KR101717057B1 - 폐암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물은 기존의 한약 조성물보다 폐암 억제에 탁월한 효과가 있으므로, 폐암의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폐암 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Lung Cancer Diseases}

본 발명은 폐암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향을 혼합추출한 한약 조성물을 이용하여 기존의 한약 조성물보다 폐암 억제에 탁월한 효과가 있는 폐암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

폐암은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양으로 암에 의한 사망의 가장 큰 원인이 되어 2010년 미국에서 남녀 사망률 1위를 보였으며, 우리나라에서도 2001년 이후 암으로 인한 사망 원인 1위를 차지하고 있다. 이 중 비소세포폐암은 전체 폐암의 85%에 해당하며, 비소세포폐암 환자의 약 75% 정도는 질병 경과 중 재발을 한다. 또한 진단 시 65% 이상에서 이미 절제 수술이 불가능한 상태로 발견되며, 이 경우 화학요법을 받더라도 2년 생존율은 12% 정도에 불과하다.

비소세포 폐암에 사용되는 항암제의 종류로는 시스플라틴, 비노렐빈, 탁솔, 젬시타빈, 표적치료제로 이레사, 타세바, 알림타 등이 있다. 이러한 항암제는 치료에 수납되는 면역 및 조혈계 장해, 구토, 체중감소, 염증, 피부질환, 탈모 등의 부작용이 문제가 되고 있으며 특히 항암제 부작용으로 인한 암치료 중단 및 치료효과의 감소를 가져온다. 따라서 항암제의 치료효과만큼이나 항암제의 부작용과 이를 감소시키는 방법 및 약에 대한 관심도가 높아지고 있다.

최근 비교적 독성이 적은 천연물을 이용하여 항암제 치료에 있어서의 부작용은 적고, 항암효과는 동일하거나 큰 천연항암제의 개발에 관심이 집중되고 있다. 이제까지 개발된 항암제 중 최근 제한적으로 시판이 허용어 있는 SB 주사의 경우 뛰어난 항암작용을 가지고 있으면서도, 직접주사 또는 직접투여에 의한 부작용이 투여주기가 되면 종료되고, 경미한 증상이 대부분이며 전처치로 예방이 가능하고, 화학항암제 사용시 나타날 수 있는 탈모, 신장기능손상, 면역수치 저하 등의 치명적인 부작용은 거의 없는 특징을 가지고 있다.

또한 기존의 암치료만으로 한계가 있는 경우에 한의학적 접근은 항암화학치료 관련 부작용을 감소시킬 수 있으며 암환자의 생존율에도 도움을 주는 연구들이 선행되어 있다.

한약제제의 항암제 개발은 임상적 안정성과 유효성 규명이 선행된 후, 물질에 대한 효능 기전에 대한 연구가 이루어지며, 마지막으로 임상적 적용을 위한 임상시험 진행의 순서로 진행된다. 임상에 바로 적용할 수 있는 치료기술이기 때문에 기존 항암 치료제 개발에 사용된 일반 화약약품에 비해 부작용에 대한 위험도가 낮으며 허가 시험항목의 축소로 인하여 약 1/10 수준의 개발 비용으로 동등한 부가가치를 지닌 항암 신약 창출로 이어질 것으로 기대된다.

현재 항암치료에 있어서 한약물을 포함한 대체보완의학 분야의 연구가 지속적으로 증가되고 있는데, 미국에서는 항암연구의 새로운 대안으로 한의학을 포함한 대체보완에 연구를 집중지원하고 있다. 또한 최근 한약이 합성 항암제보다 부작용을 줄여 줄 가능성이 있다는 결과가 다수 보고되어 있다. 또한 임상연구로 중국에서는 승혈탕, 강역탕, 가미사군자탕, 익기소징방, 부정해독충제, 부정항암방및 부정생진탕등을 활용하여 유효한 치료 효과를 얻었다고 보고된 바 있다.

국내에서는 2003년 8월에 한의학육성법이 국회를 통과하였고, 이어서 천연물신약 촉진법이 식품의약품안전청에 마련되어 한방천연물신약의 개발이 비교적 활발히 진행되고 있다.

대표적인 항암약물인 항암단(HAD)은 900년 전 전통한의서인외과증치전생집에 고형암종 치료에 효과가 있다고 기재된 서황환(우황, 유향, 몰약, 사향)이라는 처방에서 기원하였으며, 이를 기반으로 국내의 대표적인 한방 암전문 병원인 대전대학교 둔산한방병원 동서암센터에서 항암효과를 증강시킨 삼칠근, 동충하초, 우황, 진주분, 유향, 몰약, 인삼, 산자고로 변형하여 지난 10년간 국내에서 암치료의 대표적인 약물로 사용해 왔다(HAD-B). 상기 HAD-B는 지난 10년 이상 임상에서 암환자 치료에 사용한 한국 한의학계의 대표적인 항암약물이었다.

HAD-B의 임상학적 항폐암 및 신생혈관 형성 억제 효과가 공지되어 있다("Inhibition of cell motility and invasion by HangAmDan-B in NCI-H460 human non-small cell lung cancer cells. ONCOLOGY REPORTS 2011;26:1601-1608"; "Analysis of anti-angiogenic mechanism of HangAmDan-B (HAD-B), a Korean traditional medicine, using antibody microarray chip. OBioChip J. 2010;4(4):350-355). 또한, 공개특허 제2011-0100329호에 신생혈관형성 억제용 한약 조성물로서, 상기 HAD-B가 항암 효과 및 암 전이 억제 효과가 있다는 것이 공개되어 있다.

한편, 모든 STAT(Signal Transducer and Activator of Transcription)의 구성원 중에 STAT3는 대부분 종양 형성과 상관이 있고 암유전자(oncogene)로 여겨진다. STAT3는 사이토킨(cytokines), 성장인자와 암유전자(oncogene) 등 많은 신호 전달 경로의 집합 포인트이고 종양과 형질전환된 세포에서 구성요소로서의 활성을 찾을 수 있다(STAT1 and STAT3 in tumorigenesis: two sides of the same coin, 2000, Landes Bioscience). c-myc와 pim-1, cyclin D1와 같은 세포 주기 조절인자의 유전자와 암유전자(oncogenes)의 유도를 통해서 세포 증식을 촉진할 수 있다고 생각된다. 다른 한편으로는 Bcl 패밀리(Bcl family)와 같이 항-세포자멸사(anti-apoptosis) 유전자로 세포자멸사(apoptosis)를 막는다(Seminars in cell & developmental biology, 2008, Vol. 19, pp. 351-359, Molecular interventions, 2011, vol. 11, pp. 18-26). STAT3의 감소와 억제는 세포 사멸의 증가의 원인이 된다(Cancers, 2014, vol. 6, pp. 926-957). Ras 단백질은 세포 행동과 증식, 분화, 운동성, 죽음 등 많은 신호 전달 경로를 조절하는 ~21KDa의 원형의 GTP-조절 분자 스위치이다(The dark side of Ras: regulation of apoptosis, Oncogene, 2003, Vol. 22, pp. 8999-9006). 유전자 변형 쥐와 자연적으로 발생하는 인간의 종양형성에 Ras가 많이 발현된다. 이는 Ras-조절 기작이 세포증식을 촉진한다고 볼 수 있지만 많은 종양에서 저항하고 특히 세포자멸사(apoptosis)와 같은 세포 사멸을 억제한다. 특히 세포자멸사(apoptosis)와 많은 종양세포들의 저항력을 보여준다. 많은 연구에서 라스 단백질이 세포 사멸을 억제하고 세포 증식을 촉진한다고 알려지면서 반대로 이것이 종양에서 매우 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다. RAS 단백질들은 세포자멸사(apoptosis)를 저해하며 세포 증식을 촉진한다(Ras signalling and apoptosis, Current opinion in genetics & development, 1998, Vol. 8, pp. 49-54).

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 항폐암 조성물을 제조하기 위해 HAD-B를 구성하는 한약물의 성분에 변화를 주어 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향만을 혼합하여 추출할 경우에 기존의 HAD-B보다 항폐암 억제 효과가 현저하게 뛰어나는 것을 확인하고 이를 HAD-B1으로 새로 명명하였고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 항폐암 억제 효과가 탁월한 폐암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항폐암 억제 효과가 탁월한 폐암 예방 또는 개선용 식품을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 삼칠근 1~4중량부, 인삼 1~3중량부, 동충하초 1~3중량부 및 유향 0.5~2중량부를 혼합하여 한약 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 한약 혼합물을 정제수를 이용하여 20~125℃에서 추출하는 단계; (c) 상기 추출물을 원심분리하여 한약 추출물의 상등액만을 취하여 여과하는 단계; 및 (d) 상기 여과 단계에서 얻은 여과 여액을 건조시켜 분말 형태의 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 폐암 세포의 증식을 억제하고 세포자멸사를 유도하는 효과가 탁월하므로, 폐암 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 전통 한방치료기술의 지식에 근거한 한방 복합제제로 단일 화학물질이나 천연물 또는 타 한약 추출물과 비교할 때, 경쟁력이 있는 한약 조성물이라고 할 수 있다.

도 1은 폐암 이종이식(xenograft) 동물 모델에서 HAD-B1의 암 조직의 성장 억제 효능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 HAD-B1에 의한 폐암이종이식(xenograft) 동물 모델의 체중의 변화를 정리한 결과이며,
도 3은 HAD-B1의 A549 폐암세포의 성장 억제 효능을 나타내고 정상세포인 NIH-3T3 성장을 비교하는 결과이다.
도 4a 내지 도 4d는 HAD-B1에 의한 A549 폐암 세포의 신호전달 단백질 발현 패턴을 마이크로어레이(microarray)와 웨스턴 블롯(Western blot)으로 분석한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 공개특허 제2011-0100329호에 개시된 신생혈관형성 억제용 한약 조성물인 HAD-B에서 구성성분의 변화를 주어 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향만을 혼합하여 추출할 경우 기존의 HAD-B보다 항폐암 효과가 현저하게 뛰어난 것을 확인하고, 폐암 치료 또는 예방효과를 규명하였다. 본 발명에서는 HAD-B에서 몰약, 우황, 산자고, 진주분을 제외한 본 발명에 의한 조성물을 "HAD-B1"으로 새로 명명하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명은 약학적으로 유효한 양의 HAD-B1을 함유하는 폐암 억제용 약학조성물을 제공한다.

HAD-B1는 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향을 혼합 추출하여 제조할 수 있다.

HAD-B1를 제조하기 위한 한약 혼합물은 삼칠근 1~4중량부, 인삼 1~3중량부, 동충하초 1~3중량부 및 유향 0.5~2중량부의 비율로 혼합 제조할 수 있다. 바람직하게는 삼칠근 2~4중량부, 인삼 1.5~3중량부, 동충하초 1.5~3중량부 및 유향 1~2중량부의 비율로 혼합하여 추출할 수 있다.

본 발명의 HAD-B1를 함유하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 HAD-B1 0.01 내지 50중량%로 포함될 수 있다. 본 발명의 HAD-B1을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 HAD-B1를 함유하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 HAD-B1을 함유하는 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500mg/kg의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg의 양을 일일 1회~수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 다른 관점에서 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.

본 발명의 식품 조성물은, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지, 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치츠 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 건강 기능식품 또한, 식품조성물로서 기능성 식품, 영양보조제, 건강식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화 하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어유, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 (a) 삼칠근 1~4중량부, 인삼 1~3중량부, 동충하초 1~3중량부 및 유향 0.5~2중량부를 혼합하여 한약 혼합물을 제조하는 단계; (b) 상기 한약 혼합물을 정제수를 이용하여 20~125℃에서 추출하는 단계; (c) 상기 추출물을 원심분리하여 한약 추출물의 상등액만을 취하여 여과하는 단계; 및 (d) 상기 여과 단계에서 얻은 여과 여액을 건조시켜 분말 형태의 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 한약 혼합물의 제조단계

삼칠근 1~4중량부, 인삼 1~3중량부, 동충하초 1~3중량부 및 유향 0.5~2중량부를 혼합하여 한약 혼합물을 제조한다. 바람직하게는 삼칠근 2~4중량부, 인삼 1.5~3중량부, 동충하초 1.5~3중량부 및 유향 1~2중량부의 비율로 혼합할 수 있다.

(b) 한약 혼합물의 추출단계

상기 한약 혼합물은 총 중량의 1~20배의 용매를 이용하는 추출과정을 수행할 수 있다. 추출 조건은 20~125℃에서 12~48시간 동안이 적절하다. 상기 추출용매는 정제수, 알코올(메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올), 유기용매 및 상기 용매 간의 혼합용매를 사용할 수 있으나 바람직하게는 정제수가 좋다.

(c) 한약 혼합물의 원심분리 및 여과단계

추출된 한약 혼합물은 1,000~3,000rpm에서 10~30분간 원심분리하여 원심분리한 이후에는 상등액만을 취하여 여과할 수 있다. 상기 여과는 여과과정에 통상적으로 쓰이는 솜, 가는체, 거름종이, 나일론 등을 이용하여 입자를 제거하거나 한외여과법, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

(d) 건조단계

유기용매 또는 유기용매 수용액으로 추출된 여과액은 감압증류하여 분말 상태의 HAD-B1으로 제조할 수 있으며, 수분이 남아있는 감압증류된 여액은 동결건조, 분무건조 또는 열풍건조 등을 이용하여 최종적으로 분말 상태의 한약 조성물 HAD-B1으로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 후수정체 섬유증식증(retrolental fibroplasia), 신생혈관성 녹내장(neovascular glaucoma), 각막 이식(corneal graft neovascularization), 과립성 결막염(trachoma) 등의 안구 계통 질병들과 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농 육아종(pyogenic granuloma)을 치료할 수 있으며 특히 폐암 발생(lung cancer development)과 암 전이(cancer metastasis) 억제에 높은 효과를 가진다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 폐암 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 삼칠근, 인삼, 동충하초 및 유향의 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 폐암 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

실시예 1: HAD-B1의 제조

삼칠근 2kg, 인삼 1.5kg, 동충하초 1.5kg, 유향 1kg을 혼합하였다. 이후 상기 조성물 총 중량 10배의 정제수 60kg를 첨가하여 60℃에서 24시간 동안 교반한 후 2,000rpm에서 20분간 원심분리를 하였다. 각각을 원심분리한 후에는 상등액만을 취하여 여과한 후 동결건조를 하여 HAD-B1을 제조하였다.

비교예 1: HAD-B의 제조

삼칠근 2kg, 인삼 1.5kg, 동충하초 1.5kg, 산자고 1.5kg, 우황 1kg, 진주분 1kg, 유향 1kg, 몰약 1kg을 혼합하였다.

이후의 공정은 실시예 1에서 조성물 총 중량 10배의 정제수를 105kg를 첨가한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 HAD-B를 제조하였다.

실시예 2: HAD-B1에 의한 폐암 동물 이종이식(xenograft) 실험

인간 폐암 세포 A549을 매트리겔(Matrigel)과 1:1 비율로 혼합하여, HAD-B1처리군, 대조군으로 구분하여 표피에 주사한 후, 6주령 누드(nude) 마우스를 사용하여 담암마우스(tumor-bearing mice)는 종양 크기를 ~235mm³(day 0)으로 맞추고 HAD-B(삼칠근, 동충하초, 인삼, 우황, 유향, 몰약, 산자고, 진주분)와 HAD-B1(삼칠근, 동충하초, 인삼, 유향)는 증류수에, 엘로타닙(erlotinib) 등은 7.5% 캡티솔(Captisol, sulfobutylether-cyclodextran)에 용해시켜 매일 1회 경구 투여하여 날짜별로 종양 크기(종양 부피 = length width)를 aliper로 측정하였다.

마우스를 비히클(vehicle, 0.5% CMC), HAD-B 처리군(400 mpk), HAD-B1 처리군(100, 200, 400mpk), 타쎄바(Tarceva, 50mpk), 시스프라틴(Cisplatin, 5 mpk)으로 나누고(n=8/each group) 매일 1회 경구 투여하고 날짜별로 종양의 크기를 측정하였다.

HAD-B1은 농도에 따른 종양의 크기 성장 억제 영향을 확인하였다. 하기 표 1은 HAD-B1의 암 조직의 성장 억제 효능 수치를 표로 정리한 결과이다. HAD-B1는 양성대조군인 타쎄바(Tarceva)와 유사하게 성장을 억제하였다. 33일째 HAD-B 400mpk은 종양성장이 75.6%인 반면, HAD-B1 400mpk는 59.8%로 나타나 종양크기가 약 16.7% 감소하는 것을 확인하였다(도 1).

HAD-B1 100, 200mpk은 대조군인 비히클(vehicle)과 유사하고 HAD-B1 400mpk, Tarceva는 대조군에 비해 체중이 증가하여 항암제로 인한 체중감소 부작용이 없음을 확인하였다(도 2). 표 2는 HAD-B1에 의한 혈액생화학적 검사를 통해 독성의 유무를 확인한 결과이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, HAD-B1은 간수치 지표인 AST, ALT와 신장수치 지표인 BUN 및 CRE가 비히클(vehicle)의 수치와 유사한 것으로 보아 독성이 없음을 확인하였다.

실시예 3: HAD-B1의 A549 폐암세포 억제 효능

A549 폐암세포(lung cancer cell)와 NIH-3T3(정상세포)을 10% FBS DMEM에 배양하였다. 배양한 2종의 세포(cell)를 각각 96 웰플레이트(well plate)에 2*10(3)/well당 넣어주고 37℃, CO₂ 5%에 24시간 배양하였다. HAD-B1을 2~0.000128mg/ml의 농도로 72시간 처리하였고, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)으로 2시간 염색하고 DMSO로 용해시킨 다음 595nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. HAD-B1 A549 폐암 세포는 농도 의존적으로 세포 증식이 감소함을 보였으며, IC₅₀ 값(암세포가 50%가 사멸하는 농도값)은 HAD-B1은 108.27±29.12㎍/ml인 반면 HAD-B는 215.73±81.27㎍/ml이 측정되어 HAD-B1이 기존 HAD-B에 비해 약 60% 정도로 항폐암 효능이 뛰어남을 확인하였다. 정상세포인 NIH-3T3에서 세포 증식의 감소가 없음을 보아 영향을 주지 않음을 확인하였다(도 3).

실시예 4: HAD-B1에 의한 A549 폐암 세포의 신호전달 단백질 발현 패턴

배양한 A549 세포에 72시간 동안 HAD-B1를 처리한 A549와 HAD-B1를 처리하지 않은 A549에서 단백질 1㎎을 각각 추출하여 형광물질(Cy5 또는 Cy3)로 표지했다. 먼저 각 A549을 추출 완충액(pH 7.9 HEPES 20mM, 20%(v/ v) 글리세롤, 1%(v/ v) NP-40, MgCl₂ 1mM, EDTA 0.5mM, EGTA 0.1mM, PMSF 1mM, DTT 0.1M 및 프로테아제 억제제의 혼합물)으로 용해하였다. 단백질 농도가 500㎍이 되도록 조절한 다음, 암실 실온에서 1시간 동안 각각 Cy5 또는 Cy3 형광물질로 표지하였다. 표지하는데 사용되지 않은 자유염료(free dye)를 컬럼 여과로 제거하였다.

단백질 칩으로는 ProteoChip™을 사용하며, ProteoChip™ 상에 마이크로어레이어로 A549의 세포내 단백질 48개에 대한 항체를 스팟팅하여 항체 마이크로어레이(microarray)를 제조했다. 먼저 상기 항체들을 글리세롤(glycerol) 30%를 함유한 인산완충액을 이용하여 100㎍/㎖로 희석시키고, 항체 마이크로스팟(microspots)을 상기 단백질 칩 상에 밤새도록 4℃로 제조하였다. 상기 제조된 칩을 세척하고, 교반기에서 1시간 동안 실온조건으로 3% BSA로 블로킹하였다. 블로킹 후에 과잉의 BSA를 제거하기 위해 PBST 용액(0.2% 트윈 20을 함유하는 인산완충액)으로 상기 칩을 세척하고, N₂ 가스로 건조시켰다. 형광물질로 표지된 세포 용해물(1㎎/㎖)을 항체의 스팟(spots)에 적용한 후 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 상기 슬라이드를 PBST 용액으로 세 번 세척하고, N₂ 가스로 건조시켰다. 각 슬라이드를 형광 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 분석하였으며, 각 스팟에 있어서의 Cy3에 대한 Cy5의 비율이 제조자의 소프트웨어 패키지(Genepix 6.0)을 사용하여 계산하였다.

마이크로어레이 분석은 Genepix 소프트웨어 패키지를 이용하여 수행했다. 각 슬라이드들은 각 슬라이드에 대한 최적조건으로 스캔되었고, 데이터는 Cy5 강도:Cy3 강도로 플롯팅했다. 각 슬라이드 내 반복 값들은 신호 강도이며, 마이크로소프트사 엑셀(Excel)을 사용하여 Cy5:Cy3 비율을 계산하였다. Cy5:Cy3 비율의 그리드 정렬 및 연산은 제품 소프트웨어를 사용 하여 수행하였다. 모든 스팟의 평균(median) 비율 값들을 1.0으로 기준화하고, 값이 1.0인 것은 단백질 발현이 변화하지 않았음을 의미한다. 도 4의 결과와 같이, HAD-B1처리한 세포에서 STAT3와 H-Ras 단백질이 감소함을 확인하였다.

실시예 5: 약제의 제조예

5-1. 산제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B1 300mg

유당 100mg

탈크 10mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

5-2. 정제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B1 300mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

5-3. 캅셀제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B1 300mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산마그네슘 2mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

5-4. 주사제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B1 300mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

5-5. 액제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B1 0.5g

이성화당 10g

만니톨 5g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

1. 하기 단계를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법:
   (a) 삼칠근 1~4중량부, 인삼 1~3중량부, 동충하초 1~3중량부 및 유향 0.5~2중량부를 혼합하여 한약 혼합물을 제조하는 단계;
   (b) 상기 한약 혼합물을 총 중량의 1~20배의 정제수를 이용하여 20~125℃에서 12~48시간 동안 추출하는 단계;
   (c) 상기 추출 단계에서 얻은 추출물을 1,000~3,000rpm에서 10~30분간 원심분리하여 한약 추출물의 상등액만을 취하여 여과하는 단계; 및
   (d) 상기 여과 단계에서 얻은 여과 여액을 건조시켜 분말 형태의 조성물을 수득하는 단계.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   (e) 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법.
   
   
4. 삭제
5. 삭제

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