용해시켜 경구 투여 후 사염화탄소(0.4 ㎖/㎏)를 복강으로 단회 투여하였다. 사염화탄소를 복강 투여하고 24 시간 후에 모든 마우스의 부검을 실시하였으며 병리조직학적 검사를 위해 각 동물마다 장기 샘플을 채취하였다.

실험군의 구성은 아래의 표 1과 같다.

실험군의 구성

그룹	조건	마우스의 수	처리
G1	정상 마우스 + 상수도수	5마리	올리브 오일
G2	정상 마우스 + 상수도수	5마리	사염화탄소
G3	정상 마우스+ 상수도수	5마리	비타민 C, 사염화탄소
G4	정상 마우스 + 상수도수	5마리	아라자임, 사염화탄소
G5	SMP30 제거 마우스 +상수도수	5마리	올리브 오일
G6	SMP30 제거 마우스 + 상수도수	5마리	사염화탄소
G7	SMP30 제거 마우스 + 상수도수	5마리	비타민 C, 사염화탄소
G8	SMP30 제거 마우스 + 상수도수	5마리	아라자임, 사염화탄소

동물 : 12주령, 수컷, 정상의 C57BL/6(WT) 마우스 및 SMP30 제거(Knock-out: KO) C57BL/6 마우스

아라자임 처리 : 사염화탄소 처리 전 경구 투여(100 ㎎/㎏)

비타민 C 처리 : 사염화탄소 처리 전 경구 투여(100 ㎎/㎏)

사염화탄소 처리 : 복강 투여(0.4 ㎖/㎏ = 10% CCl₄ 4 ㎖/㎏)

<실험예 2> 간세포의 조직병리학적 관찰

사염화탄소에 의한 간 손상시 아라자임의 효과를 조직병리학적으로 검사하기 위해서 부검시 채취된 간을 10% 중성 포르말린을 이용하여 고정하고 저장한 후 고정 조직을 10% 중성 포르말린을 이용한 고정 조직을 자동 조직 처리기구(automatic tissue processor)로 조직 처리를 수행하였다. 조직 처리과정을 거친 간 세포는 파라핀 포매 후 4 ㎛의 두께로 조직절편을 한 후 건조시켜 헤마톡살린-에오신 염색(Hematoxylin-eosin staining, H&E 염색)을 한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

사염화탄소를 투여하고 24 시간 후 부검한 마우스 간의 H&E 염색결과에서는 전체적으로 정상 마우스(G1-G4)에 비해 SMP30 제거 마우스(G5-G8)에서 소엽중심성 괴사 소견과 염증반응이 많은 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 정상 마우스(G1-G4)와 SMP30 제거 마우스(G5-G8) 모두 비타민 C와 아라자임을 투여한 그룹에서 간세포의 괴사소견이 억제되는 것을 관찰 할 수 있었다(도 1, 2).

간손상에 대한 조직생리학적으로 관찰된 수치는 아래의 표 2와 같다.

간손상에 대한 조직생리학적으로 관찰된 수치

등급	간의 손상 정도
0	손상의 형태적 증거가 없음.
1	중심정맥 주위 5개의 간세포에서만 흩어진 주변 괴사가 균등하게 보임.
2	손해를 당하지 않은 부분과 중심정맥 주위 5개의 간세포에서만 주변 괴사가 균등하게 보임.
3	중심정맥 5개의 간세포의 외의 종종 중앙부까지 침범한 광범위한 간세포의 괴사.

< 실험예 3> 간세포에서 SMP30 의 발현 관찰

<3-1> 간세포에서 SMP30의 면역조직화학적 관찰

SMP30의 면역조직화학적 관찰을 위하여, 포르말린에 고정한 후 제작된 파라핀 포매조직을 4 ㎛의 두께로 박절하여 탈파라핀시킨 후 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3% H₂O₂에 30분간 처리하고 0.01 M 인산완충식염수(phosphate-buffer saline, PBS)로 세척한 다음, 조직의 항원 발현을 증가시키기 위하여 0.01 M 구연산염(citrate) 완충액으로 처리하고, 마이크로파(microwave)로 고열처리 하였다. 비특이적 반응을 억제하기 위하여 20 g/㎖ 프로테이나제(Proteinase) K로 37℃에서 10분간 처리한 후 인산완충식염수로 세척 후 1 시간 동안 차단(blocking)시켰다. 그 후, 1차 항체인 SMP30(1:5000, Akihito Ishigami, Japan)을 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 다음 PBS 완충액으로 5분간 3회 세척하고 비오틴(biotin)과 결합시켰다. 비오틴과 결합된 1차 항체를 완충액으로 세척한 후 스트렙트아비딘(Streptavidin)으로 접합된 HRP(Horse-Rradish Peroxidase)를 부착 시키고, 완충액으로 세척한 후 Histostantin-plus bulk kit(Zymed Laboratories Inc, USA)로 37℃에서 30분간 반응시켜 충분히 세척한 후 3,3-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloried; DAB, Zymed Laboratories Inc, USA) 용액으로 발색시키고 증류수로 세척한 다음 Meyer's hematoxylin(Research genetics, USA)으로 대조 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.

SMP30의 면역조직화학적 관찰 결과, SMP30 제거 마우스에서는 SMP30의 면역반응이 관찰되지 않았으며, 정상 마우스에서는 간세포에서 특이적으로 SMP30 면역 양성 반응이 관찰되었다(도 3, 4). 정상 마우스 그룹의 음성 대조군(G1)에서 발현되는 SMP30의 발현 정도가 사염화탄소 손상을 받은 그룹(G2)의 SMP30 발현 정도보다 월등함을 관찰할 수 있다. 반면에 비타민 C 또는 아라자임을 처리한 그룹(G3, G4)에서는 SMP30 발현이 사염화탄소만을 처리한 양성대조군(G2, G6)보다 더 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다.

<3-2> 간세포에서 SMP30의 면역블롯팅(immunoblotting)에 의한 단백질 발현의 분석

간세포에서 SMP30의 면역블롯팅(immunoblotting)에 의한 단백질 발현의 분석을 위하여, -70℃에 냉동된 간 조직을 0.1 mM 나트륨오르토바나드산염(sodium orthovandate, Na₃VO₄)과 단백질분해효소 억제제 칵테일 타블렛(protease inhibitor coctail tablet, Roche, Mannheim, Germany)을 용해시킨 RIPA 완충액에 균질화시켰다. 균질화된 간 샘플을 4,000 rpm 4℃에서 10분간 원심분리하여 지방을 제거 후 상등액을 수득하였다. 상등액을 다시 14,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 수득하였다. 브래드포드 방법(Bradford method)을 이용하여 단백질 농도를 측정하고 각 단백질 샘플을 80 g/well로 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동하였다. 전기영동된 겔 내의 단백질을 PVDF 막(PVDF membrane ; Schleicher & Chuell, Dassel, Germany)에 전기이동(electro-transfer)을 수행하였다. 같은 양의 단백질이 로딩(loading)된 것을 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining)을 통해 확인했다. 3% 우혈청 알부민(Bovine serum albumin)을 인산완충식염수에 용해시킨 차단용액(Blocking solution)에 1 시간 동안 차단 과정 후, 1차 항체인 SMP30(1:5,000, Akihito Ishigami, Japan), β-Actin(1:500 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)에 반응시켰다. 0.5% 트윈(Tween) 200이 용해된 TBS 완충액에 충분히 세척하고 1차 항체에 대응하는 2차 항체인 항-토끼-HRP-항체(Akihito Ishigami, Japan)를 1:1,000 ~ 1:2,000의 비율로 희석하고 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 다시 TBS 완충액으로 충분히 세척 후 특이적인 반응을 관찰하기 위해 super signal West Dura Extended Duration Substrate(PIERCE, USA)와 반응시키고 의학용 X-ray 필름(Kodak, Tokyo, Japan)에 노출시켰다.

SMP30의 단백질 발현 분석 결과, 정상 마우스에서는 SMP30의 발현을 관찰할 수 있었으나, SMP30 제거 마우스의 전 그룹에서는 SMP30에 대한 면역 양성 반응이 관찰되지 않았다(도 5, 6).

정상 마우스 그룹에 있어서는 올리브 오일을 단일 투여한 음성대조군에서 SMP30가 가장 강하게 발현되었으며, 사염화탄소만 투여한 그룹(G2)의 SMP30 발현이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 또 비타민 C(G3)와 아라자임(G4)을 투여한 그룹에서는 사염화탄소 단독 투여군보다 SMP30의 발현이 높게 관찰되었다.

<실험예 4> 간세포에서 P-smad3의 발현 관찰

<4-1> 간세포에서 P-smad3의 면역조직화학적 관찰

간세포에서 P-smad3의 면역조직화학적 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-1과 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체는 SMP30대신으로 1차 항체 P-smad3(1:200, Cell Signaling Technology Inc, USA)을 이용하였다.

P-smad3의 면역조직화학적 관찰 결과, 정상 마우스 그룹에서는 비타민 C와 아라자임을 처리한 그룹(G3, G4)보다 사염화탄소만 투여한 그룹(G2)에서 P-smad3의 강한 면역 양성 반응이 관찰되었다. SMP30 제거 마우스에서는 아라자임을 처리한 그룹(G8)보다 사염화탄소 단독 또는 비타민 C를 투여한 그룹(G6, G7)에서 강한 면역 양성 반응이 관찰되었다(도 7, 8). 또한 비타민 C(G3, G7)보다 아라자임을 투여한 그룹(G4, G8)에서 P-smad3의 발현이 낮았다.

<4-2> 간세포에서 P- smad3 의 면역블롯팅에 의한 단백질 발현의 분석

간세포에서 P-smad3의 면역블롯팅에 의한 단백질 발현의 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-2와 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체 SMP30 대신으로 1차 항체 P-smad3(1:200, Cell Signaling Technology Inc, USA)를 이용하였으며 2차 항체로 항-토끼-HRP-항체(1:1,000 ~ 1:2,000, Cell Signaling Technology Inc, USA)를 이용하였다.

P-smad3는 전체적으로 정상 마우스(G1, G2, G3, G4)보다 SMP30 제거 마우스(G5, G6, G7, G8)에서 강하게 발현되었고 그 중에서도 사염화탄소만 투여한 SMP30 제거 마우스 그룹(G6)에서 가장 강하게 발현되었으며 비타민 C를 투여한 그룹과 아라자임을 투여한 그룹에서는 발현이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 9, 10).

< 실험예 5> 간세포에서 Smad3 의 관찰

<5-1> 간세포에서 Smad3 의 면역조직화학적 관찰

간세포에서 Smad3의 면역조직화학적 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-1과 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체는 SMP30 대신으로 1차 항체 Smad3(1:100, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)를 이용하였다.

Smad3의 면역조직화학적 관찰 결과, 각 그룹마다 발현되는 총 Smad3의 발현정도는 비슷하고 일정하게 나타났다. SMP30 제거 마우스와 정상 마우스 간에서도 차이는 크게 관찰되지 않는다. 전 실험군에서 Smad3 면역반응에 있어서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 11, 12).

<5-2> 간세포에서 Smad3 의 면역블롯팅에 의한 단백질 발현의 분석

간세포에서 Smad3의 면역블롯팅에 의한 단백질 발현의 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-2와 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체 SMP30 대신으로 1차 항체 Smad3(1:100, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)를 이용하였으며 2차 항체로 항-토끼-HRP-항체(1:1,000 ~ 1:2,000, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)를 이용하였다.

Smad3의 단백질 발현을 분석한 결과, Smad3의 발현에 있어서는 전 시험군에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 13). 정상 마우스 그룹(G1, G2, G3, G4)과 SMP30 제거 마우스 그룹(G5, G6, G7, G8) 사이의 smad3 발현차이는 없었고 모든 그룹에서 일정하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다

< 실험예 6> 간세포에서 CYP2E1 의 면역조직화학적 관찰

간세포에서 CYP2E1의 면역조직화학적 관찰을 위하여, 상기 실험예 3-1과 같은 과정으로 수행하였으며 1차 항체는 SMP30 대신으로 1차 항체 CYP2E1(1:800 Santa Cruz Biotechnology Inc, USA)을 이용하였다.

CYP2E1의 면역조직화학적 관찰 결과, CYP2E1의 발현이 아라자임을 투여한 그룹에서만 강한 면역 양성 반응이 관찰되었고 다른 그룹에서는 발현정도에 있어서 큰 차이를 관찰할 수 없었다(도 14, 15). 아라자임이 처리된 그룹(G4, G8)에서만 발현되는 경향을 보였다.

< 실험예 7> 아라자임의 급성 독성실험

본 발명의 아라자임에 대한 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

위스터(Wistar) 계통의 9주령 특정병원체부재 (SPF) 암컷 랫트((주)오리엔트, 대한민국, 서울)에 대해 각각 4마리씩 4개군으로 나누어, 온도 22± 3℃, 습도 55± 10%, 조명 12L/12D 조건의 동물실 내에서 사육하였다. 랫트 입수 후 동물실에서 1 주일간 검역 및 순화과정을 거쳤다. 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자[240 W X 390 L X 175 H (mm)]에서 5마리 이하씩 수용하였다. 개체식별은 유성 매직펜을 이용한 피부표식법과 사육상자별 개체식별 카드표시법을 이용하였다. 실험 동물용 고형사료(PMI Nutrition International, 미국)는 멸균하였으며, 물은 상수도수를 물병을 이용하여 자유 섭취 시켰다.

상기 실시예의 아라자임을 0, 1250, 2500 및 5000 ㎎/㎏ 농도로 주사용 멸균주사용수에 용해하여 10 ㎖/㎏의 용량으로 조재하여 랫트에 경구투여용 존대(zonde)를 이용하여 단회 경구 투여하였다. 일주일간의 순화 기간을 거쳐서 4개의 그룹으로 분리 한 후 10 주령의 랫트에 아라자임 농도별로 투여한 후 일반 증상 관찰을 실시한 후 아라자임의 실질 장기에 대한 독성을 평가하기 위해서 24 시간 후 부검을 실시하였다.

암컷 랫트에 아라자임을 경구 투여한 후 시험물질 투여에 따른 일반증상을 정확하게 관찰하고 독성을 평가하기 위해서 동물의 행동, 외관, 기능에 대한 관찰을 실시하였다.

실험결과, 아라자임 투여 후 동물의 활동성, 보행, 기질, 경련 등에 있어서는 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았으며, 피모 상태, 안구주변, 귀, 생식기, 사지 상태, 꼬리 상태 등의 동물의 외관 관찰 및 호흡 상태, 타액분비, 분변, 구토 등의 기능 관찰에서도 아무런 이상 증상이 관찰되지 않았다. 아라자임 투여 후 24 시간에 부검을 실시하였다. 육안부검 소견에서도 전장기에서 아라자임 투여에 의한 아무런 이상도 관찰되지 않았다. 아라자임 치사랑(LD₅₀)은 5000 ㎎/㎏이상의 고농도인 것으로 판단된다. 현미경학적 관찰에 있어서 간, 심장, 폐, 췌장 등의 실질 장기에서는 아무런 병리학적 이상 소견이 관찰되지 않았다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

아라자임 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

아라자임 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

아라자임 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

아라자임 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 아라자임을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 3.5로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

< 제제예 2> 식품의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

<2-1> 밀가루 식품의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 스프 및 육즙( gravies )의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4> 유제품( dairy products )의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말(1 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

< 제제예 3> 음료의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다.

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

<3-2> 야채쥬스의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

<3-3> 과일쥬스의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 (Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임(arazyme)은 손상된 간세포에서 간세포의 괴사를 막고, SMP30의 발현을 증가시키고, P-smad3의 발현은 감소시키며, 아라자임의 간보호 효능으로 중심정맥 주변의 간세포 손상을 억제화하므로 간기능 보호용 약학적 조성물로 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간성 혼수, 알코올성 간질환 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호 : KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 건강식품.
제 7항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스는 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3(수탁번호 : KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 간기능 개선용 건강식품.
제 7항에 있어서, 상기 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 간기능 개선용 건강식품.
제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 간질환 예방 및 개선에 사용되는 것을 특징으로 하는 간기능 개선용 건강식품.
제 10항에 있어서, 상기 간질환은 급성간염, 만성간염, 지방간, 간경변증, 간성 혼수, 알코올성 간질환 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 간기능 개선용 건강식품.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 P-smad3의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 중심정맥 주변의 간세포의 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.