KR101772954B1 - 으름덩굴 종자 추출물과 인삼이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 으름덩굴 종자 추출물과 인삼이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 생약 혼합 추출물은 인체에 독성은 거의 없으나, 암세포에 대해서는 강력한 세포독성을 나타내며, 다른 항암성분의 항암성을 상승시키므로, 항암용 약학조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

으름덩굴 종자 추출물과 인삼이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물 {A anticancer pharmaceutical composition comprising herbal mixture extract of akebia quinata seed extract and panax ginseng, and lipopolysacharide}
본 발명은 으름덩굴 종자 추출물과 인삼이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물에 관한 것이다.
신체를 구성하는 가장 작은 단위인 세포(cell)는 정상 조건의 경우, 세포 자체의 조절 기능에 의해 분열 및 성장하고, 수명이 다하거나 손상되면 스스로 사멸하여 전반적인 수의 균형을 유지한다. 그러나 여러 가지 원인에 의해 세포 자체의 조절 기능에 문제가 생기면 정상적으로 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하게 되며, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴(덩어리)를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는데, 이러한 상태를 암(cancer)으로 정의할 수 있다. 암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있으며, 의학 기술 또한 혁신적으로 발전하고 있지만, 그럼에도 불구하고 암에 의한 사망은 지속적으로 증가 추세에 있다. 우리나라의 경우에는 질병 사망원인 중 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있는 실정이다.
또한, 암이 발병되어 진행이 계속될 경우, 수술 등의 외과적 치료법과 함께 화학적 치료법이나 방사선치료 등을 병행하여 집중적으로 치료하지만, 조혈이나 면역기능 억제 등의 부작용이 나타나 큰 문제로 대두되고 있다.
암 치료를 위한 새로운 접근 방법으로서, 독성이 비교적 낮은 천연물로부터 부작용이 적고 효능이 뛰어난 항암제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다. 천연물 유래의 항암제로 대표적인 것은 주목나무에서 분리한 택솔(taxol)이 있으나, 암세포의 사멸뿐만 아니라 신체 내 다른 정상세포에도 작용하며, 물에 대한 용해도가 낮아서 독성 및 부작용이 심각한 것으로 보고되어 있다. 또한, 현재까지 연구된 세포독성이나 항암성을 보이는 식물은 수없이 많지만 그 중 주목, 장춘화 등의 몇 가지 식물에서 분리된 물질만 실용되고 있는 실정이다. 수많은 연구실에서 연구된 세포독성 또는 항암성 물질은 독성이나 부작용 또는 인체에 대한 효과의 부재로 학술적 문헌으로만 머물러 있으며, 안정성과 치료효과 모두를 담보하기 위해서는 다양한 접근방법에 기초한 암 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
내독소는 그람음성균(대장균, 살모넬라균, 적리균, 브루셀라균 등)의 세포외각표면을 이루는 물질군의 하나로서 동물의 혈액에 들어가게 되면 면역체계에 관여하여 발열, 저혈압, 염증반응, 심한 한기, 혈관계의 이상 등을 일으키며 심한 경우 패혈성 쇼크를 일으켜 사망에 이르게 한다. 또한, 화학적으로는 지질다당류(lipopolysacharides, LPS)에 속하며, 혈액 내에 존재하게 되면 대식세포(machrophage), 단핵세포(monocyte), 자연살해세포(natural killer-cell, NK-cell)등을 활성화시키며, 특히 대식세포가 활성화되면 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)가 분비되어 암세포에 대한 세포독성을 보인다. 선행문헌[Goto, S. et al., 1996]에는, 암 환자에게 지질다당류를 피하주사하면서 따로 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 정맥주사 하는 경우 일정한 항암 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
식물성분 중 사포닌은 관절을 유연하게 하거나 간장 세포의 재생 또는 항암효과를 보이는 약리상의 효능뿐만 아니라 제제학상으로도 좋은 역할을 하는데, 이는 비누효과를 나타내어 추출물의 수용성이나 현탁성을 증가시키기 때문이다. 따라서 사포닌 함유 추출물을 주사용제로 쉽게 만드는 것이 가능하다.
인삼(panax ginseng)은 예로부터 한국과 중국에서 각종 질병의 예방과 치료에 전통적으로 사용되어온 다년생 식물로, 탁월한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 장기간 사용하여도 전혀 부작용이 없다고 알려져 있다. 또한, 27종의 진세노사이드라는 사포닌을 함유하는 대표적인 사포닌 생약으로서 암, 당뇨병, 고혈압, 동맥경화, 치매, 골다공증 예방, 노화 방지, 두뇌활동 촉진, 갱년기 장애, 여성 피부미용 등에 좋은 것으로도 알려져 있다.
특히, 인삼의 지용성 성분을 함유하는 헥산 추출물이나 에틸아세테이트 추출물은 암세포에 대하여 강력한 세포독성을 나타내는데, 이는 파낙시돌(panaxydol), 파낙시리올(panaxyriol) 등의 9개로 구성된 폴리아세틸렌(polyacetylene)임이 밝혀졌으며 특히, 상기 파낙시돌은 암세포에 강한 세포독성을 보이는 성분으로 알려져 있다(Ahn, B. Z. et al., 1985).
으름덩굴(akebia quinata)은 으름이라고도 하며, 아케비아 사포닌(akebia saponin) 7종(A 내지 G)을 다량 함유하는 사포닌 함유 생약이고, 한방에서는 뿌리와 줄기를 소염, 이뇨, 통경 작용에 대한 약재로 쓴다. 한국등록특허 제10-0573375호에는 으름덩굴 종자를 물에서 숙성시킴으로써 사포닌을 함유하는 추출물의 항암성 효과에 대해 개시하고 있다.
전호(anthriscus sylvestris)의 뿌리를 토전호 또는 아삼이라고 하며, 전통적으로 감기로 인한 기침, 천식, 두통 등에 사용되어 왔다(이창복, 2006; 육창수, 1997). 주요 성분으로는 데옥시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin), 안트리신(anthricin), 이소안트리신(isoanthricin), α-피넨(α-pinene) 등이 알려져 있으며, 약리작용으로는 기관지점액분비 촉진, 관상동맥혈류량 증가, 항유행성 감기바이러스, 항궤양, 항경련, 항알레르기, 항암, 항균작용 등이 보고되었다. 특히, 데옥시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin)은 한국공개특허 제2009-0119123호 및 선행문헌 [Kim, Y. et al., 2002]에 항암제로서 암세포를 억제할 수 있는 효과가 있음이 개시되어 있다.
지치(lithospermum erythrorhizon)의 뿌리를 한방에서는 자초(紫草)라는 약재로 쓰는데, 토혈, 코피, 소변 출혈 및 홍역에 효과가 있고, 화상, 동상, 습진, 발진, 피부궤양 등에 소독약으로 외용한다. 또한, 1,4-나프토퀴논(napthoquinone)계 물질을 함유하고 있으며, DNA 토포이소머라아제-I(topoisomerase-I)을 저해함으로써 암세포에 대한 강력한 세포독성을 갖는 것임이 선행문헌 [Ahn, B. Z. et al., 1995]에 개시되어 있다.
상기와 같이, 인삼, 으름덩굴 종자, 전호 및 지치에 대한 다양한 약리 효과 및 항암효과가 선행문헌을 통해 알려져 있으나, 상기 생약 성분을 혼합한 혼합 추출물 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물에 대해서는 아직까지 개시된 바 없다.
한국공개특허 제1999-0013196호, 신규 항암제 조성물, 1999년 02월 25일, 공개. 한국공개특허 제2009-0119123호, 데옥시포도필로톡신의 항암제로서의 용도, 2009년 11월 19일, 공개. 한국등록특허 제10-0573375호, 으름덩굴 종자 추출물을 포함하는 항암 조성물 및 그의 제조방법, 2006년 04월 17일, 등록.
육창수, 생약도감, 도서출판 경원, 386, 1997. 이창복, 원색대한식물도감, 향문사, 818, 2006. Ahn, B. Z. et al., Antineoplastic Natural Products and the Analogues VI - Panaxydol , the Cytotoxic Principle of the Panax Ginseng Root Against L1210 Cell, Archives of Pharmacal Research, 8(4), 283-284, 1985. Ahn, B. Z. et al., Acylshikonin analogues: synthesis and inhibition of DNA topoisomerase-I, J Med Chem., 38(6), 1044-1047, 1995. Goto, S. et al., Intradermal administration of lipopolysacharide in tratment of human cancer, Cancer Immunol Immunother., 42(4), 255-261, 1996. Kim, Y. et al., Deoxypodophyllotoxin; the cytotoxic and antiangiogenic component from Pulsatilla koreana, Planta Medica, 68(3), 271-274, 2002. Utsugi, T. et al., Antitumor activity of a novel podophyllotoxin derivative (TOP-53) against lung cancer and lung metastatic cancer, Cancer Res., 56(12), 2809-2814, 1996.
본 발명의 목적은 으름덩굴 종자 추출물과 인삼이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 으름덩굴 종자(akebia quinata seed) 추출물과 인삼(panax ginseng)이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소(lipopolysacharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물에 관한 것이다.
상기 으름덩굴 종자 추출물은, 으름덩굴 종자 분말과 물을 1:1~3의 중량비로 혼합하여 35~40℃에서 1~4시간 동안 숙성시키는 단계(1공정); 1공정의 숙성물을 70~90℃의 온도에서 15~60분간 가열하는 단계(2공정); 및 2공정의 생성물에 헥산을 가한 뒤 헥산 층을 제거하고, 물층을 감압 농축하는 단계(3공정); 를 포함하여 제조된 추출물이다.
또한, 상기 생약 혼합 추출물은 으름덩굴 종자 100 중량부로부터 추출된 으름덩굴 종자 추출물이 인삼 40~60 중량부와 혼합된 것을 C1 내지 C4의 저급 알코올로 추출 및 농축하는 것이다.
상기 생약 혼합 추출물 100 중량부를 기준으로, 내독소가 1.0×10-8 내지 1.0×10-7 중량부로 혼합되며, 상기 항암용 약학조성물의 약제학적 제형은 주사제 조성물이다.
또한, 본 발명의 상기 생약 혼합 추출물은, 으름덩굴 종자 100 중량부로부터 추출된 으름덩굴 종자 추출물이 인삼 40~60 중량부와 혼합된 혼합물에, 전호(anthriscus sylvestris) 0.5~3 중량부 또는 지치(lithospermum erythrorhizon) 1~5 중량부 중 1종 이상의 생약을 추가로 혼합하여 C1 내지 C4의 저급 알코올로 추출 및 농축하는 것이며, 상기 생약 혼합 추출물 100 중량부를 기준으로 내독소가 1.0×10-8 내지 1.0×10-7 중량부로 혼합된다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 으름덩굴 종자(akebia quinata seed) 추출물과 인삼(panax ginseng)이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소(lipopolysacharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물에 관한 것이다.
상기 으름덩굴 종자 추출물은, 으름덩굴 종자 분말과 물을 1:1~3의 중량비로 혼합하여 35~40℃에서 1~4시간 동안 숙성시킨 후, 70~90℃의 온도에서 15~60분간 가열하고 헥산을 가한 뒤 흔들어 준 다음, 헥산 층을 제거하고 물층을 감압 농축하여 제조된 추출물이다. 바람직하게는 으름덩굴 종자 분말과 물을 1:1.5~2의 중량비로 혼합하여, 38~39℃에서 2~3시간 동안 숙성시킨 후, 75~85℃의 온도에서 25~45분간 가열하고 헥산을 가한 뒤 헥산 층을 제거하고 물층을 감압 농축하여 으름덩굴 종자 추출물을 얻을 수 있다.
또한, 상기 생약 혼합 추출물은 으름덩굴 종자 100 중량부로부터 추출된 으름덩굴 종자 추출물이 인삼 40~60 중량부와 혼합된 것을 C1 내지 C4의 저급 알코올로 추출하며, 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올(또는 98%[v/v] 이상의 메탄올 수용액 또는 에탄올 수용액)을 사용하여 추출함으로서, 생약에 포함된 자연산 내독소의 혼입을 막을 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 생약 혼합 추출물 100 중량부를 기준으로, 내독소가 1.0×10-8 내지 1.0×10-7 중량부로 혼합되며, 바람직하게는 5.0×10-8 내지 1.0×10-7 중량부로 혼합할 수 있다. 상기 범위를 초과하여 내독소를 포함하는 경우에는 독성이 나타날 수 있어 바람직하지 않으며, 상기 범위 미만으로 내독소를 포함하는 경우에는 항암 효과가 좋지 않다.
본 발명의 상기 항암용 약학조성물의 약제학적 제형은 주사제 조성물이며, 상기 생약 혼합 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배 등 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 상기 생약 혼합 추출물은 용매에 녹인 후 밀리포어 등으로 세균여과하여 주사제로 사용할 수 있다.
또한, 상기 생약 혼합 추출물은, 으름덩굴 종자 100 중량부로부터 추출된 으름덩굴 종자 추출물이 인삼 40~60 중량부와 혼합된 혼합물에, 전호(anthriscus sylvestris) 0.5~3 중량부 또는 지치(lithospermum erythrorhizon) 1~5 중량부 중 1종 이상의 생약을 추가로 혼합하여 C1 내지 C4의 저급 알코올로 추출 및 농축한다.
본 발명은 또한, 항암용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 암은 악성 종양(malignant tumor)이라고도 하며, 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리로서, 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하게 되는 질환을 의미하며, 암종(carcinoma)과 육종(sarcoma)을 포함한다. 보다 자세하게는 위암, 간암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 전립선암, 고환암, 식도암, 담도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 전립선암, 부신암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 흉선종, 중피종, 신장암, 혈액암, 뇌암, 중추신경계종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 생약 혼합 추출물 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으나, 본 발명의 생약 혼합 추출물에 함유된 내독소는 인체에 0.5ng/체중㎏을 초과하여 사용하는 경우, 발열, 저혈압, 심박수 증가 등을 포함하는 증상이 나타날 수 있으므로, 상기 범위 미만으로 사용해야 한다. 바람직하게는, 내독소 수치가 멸균주사용수 1㎖당 0.005 내지 0.05ng이 포함되고, 보다 바람직하게는 내독소 수치가 멸균주사용수 1㎖당 0.025 내지 0.05ng이 포함되게 사용하는 것이 좋다.
또한, 본 발명의 생약 혼합 추출물 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한, 경구 투여의 경우 내독소의 항암효과가 없어지며, 고형암 등의 노출된 암의 경우에는 암조직내 주사(intratumoral injection)에 의해 투여될 수 있다. 특히, 암조직내 주사의 경우, 고형암의 견고성 때문에 직접 주사가 어려우므로 고주파열처리(radiofrequency ablation)를 통해 암조직을 파괴한 후 조직 내로 직접 주사하는 것이 바람직하다.
본 발명은 으름덩굴 종자 추출물과 인삼이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 생약 혼합 추출물은 인체에 독성은 거의 없으나, 암세포에 대해서는 강력한 세포독성을 나타내며, 다른 항암성분의 항암성을 상승시키므로, 항암용 약학조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-13의 생약 혼합 추출물 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물에 대한 평균 암성장저지율(%)을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 생약 혼합 추출물 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물의 제조>
본 발명의 으름덩굴 종자 추출물과 인삼이 혼합된 생약 혼합 추출물, 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물을 제조하기 위해 먼저, 으름덩굴 종자 추출물을 제조하였다. 상기 으름덩굴 종자 추출물은 물에서 숙성시킴으로서 항암성이 있는 사포닌을 생성시킬 수 있으므로, 다른 생약 성분들과는 다르게 으름덩굴 종자는 물에서 숙성하여 제조한 뒤 사용하였다.
먼저, 으름덩굴 종자 분말 150g에 물 250㎖을 가하여 분쇄기로 분쇄한 뒤, 발효기에 옮겼으며, 분쇄기에 남아 있는 식물체는 물 50㎖로 세척하여 발효기에 함께 넣어 주었다. 이후, 37℃에서 2시간 동안 숙성시키고, 숙성이 끝난 즉시 발효기의 온도를 80℃로 올려 30분간 가열하였으며, 상기 혼합 처리물을 실온에서 식힌 다음 깔때기에 넣고 헥산 500㎖를 가하여 30분 동안 혼합 및 방치하였다가 헥산 층을 제거하였다. 상기 탈지 조작을 한 번 더 시행한 후 남은 물층을 감압농축기로 건조하여 으름덩굴 종자 추출물을 얻었으며, 하기 표 1의 구성을 참고하여 내독소를 함유하는 생약 혼합 추출물을 제조하였다.
으름덩굴 종자 분말 30g에 해당하는 추출물 전량과 잔뿌리와 근피를 제거하지 않고 건조한 인삼 분말, 전호 분말 및 지치 분말을 하기 표 1의 구성으로 혼합하여 알코올(메탄올 또는 에탄올) 200㎖를 가한 뒤 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응물은 여과한 후 여액은 보관하고, 남은 식물체에는 동일 추출 조작을 2회 더 반복하였다. 얻은 여액을 모두 합하여 감압건조기에서 건고하고, 각 건고물에 알코올(메탄올 또는 에탄올) 150㎖을 가하여 교반한 후, 13시간 동안 방치하였다. 이후, 여과 및 감압 건고하여 생약 혼합 추출물(내독소 미포함)을 얻었으며, 상기 생약 혼합 추출물 전량을 하기 표 1의 함량으로 내독소(lipopolysaccharides from Escherichia coli, Sigma-aldrich, USA)가 용해되어 있는 주사용수 1000㎖에 가하고 혼화하였다. 12시간 동안 방치한 다음, 밀리포어로 세균 여과함으로서 본 발명의 생약 혼합 추출물 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물인 실시예 1-1 내지 1-13을 얻을 수 있었으며, 상기 조성물을 장기 보관하는 경우, 5~10㎖씩 바이알에 넣어 동결건조하여 보관하였고, 사용시에 동일 양의 생리식염수에 용해하여 사용하였다.
조건 생약 혼합 추출물의 구성 LPS(ng)/주사용수(ℓ)
으름덩굴 종자
(g)		 인삼
(g)		 전호
(g)		 지치
(g)
실시예 1-1 30 15 - - 30
실시예 1-2 30 15 - - 5
실시예 1-3 30 15 - - 50
실시예 1-4 30 15 0.3 - 30
실시예 1-5 30 15 0.5 - 30
실시예 1-6 30 15 - 0.6 30
실시예 1-7 30 15 - 1 30
실시예 1-8 30 15 0.3 0.6 30
실시예 1-9 30 15 0.3 0.6 5
실시예 1-10 30 15 0.3 0.6 50
실시예 1-11 30 15 0.5 1 30
실시예 1-12 30 15 0.5 1 5
실시예 1-13 30 15 0.5 1 50
< 비교예 1. 비교대상 추출물의 제조 - 내독소 미포함>
한국등록특허 제573375호를 참고하여 비교대상 추출물을 제조하였다. 먼저, 으름덩굴 종자 36g을 유발에 가하고 40㎖의 물을 가하고 분쇄하였다. 분쇄된 내용물을 250㎖ 크기의 비커에 넣고 유발은 물 14㎖로 씻어서 다시 비이커에 넣었다. 비커 내용물 표면은 젖은 거즈로 덮고 실온(22도)에서 1시간 방치하였다. 1시간이 지나면 여기에 메탄올(98%이상의 순도) 80㎖를 가한다음 30분간 교반하였다. 추출물을 여과하고 남은 식물체에는 80% 메탄올 150㎖를 가하고 30분간 교반하였다. 메탄올 용해 분을 여과하여 얻고 1차분과 합쳤다. 합친 메탄올 용해 분을 감압 건고한 다음 여기에 98% 메탄올 30㎖를 가하고 10분간 교반하였다. 메탄올 용분을 여과하고 불용분은 메탄올 10㎖와 섞고 10분간 교반하였다. 여과 후 1차분과 합쳤다. 합친 메탄올 용해 분은 작은 분액여두에 옮기고 헥산 40㎖를 가하여 흔들어 준 다음 방치한 뒤, 헥산층은 버리고 하층의 메탄올 용액 층을 분리하였다. 이후, 상기과정에서 분리된 하층의 메탄올층에 헥산 40㎖를 가하여 흔들어 준 다음 방치하여, 하층의 메탄올 용해부분을 취한 뒤, 완전히 건고하여 100% 에탄올 30㎖를 가하고 흔들어 준 후 방치 및 여과하여 으름덩굴 종자 추출물을 얻었다.
상기 과정에서 제조된 으름덩굴 종자 추출물과 인삼 5g으로부터 얻은 아세톤 추출물 및 전호 8g으로부터 얻은 에테르 추출물을 혼합한 혼합물을, 내독소가 없는 환경에서 주사용수 100㎖ 및 1000㎖을 각각 가한 뒤, 교반하고 1~2시간 방치 및 세균 여과하여 비교예 1-1 및 비교예 1-2를 얻었으며, 모든 액제는 사용 직전에 제조하였다.
<비교예 2. 비교대상 추출물의 제조 - 내독소 포함>
상기 실시예 1의 조건과 동일하게 제조하되, 하기 표 2의 조건으로 각각의 비교대상 추출물을 제조하였다.
조건 생약 혼합 추출물의 구성 LPS(ng)/주사용수(ℓ)
으름덩굴 종자
(g)		 인삼
(g)		 전호
(g)		 지치
(g)
비교예 2-1 30 15 - - 0.5
비교예 2-2 30 15 - - 2.5
비교예 2-3 30 15 - - 100
비교예 2-4 30 30 - - 30
비교예 2-5 30 7.5 - - 30
비교예 2-6 30 15 0.5 3 30
비교예 2-7 30 15 0.5 3 0.5
비교예 2-8 30 15 0.5 3 100
비교예 2-9 30 15 1.8 1 30
비교예 2-10 30 15 1.8 1 0.5
비교예 2-11 30 15 1.8 1 100
비교예 2-12 30 30 1.8 3 30
비교예 2-13 30 7.5 0.3 0.15 30
< 실험예 1. LL /2 세포를 이용한 동물실험>
실험예 1-1. LL/2 세포(Lewis Lung Carcinoma Cell-2)와 배양액
배양액은 멸균 주사용 증류수에 L-글루타민(glutamine)이 포함된 RPMI-1640 배양액 1 pack과, 56℃ 수조에서 30분간 가열하여 불활성화시킨 FBS(fetal bovine serum) 100㎖, 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate) 2g, 페니실린(penicillin) 10만 단위 및 스트렙토마이신(streptomycin) 100㎎을 넣어 용해시킨 후, 0.1N HCl으로 pH를 조절하여 최종 부피를 1ℓ가 되게 하고, 이를 세균 여과하여 제조하였으며, 4℃에서 보관 및 사용하였다. 세포는 3일에 한 번씩 계대하여 유지하였으며, 세포를 부착면으로부터 분리하기 위하여 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 0.5%[w/v] 트립신(trypsin)과 2%[w/v] EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 녹인 용액을 사용하였다.
실험예 1-2. LL/2 세포를 이용한 동물실험
시험관내에서 배양한 LL/2세포를 멸균된 냉 생리식염수를 사용하여, 충분히 세척한 후 세포를 혈구계(haemacytometer)로 세어 5×106 cells/㎖의 농도로 세포 부유액을 만들고, 상기 부유액을 0.2㎖씩 마우스의 겨드랑이에 피하로 이식하였다. 이식 24시간 후에 각 군을 5 마리로 분류하였다. 시료는 주사하기 바로 직전에 제조하고, 실험동물의 복강 내에 0.2㎖씩 주사하였다. 대조군에는 시료 투여량과 같은 용량으로 생리식염수만을 투여하였다.
주사일정은 시료에 따라 다르나 통상적으로 암세포 이식 후 24시간이 지난 후에 시작하여 3, 5, 7, 9, 11일, 투여하다가 16, 17일 다시 투여하여 전체 9회 투여하였다(Utsugi, T. et al., 1996).
마우스에 대한 각각의 시료의 독성을 측정하기 위해 2일 간격으로, 몸무게를 1회씩 측정하였으며, 항암 효과는 약물투여 11일∼19일에 대조군과 본 발명의 상기 실시예 1-1 내지 1-13을 처리한 군에 대한 암괴의 부피를 측정한 후, 하기 수학식에 따라 계산하였으며, 암성장저지율은 3회 측정한 평균치로 나타내었다.
[수학식]
암의 부피(㎜3) = 길이 (㎜) × 폭2(㎜2) / 2
암성장저지율 (inhibition ratio, %) = (C - T) × 100 / C
(상기 수학식에서, C : 대조군의 평균 암부피 (㎜3), T : 실시예 또는 비교예 처리군의 평균 암부피 (㎜3)를 나타낸다.)
조건 암성장저지율 % 평균 %
실시예 1-1 75(5), 80(5), 81(5) 78.7(15)
실시예 1-2 79(5), 75(5), 73(5) 75.7(15)
실시예 1-3 83(5), 79(5), 81(5) 81.0(15)
실시예 1-4 79(5), 82(5), 78(5) 79.7(15)
실시예 1-5 83(5), 78(5), 80(5) 80.3(15)
실시예 1-6 75(5), 80(5), 78(5) 77.7(15)
실시예 1-7 80(5), 75(5), 81(5) 78.7(15)
실시예 1-8 81(5), 85(5), 82(5) 82.7(15)
실시예 1-9 74(5), 79(5), 82(5) 78.3(15)
실시예 1-10 79(5), 85(5), 80(5) 81.3(15)
실시예 1-11 80(5), 85(5), 81(5) 82.0(15)
실시예 1-12 83(5), 80(5), 79(5) 80.7(15)
실시예 1-13 80(5), 82(4), 85(5) 82.3(14)
비교예 1-1 83(5), 80(5), 79(5) 80.7(15)
비교예 1-2 51(5), 42(5), 41(5) 44.7(15)
비교예 2-1 64(5), 60(5), 59(5) 61.0(15)
비교예 2-2 65(5), 63(5), 62(5) 63.3(15)
비교예 2-3 81(4), 75(4), 83(4) 79.7(12)
비교예 2-4 68(5), 71(5), 71(5) 70.0(15)
비교예 2-5 66(5), 72(5), 73(5) 70.3(15)
비교예 2-6 73(4), 69(5), 72(5) 71.3(14)
비교예 2-7 65(5), 61(5), 60(5) 62.0(15)
비교예 2-8 78(3), 80(4), 80(4) 79.3(11)
비교예 2-9 75(4), 72(4), 69(5) 72.0(13)
비교예 2-10 66(5), 61(5), 63(5) 63.3(15)
비교예 2-11 78(4), 76(4), 80(3) 78.0(11)
비교예 2-12 79(4), 73(4), 80(4) 77.3(12)
비교예 2-13 65(5), 63(5), 69(4) 65.7(14)
* 암성장저지율; 대조군에 대한 투약군의 암크기의 백분율.
* 괄호안 숫자 : 실험 종료 후 살아 있는 동물 수
* 독성 : 3회 실험에 사용한 총 15마리 중 5-6마리 이상이 죽을 경우 독성이 강독성, 3-4마리 죽은 경우는 약독성.
상기 표 3을 참고하면, 비교예 1-1은 한국등록특허 제573375호에 개시된 생약 혼합 추출물과 유사하게 제조하여 암성장저지율을 측정한 군으로서 내독소는 포함되지 않았으나, 본 발명의 생약 혼합 추출물 및 내독소를 포함하는 실시예 1-1 내지 1-13과 유사한 암성장저지율을 나타낸다. 그러나, 상기 비교예 1-1은 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-13과는 다르게, 주사용수 100㎖에 생약 혼합 추출물이 포함된 것으로서, 실시예 1-1 내지 1-13보다 10배 더 많은 생약 혼합 추출물이 주사용수에 포함되어 있다. 이에, 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-13과 동일한 조건으로서, 주사용수 1000㎖에 생약 혼합 추출물을 더하는 비교예 1-2의 경우, 비교예 1-1의 결과와는 달리 암성장저지율이 2배 감소된 것을 확인할 수 있다. 반면, 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-13의 암성장저지율은 비교예 1-1 보다 주사용수에 포함된 생약 혼합 추출물이 10배 더 적음에도 불구하고 동등한 효과를 나타내어, 본 발명의 생약 혼합 추출물 및 내독소를 포함하는 항암용 약학조성물이 항암효과에 상승적으로 작용하여, 우수한 암성장저지율을 나타내는 것임을 확인할 수 있다.
또한, 비교예 1-1 및 1-2와는 다르게 본 발명의 항암용 약학조성물의 구성 함량을 벗어하는 비교예 2-1 내지 2-13의 경우, 실시예 1-1 내지 1-13보다 암성장저지율이 낮거나 또는 독성이 있는 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명의 구성으로 제조된 내독소를 함유하는 생약 혼합 추출물이 암성장을 저지하는 효과가 가장 우수하므로, 항암용 약학조성물로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.

Claims (8)

  1. 으름덩굴 종자(akebia quinata seed) 100 중량부로부터 추출된 으름덩굴 종자 추출물, 인삼(panax ginseng) 40~60 중량부, 전호(anthriscus sylvestris) 0.5~3 중량부 및 지치(lithospermum erythrorhizon) 1~5 중량부를 혼합하여 C1 내지 C4의 저급 알코올로 추출 및 농축한 생약 혼합 추출물 100 중량부, 및, 내독소(lipopolysacharide) 1.0×10-8 내지 1.0×10-7 중량부를 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 고형암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 으름덩굴 종자 추출물은,
    으름덩굴 종자 분말과 물을 1:1~3의 중량비로 혼합하여 35~40℃에서 1~4시간 동안 숙성시키는 단계(1공정);
    1공정의 숙성물을 70~90℃의 온도에서 15~60분간 가열하는 단계(2공정); 및
    2공정의 생성물에 헥산을 가한 뒤 헥산 층을 제거하고, 물층을 감압 농축하는 단계(3공정);
    를 포함하여 제조된 추출물인 것을 특징으로 하는 고형암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약학조성물의 약제학적 제형은 주사제 조성물인 것을 특징으로 하는 고형암의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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