KR101145248B1

KR101145248B1 - 신생혈관형성 억제용 한약 조성물

Info

Publication number: KR101145248B1
Application number: KR1020100019221A
Authority: KR
Inventors: 조종관; 유화승; 송규용; 강인철
Original assignee: 대전대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2012-05-24
Also published as: KR20110100329A

Abstract

본 발명은 신생혈관형성 억제 용도로서의 삼칠근, 인삼, 동충하초, 산자고, 우황, 유향 및 몰약을 혼합하여 추출한 한약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 기존에 이미 사용되고 있었던 의이인, 삼칠근, 인삼, 해마, 동충하초, 산자고, 우황, 진주분 및 사향을 포함하는 한약 조성물을 개량하여 제조한 것으로, 기존의 한약 조성물보다 본 발명의 한약 조성물이 신생혈관형성 억제에 탁월한 효과가 있음이 확인되었다.

Description

신생혈관형성 억제용 한약 조성물 {Herbal medicine composition for the inhibition of angiogenesis}

본 발명은 신생혈관형성 억제용 한약 조성물에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 삼칠근, 인삼, 동충하초, 산자고, 우황, 진주분, 유향 및 몰약을 혼합하여 추출한 한약 조성물을 이용한 신생혈관형성 억제용 조성물에 관한 것이다.

혈관의 형성은 혈관내피세포의 이동과 증식, 혈관형성세포로의 분화로 이어지는 일련의 작용들을 포함하며, 배의 발생(embryonic development), 상처치료(wound healing), 만성염증(chronicinflamation) 등의 다양한 생리학적, 병리학적인 현상들과도 밀접하게 관련되어 있다.

비정상적으로 혈관이 형성되는 현상은 암의 성장과 전이에 있어서 중요한 선행과정일 뿐만 아니라, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 후수정체 섬유증식증(retrolental fibroplasia), 신생혈관성 녹내장(neovascular glaucoma), 각막 이식(corneal graft neovascularization), 과립성 결막염(trachoma) 등의 안구 계통 질병들과 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농 육아종(pyogenic granuloma) 등의 과다한 혈관형성으로 인한 여러 질병들의 유발과도 연관성을 가진다.

이 중에서도 신생혈관형성은 암세포 성장, 침입, 전이에 있어서 중요한 역할을 하는데 신생혈관형성의 조절은 항암치료에 중요한 역할을 하며, 신생혈관형성 억제제가 한 개의 내피세포를 공략하면, 약 100개의 암세포를 공략할 수 있게 때문에 기존의 항암제보다 매우 효과적이다.

암 조직은 자신들의 생존을 위해 혈관으로부터 산소와 영양분을 공급받지만, 혈관형성 없이 암조직은 1~2㎜ 이상 성장할 수 없다. 혈관에 망상조직이 형성되면 종양세포가 이를 통하여 체내를 순환하기 시작하고, 새롭게 생성된 모세혈관이 기저막을 조각내기 시작함으로써 혈관내로 세포가 쉽게 관통할 수 있어 암의 전이가 잘 일어날 수 있다.

혈관형성 저해제는 기존의 항암제가 암세포를 표적으로 하는 반면에 내피세포를 표적으로 하며 기존의 항암제보다 독성이 약하고 내성이 나타나지 않으므로 부작용이 적을 것으로 기대되며 기존 항암제의 내성 문제도 혈관형성 저해제의 치료로 극복 가능한 것으로 알려져 있다.

암의 전이(metastasis)는 암세포가 다른 부위나 장기로 확산되는 과정으로 가장 주요한 암 치료 실패의 원인이며, 가장 높은 암 환자의 사망 원인이다. 암의 발생과정은 오랜 기간에 걸쳐서 일반적으로 유발단계, 촉진단계, 진행단계 및 암 전이 단계의 매우 복잡한 다단계 발암과정을 수반하게 되는데, 이 중 암 전이 현상은 암 관련 질병 중 암에 의한 사망률이 가장 높은 비율을 차지하게 하는 가장 치명적인 원인으로 알려져 있다.

암 전이 현상은 전이성을 가진 악성 암세포가 최초의 암 발생 장소에서 다른 새로운 조직으로 침투하여 혈관 형성이 동반되는 제 2차 종양을 형성하는 것을 말한다. 암 전이 과정은 부착, 침윤, 혈관 형성의 세 가지 주요 단계로 구성되어 있으며 이중에서 어느 하나를 막을 수 있다면 암 전이를 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다.

현재 항암치료에 있어서 한약물을 포함한 대체보완의학 분야의 연구가 지속적으로 증가되고 있는데, 미국에서는 항암연구의 새로운 대안으로 한의학을 포함한 대체보완에 연구를 집중지원하고 있다. 또한 최근 한약이 합성 항암제보다 부작용을 줄여 줄 가능성이 있다는 결과가 다수 보고되어 있다. 또한 임상연구로 중국에서는 ‘승혈탕’, ‘강역탕’, ‘가미사군자탕’, ‘익기소징방’, ‘부정해독충제’, ‘부정항암방’ 및 ‘부정생진탕’ 등을 활용하여 유효한 치료 효과를 얻었다고 보고된 바가 있다.

국내에서는 2003년 8월에 한의학육성법이 국회를 통과하였고, 이어서 천연물신약 촉진법이 식품의약품안전청에 마련되어 한방천연물신약의 개발이 비교적 활발히 진행되고 있다.

암에서의 신생혈관형성은 한의학적으로 ‘어혈(瘀血)’에 속하며, 많은 종류의 활혈화어(活血化瘀) 약물들이 실험적으로 신생혈관형성 억제 및 전이 억제 효능을 나타내는 것을 확인한 바 있다.

본 발명의 대상은 900년 전 전통한의서인《외과증치전생집》에 고형암종 치료에 효과가 있다고 기재된 ‘서황환(우황, 유향, 몰약, 사향)’이라는 처방에서 기원하였으며 이를 기반으로 중국의 대표적인 국가 암전문 병원인 중국 중의연구원 광안문병원 종양과에서는 항암효과를 증강시킨 ‘가미서황환(하수오, 동충하초, 우황, 몰약, 사향 등의 추출물을 함유함)’으로 변형하여 지난 50년간 중국에서 암치료의 대표적인 약물로 사용해 왔다. 이를 1996년부터 한국의 대전대학교 한방병원 종양과에서 처방구성약물과 용량을 변형하여 실험상 기존 중국의 ‘가미서황환’보다 효과가 뛰어난 ‘항암단(삼칠근, 인삼, 동충하초, 산자고, 우황, 진주분, 사향, 의이인 및 해마 추출물을 함유함)’으로 발전시켰다. 상기 항암단은 지난 10년 이상 임상에서 암환자 치료에 사용한 한국 한의학계의 대표적인 항암약물이었다. 본 발명에서는 이러한 항암단을 HAD(Hang-Am-Dan)로 새로 명명하였고, 상기 HAD에서 사향, 해마 및 의이인을 제외하여 HAD-A라고 명명하였으며, 상기 HAD-A에 유향과 몰약을 추가하여 HAD-B라고 명명하였다.

HAD(항암단)에 대해서는, “항암단을 투여받은 림프절 외 변연부 B세포 림프종(대한한방내과학회지. 29(3), 810-818, 2008)”, “림프절 전이를 동반한 췌장암환자 1례에 대한 보고(대한한방내과학회지. 28(4), 978-985, 2007)”의 학술지 논문에 HAD의 임상학적 항암 및 전이 억제 효과가 공지되어 있다. 이로써 상기 HAD가 항암 효과 및 암 전이 억제 효과가 있다는 것이 이미 확인되었다.

본 발명은 신생혈관형성을 억제하는 조성물을 제조하기 위해 상기 HAD를 개량시킨 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 한약 조성물은 HAD를 구성하던 한약물의 구성에 변화를 주었으며, 상기 조성물은 HAD-B로서 기존의 HAD보다 신생혈관형성 억제 효과가 현저하게 뛰어남이 확인되었으며 기존의 한방제제에 비해 비용절감 효과도 뛰어났다.

본 발명의 목적은 신생혈관형성 억제를 위한 한약 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 삼칠근, 인삼, 동충하초, 산자고, 우황, 진주분, 유향 및 몰약을 혼합하여 추출 제조한 조성물인 HAD-B를 이용한 신생혈관형성 억제용 한약 조성물을 제공하는 데에 있다.

HAD-B는 삼칠근, 인삼, 동충하초, 산자고, 우황, 진주분, 유향 및 몰약을 혼합 추출하여 제조할 수 있다.

HAD-B를 제조하기 위한 한약 혼합물은 삼칠근 2~4 중량부, 인삼 1.5~3 중량부, 동충하초 1.5~3 중량부, 산자고 1.5~3 중량부, 우황 1~2 중량부, 진주분 1~2 중량부, 유향 1~2 중량부 및 몰약 1~2 중량부의 비율로 혼합 제조할 수 있다.

상기 한약 혼합물은 총 중량의 1~20배의 용매를 이용하는 추출과정을 수행할 수 있다. 추출 조건은 20~125℃에서 12~48시간 동안이 적절하다. 추출된 한약 혼합물은 1,000~3,000rpm에서 10~30분간 원심분리하여 원심분리한 이후에는 상등액만을 취하여 여과할 수 있다.

상기 추출용매는 정제수, 알코올(메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올), 유기용매 및 상기 용매 간의 혼합용매를 사용할 수 있으나 바람직하게는 정제수가 좋다.

상기 여과는 여과과정에 통상적으로 쓰이는 솜, 가는체, 거름종이, 나일론 등을 이용하여 입자를 제거하거나 한외여과법, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

유기용매 또는 유기용매 수용액으로 추출된 여과액은 감압증류하여 분말 상태의 HAD-B로 제조할 수 있으며, 수분이 남아있는 감압증류된 여액은 동결건조, 분무건조, 열풍건조 등을 이용하여 최종적으로 분말 상태의 한약 조성물 HAD-B로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 후수정체 섬유증식증(retrolental fibroplasia), 신생혈관성 녹내장(neovascular glaucoma), 각막 이식(corneal graft neovascularization), 과립성 결막염(trachoma) 등의 안구 계통 질병들과 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농 육아종(pyogenic granuloma)을 치료할 수 있으며 특히 암 발생(cancer development)과 암 전이(cancer metastasis) 억제에 높은 효과를 가질 수 있다.

본 발명은 약학적으로 유효한 양의 HAD-B를 함유하는 신생혈관형성 억제용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 HAD-B를 함유하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 50중량%로 포함될 수 있다. 본 발명의 HAD-B를 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 HAD-B를 함유하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 한약 조성물 HAD-B를 함유하는 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100㎎/㎏의 양을 일일 1회~수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물인 HAD-B는 신생혈관형성 억제 작용을 갖고 있다.

본 발명의 조성물 HAD-B가 처리된 인간혈관내피세포에서는 세포 증식이 억제되고, 모세혈관 튜브 형성과 세포 이동 및 부착 현상이 억제된다. 또한 닭 유정란의 혈관생성작용도 HAD-B가 탁월하게 억제하는 효과가 있음이 밝혀졌으며, 기존에 사용되던 가미서황환 등의 한방제제에 비해서 HAD-B가 현저한 비용절감 효과가 있었다.

본 발명의 조성물 HAD-B는 전통 한방치료기술 지식에 근거한 한방 복합제제로 단일 화학물질이나 천연물 또는 타 한약 추출물과 비교해서 있어서 경쟁력이 있는 분야로 기대되는 한약 조성물이라고 할 수 있다.

도 1은 HAD, HAD-A 및 HAD-B의 세포 이동 억제 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 HAD, HAD-A 및 HAD-B의 혈관내피세포의 부착 억제 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예는 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1. HAD, HAD-A 및 HAD-B의 제조>

먼저 본 발명의 조성물의 신생혈관억제 효과를 조사하였다.

HAD-B를 제조하기 위해 삼칠근 2㎏, 인삼 1.5㎏, 동충하초 1.5㎏, 산자고 1.5㎏, 우황 1㎏, 진주분 1㎏, 유향 1㎏, 몰약 1㎏을 사용하여 한약 혼합물을 제조하였다.

비교대상인 HAD를 제조하기 위해 의이인 6㎏, 삼칠근 2㎏, 인삼 1.5㎏, 해마 1.5㎏, 동충하초 1.5㎏, 산자고 1.5㎏, 우황 1㎏, 진주분 1㎏, 사향 0.4㎏을 사용하여 한약 혼합물을 제조하였다. HAD-A를 제조하기 위해서는 삼칠근 2㎏, 인삼 1.5㎏, 동충하초 1.5㎏, 산자고 1.5㎏, 우황 1㎏, 진주분 1㎏을 사용하였다.

이후 상기 조성물 총 중량 10배의 정제수로 각각 HAD-B를 위한 한약 혼합물에는 105㎏, HAD를 위한 한약 혼합물에는 164㎏, HAD-A를 위한 한약 혼합물에는 85㎏를 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 교반한 후 2,000rpm에서 20분간 원심분리를 하였다. 각각을 원심분리한 후에는 상등액만을 취하여 여과한 후 동결건조를 하였다.

또한 HAD-B가 HAD-A에 유향과 몰약을 추가하여 추출한 조성물이기에 유향과 몰약의 추가 효과를 비교하기 위해, HAD-A를 위한 한약 혼합물에 유향 1㎏만을 추가하여 정제수 95㎏으로 상기와 동일한 방법으로 분말 추출물을 제조하였고, HAD-A를 위한 한약 혼합물에 몰약 1㎏만을 추가하여 정제수 95㎏을 이용하여 동일한 방법으로 분말 추출물을 제조하였다. 이 외에도 HAD가 가미서황환을 개량한 것인데 이와 HAD-B와의 효과를 비교하기 위해 삼칠근 2㎏, 인삼 1.5㎏, 동충하초 1.5㎏, 산자고 1.5㎏, 우황 1㎏, 진주분 1㎏, 사향 0.4㎏, 의이인 6㎏, 유향 1㎏, 몰약 1㎏ 및 하수오 1㎏을 혼합하여 총 중량의 열배인 정제수 169㎏을 이용하여 동일한 방법으로 분말 추출물을 제조하였다.

<실시예 2. 시험관내 혈관내피세포의 증식 억제 효과 측정>

본 발명의 조성물이 혈관내피세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기위해 혈관내피세포로 잘 알려진 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)을 이용하여 세포증식 정도를 확인하였다. HUVEC은 10% 우혈청과 3ng/㎖ bFGF(basic fibroblast growth factor)가 함유된 M199 배지에서 배양 및 유지되었다.

먼저 젤라틴이 코팅된 96웰 세포배양 플레이트에서 24시간 동안 배양된 HUVEC을 3시간 동안 무혈청 상태로 둔 후에 실시예 1의 각각의 분말을 농도별로 처리한 후 72시간 배양하였고 배양 후 MTT 어세이를 이용하여 HUVEC의 세포증식에 미치는 영향을 보았다. MTT 어세이는 [J Biol Chem 279(39), pp 41189-41196, 2004]에 기재된 방법을 이용하였고 그 결과에 대한 IC₅₀을 표 1에 나타내었다.

처방	가미서황환	HAD	HAD-A	HAD-B	HAD-A +유향	HAD-A +몰약
삼칠근 2㎏	○	○	○	○	○	○
인삼 1.5㎏	○	○	○	○	○	○
동충하초 1.5㎏	○	○	○	○	○	○
산자고 1.5㎏	○	○	○	○	○	○
우황 1㎏	○	○	○	○	○	○
진주분 1㎏	○	○	○	○	○	○
유향 1㎏	○	×	×	○	○	×
몰약 1㎏	○	×	×	○	×	○
사향 0.4㎏	○	○	×	×	×	×
의이인 6㎏	○	○	×	×	×	×
해마 1.5㎏	○	○	×	×	×	×
하수오 1㎏	○	×	×	×	×	×
IC₅₀ (㎍/㎖)	775±2	573±2	152±2	15±3	149±3	150±3
× : 해당 조성물 포함안됨, ○ : 해당 조성물 포함됨

표 1의 결과로부터, HAD-B(IC₅₀ 15±3㎍/㎖)가 HAD-A(IC₅₀ 152±3㎍/㎖)와 HAD(IC₅₀ 573±2㎍/㎖)에 비해서 HUVEC의 증식을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 HAD-A를 제조하기 위한 한약혼합물에 유향 또는 몰약을 추가하여 제조한 추출물의 세포증식억제 결과가 거의 차이나지 않음으로 유향과 몰약을 함께 추가하는 것이 혈관내피세포의 증식을 억제하기에 더 효과적이라는 것도 확인되었다. 가미서황환의 결과는 HAD보다 혈관내피세포 증식억제효과가 낮았다.

<실시예 3. 시험관내 세포 이동 억제 효과 확인>

본 발명의 조성물의 혈관내피세포의 이동억제 능력을 확인하기 위해 먼저 HUVEC을 10% 우혈청과 3ng/㎖ bFGF이 함유된 M199 배지에서 유지 및 배양하였으며, 시험관내 세포 이동 진단(in vitro HUVE cell migration assay)을 위해 HUVEC을 16시간 동안 일반 배지(0.1% BSA가 포함된 M199)에서 배양하였다. 이후 3ng/㎖ bFGF와 HAD, HAD-A 및 HAD-B 각각의 조성물이 1, 10, 100, 1000ng/㎖ 농도로 처리된 HUVEC을 1% 젤라틴이 코팅된 필터막(filter membrane)를 통과해 로워 챔버(lower chamber)로 8~12시간 동안 이동시켰다. 이동된 HUVEC을 디프-퀵 염색(Diff-Quik stain)법으로 염색하여 사이언스 랩 프로그램(Science lab program)을 이용하여 본 발명의 조성물이 HUVEC의 이동에 미치는 영향을 측정하였다.

도 1은 HAD, HAD-A 및 HAD-B의 세포이동 억제능력을 나타내는 그래프로, HAD-A와 HAD-B 모두 HAD에 비해서 농도별로 HUVEC의 이동을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었고, HAD-B가 HAD-A보다 효과가 더 뛰어났다.

<실시예 4. 모세혈관 튜브 형성 억제 효과 확인>

다음으로는 본 발명의 조성물의 모세혈관 튜브 형성 억제 효과를 확인하기 위해 모세혈관 튜브 형성 진단(Capillary-like Tube formation assay)을 수행하였다. 먼저 HUVEC을 10% 우혈청과 3ng/㎖ bFGF이 함유된 M199에서 유지 및 배양하였으며, 모세혈관 튜브형성 진단(Capillary-like Tube formation assay)에 사용하기 위하여 16시간 동안 일반 배지(0.1% BSA가 포함된 M199 배지)에서 배양하였다. 이 후 인공 ECM(extracellura matrix)인 매트리젤(Matrigel)을 도포한 24웰 세포 배양 플레이트에 3×10⁵개로 분주하였고 3ng/㎖의 bFGF와 함께 HAD, HAD-A 및 HAD-B도 농도별로 같이 처리하였으며 HUVEC이 모세혈관 튜브구조 구조를 형성하도록 유도하였다.

이 후, 모세혈관 튜브가 생성되도록 16시간 동안 37℃에서 세포를 배양한 후 디프-퀵 염색(Diff-Quik stain)법을 이용하여, 현미경으로 모세혈관 튜브의 생성을 관찰하였고 그 결과를 표 2에 나타내었다.

조성물	사용량	모세혈관 튜브 형성률 (%)
PBS(음성대조군)		10.1
HAD	100㎍/㎖	79.2
HAD	200㎍/㎖	75.1
HAD-A	100㎍/㎖	62.2
HAD-A	200㎍/㎖	35.2
HAD-B	100㎍/㎖	31.1
HAD-B	200㎍/㎖	14.2
bFGF(양성대조군)	5ng/㎖	99.8

표 2의 결과를 확인하면 HAD-B 처리군에서 다른 조성물 처리군에 비해 HUVEC의 모세혈관 튜브 형성률이 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있다.

<실시예 5. 시험관내 혈관내피세포의 부착 억제 확인>

본 발명의 조성물이 세포부착을 억제하는지를 확인하기 위해 먼저 10% 우혈청과 3ng/㎖ bFGF이 함유된 M199 배지에서 유지 및 배양되던 HUVEC을, 5×10⁴개로 무혈청의 M199 배지에 현탁시켰다. HUVEC에는 3ng/㎖의 bFGF와 함께 HAD, HAD-A 및 HAD-B를 농도별로 처리하여 37℃에서 20분간 전반응(preincubation)을 수행하였다. 이후 다시 5×10⁵개의 HUVEC을 무혈청 M199 배지에 현탁시켜 이 세포들을 ECM 단백질(vitronectin, fibronectin, collagen, laminin, matrigel 등)로 도포된 96웰 세포배양 플레이트에 가하였다. 1시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양한 후, 부착되지 않은 세포는 PBS로 세척하여 제거하고 96-웰 세포배양 플레이트 바닥에 부착된 세포만 고정시킨 후 코마시블루(Comassie blue)로 염색하여 540㎚ 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였으며 이 값으로 각 웰의 세포수를 비교 계산하였다. 상기 결과는 도 2에 나타내었으며 도 2의 결과로 HAD-A와 HAD-B가 HAD보다 세포 부착에 있어서 현저한 억제효과가 있는 것을 확인할 수 있었으며 HAD-B의 효과가 HAD-A보다 더 뛰어났다.

<실시예 6. 혈관확장억제능력 확인>

생체 혈관확장억제능력을 확인하기 위해 CAM 어세이(chorioallantoic membrane assay)를 수행하였다. 먼저 산란되어 18℃ 이하에서 3~4일 이내로 보관된 닭 유정란을 1일배로 하여 이것을 38℃, 90% 이상의 습도에서 배양하였다. 첫째날에는 유정란의 뾰족한 끝 부분에 칼로 흠을 내어 오브알부민(ovalbumin)을 5㎖씩 제거하였으며 2일 뒤 유정란의 에어색(air sac)이 있는 쪽에 직경 2~3㎝ 크기의 창(window)을 내었고 5일 뒤에는 3ng/㎖의 bFGF와 함께 HAD, HAD-A 및 HAD-B 조성물을 CAM 위에 올려놓았다. 4일 뒤 혈관이 뚜렷하게 보이도록 1㎖ 주사기로 인트라리포제(Intralipose, Fat emulsion)를 CAM의 바로 아래 부분에 주입한 후 카메라로 근접 촬영하였다. 또한 용매만을 처리한 것을 대조군으로 비교하여 혈관 형성에 미치는 영향을 보았다. 상기 결과는 표 3에 나타내었는데, 표 3의 결과를 통해 HAD-B가 다른조건에 비해 신생혈관형성을 월등히 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

조건	CAM angiogenesis inhibition (%)
bFGF	0.06
HAD	49.0
HAD-A	72.1
HAD-B	98.2

<실시예 7. HAD, HAD-A 및 HAD-B의 단회 및 반복투여 독성시험>

본 발명의 조성물과 관련된 부작용을 알아보기 위해 생후 4~5주령 암컷 ICR 생쥐를 이용한 급성 및 아급성 독성평가를 수행하였다.

7-1. 단회투여실험

HAD, HAD-A 및 HAD-B를 최고농도(10g/㎏), 고농도(5g/㎏), 중농도(2.5g/㎏) 및 저농도(1.25g/㎏)에 대하여 각 군당 5마리씩 배치하여 4군을 설정한 후 1회 경구투여 하였으며 경구투여 후 15일간 관찰하였으나 특별한 독성이 없었다.

7-2. 반복투여 실험

HAD, HAD-A 및 HAD-B를 고용량투여군(2.5g/㎏), 저용량투여군(0.25g/㎏)으로 나누고, 각 군당 체중이 균등한 12마리씩을 배정한 후, 1일 1회 15일간 경구투여 하였으며 경구투여 후 15일간 관찰하였으나 15일간 반복투여 실험에도 약물과 관련된 이상은 보이지 않았다.

< 실시예 8. 약제의 제조예 >

8-1. 산제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B ................................ 300㎎

유당 ................................................. 100㎎

탈크 ................................................. 10㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

8-2. 정제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B ................................. 300㎎

옥수수전분 ............................................. 100㎎

유당 .................................................. 100㎎

스테아린산 마그네슘 ................................... 2㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

8-3. 캅셀제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B .................................. 300㎎

옥수수전분 ............................................. 100㎎

유당 ................................................... 100㎎

스테아린산마그네슘 ..................................... 2㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

8-4. 주사제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B .................................. 300㎎

주사용 멸균 증류수....................................... 적량

pH 조절제 ............................................... 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

8-5. 액제의 제조

본 발명의 조성물 HAD-B ................................... 0.5g

이성화당 ................................................. 10g

만니톨 .................................................. 5g

정제수 ................................................... 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims

삼칠근 2~4 중량부, 인삼 1.5~3 중량부, 동충하초 1.5~3 중량부, 산자고 1.5~3 중량부, 우황 1~2 중량부, 진주분 1~2 중량부, 유향 1~2 중량부 및 몰약 1~2 중량부의 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 신생혈관형성 억제용 약학조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 약학조성물은 당뇨병성 망막증, 후수정체 섬유증식증, 신생혈관성 녹내장, 과립성 결막염(trachoma), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관종(hemangiomas), 섬유성 혈관종(angiofibroma), 건선(psoriasis), 화농 육아종(pyogenic granuloma), 암 발생(cancer development) 또는 암 전이(cancer metastasis) 치료용 약학조성물.
1공정 : 삼칠근 2~4 중량부, 인삼 1.5~3 중량부, 동충하초 1.5~3 중량부, 산자고 1.5~3 중량부, 우황 1~2 중량부, 진주분 1~2 중량부, 유향 1~2 중량부 및 몰약 1~2 중량부를 혼합하여 한약 혼합물을 제조하는 단계;
2공정 : 상기 1공정의 한약 혼합물을 정제수를 이용하여 20~125℃에서 추출하는 단계;
3공정 : 상기 2공정에서 추출된 한약 혼합물을 원심분리하여 한약 추출물의 상등액만을 취하여 여과하는 단계; 및
4공정 : 상기 3공정의 여과 여액을 동결건조, 분무건조, 열풍건조 등을 이용하여 최종적으로 분말 형태의 한약 조성물을 제조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 신생혈관형성 억제용 조성물을 제조하는 방법.