KR100903030B1

KR100903030B1 - 멜리사엽 추출물 분획 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR100903030B1
Application number: KR1020070084929A
Authority: KR
Inventors: 김민영; 함종천; 박병영; 박은규; 이희석
Original assignee: 주식회사 안지오랩; 김민영
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2009-06-18
Anticipated expiration: 2027-08-23
Also published as: CA2696207C; AU2008289713A1; US20210052686A1; EP2178545A2; JP5778420B2; WO2009025532A2; BRPI0814914A2; EP2178545A4; WO2009025532A3; CN102316884A; CA2696207A1; US20100278914A1; US10894071B2; AU2008289713B2; EP2178545B1; CN102316884B; JP2010536847A; KR20090020285A; ES2472790T3; US11224629B2

Abstract

본 발명은 멜리사엽을 50-100% 알코올로 추출한 후 건조시키고, 상기 에탄올 추출물을 물로 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 분획하여 건조시키고, 상기 에틸아세테이트 분획을 물로 현탁시킨 후 건조시켜 얻은 멜리사엽 추출물 분획 및 상기 추출물 분획을 포함하는 조성물을 제공한다.

멜리사엽을 50-100% 알코올로 추출한 후 건조시키고, 상기 에탄올 추출물을 물로 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 분획하여 건조시키고, 상기 에틸아세테이트 분획을 물로 현탁시킨 후 건조시켜 얻은 본 발명의 멜리사엽 추출물 분획은 수용성 물질과 비수용성 물질이 효과적으로 추출되어 다른 추출방법으로 추출한 멜리사엽 추출물에 비해 뛰어난 혈관신생 억제 및 MMP 억제 효능을 보인다. 따라서 본 발명의 멜리사엽 추출물 분획을 포함하는 조성물은 혈관신생 억제 또는 MMP 매개 질환의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

멜리사엽, 추출물 분획, 혈관신생, MMP 억제

Description

멜리사엽 추출물 분획 및 이를 포함하는 조성물{A fraction of Melissa leaf extract and a composition comprising the same}

본 발명은 멜리사엽을 50-100% 알코올로 추출한 후 건조시키고, 상기 에탄올 추출물을 물로 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 분획하여 건조시키고, 상기 에틸아세테이트 분획을 물로 현탁시킨 후 건조시켜 얻은 멜리사엽 추출물 분획 및 상기 추출물 분획을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

멜리사(Melissa officinalis)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 다년생초본으로, 레몬밤(Lemon Balm)이라는 별칭을 갖는다.

멜리사엽 추출물은 플라보노이드(flavonoid)와 트리테르펜산(triterpene acids), 휘발성 오일(volatile oil), 알코올 및 페놀 화합물등의 배당체 및 카페산 유도체를 함유하고 있다. 특히 멜리사엽에 다량 함유된 플라보노이드는 시나로사이드(cynaroside), 코스모신(cosmosin), 람노시트린(rhamnocitrin), 이소쿼르시트린(isoquercitrin) 등이며, 테르펜산으로는 우르솔산(ursolic acid)이 함유되어 있다. 최근에 와서 주목받고 있는 비휘발성 성분의 하나인 로즈마린산(rosmaric acid)과 같은 카페산(caffeic acid) 유도체는 4.7%가 함유되어 있으며, 휘발성 오 일로는 제라니올(geraniol), 네랄(neral), 시트로네랄(citronellal), 유게놀(eugenol)이 함유되어 있다.

멜리사엽 추출물에 함유되어 있는 비휘발성 성분의 하나인 로즈마린산(rosmarinic acid)은 함량이 클뿐만 아니라 소염, 해열의 작용도 강하며, 잎에 포함되어 있는 정유는 약효가 풍부하고, 특히 우울증, 신경성 두통, 기억력 저하, 신경통, 발열 등의 치료에 널리 쓰여왔으며, 그 외에도 진정작용, 항균작용, 항바이러스작용, 항산화작용 및 항호르몬 작용이 있다고 알려져 있었다. 현재 멜리사엽 건조 엑스는 혈액순환개선제 성분으로 사용되고 있다.

혈관신생(Angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아의 발생(embryonic development)시, 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다[Folkman and Cotran, Relation of vascular proliferation to tumor growth, Int Rev Exp Pathol 16, 207 - 248(1976)].

성인의 경우 혈관내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다. 그러나 성인의 혈관신생은 호르몬 신호반응, 염증세포에서의 전혈관신생(pro-angiogenesis) 시토킨의 방출, 세포 외부기질에 고립된 혈관 신생 매개체를 방출하는 가수분해성 효소의 활성 결과로서, 또는 혈관신생촉진 인자의 자극 등으로 필요에 따라 유발되어진다.

혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다. 혈관신생이 일어나기 위해 가장 중요한 과정의 하나는 혈관내피세포를 둘러싸고 있는 혈관 기저막이 효소에 의해 분해되는 과정으로, 이 때 중요한 역할을 하는 효소는 메트릭스 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteinase, 이하 MMP라 한다)에 속하는 효소들이다.

혈관신생이 자율적으로 조절되지 못 하거나 혈관신생에서 중요한 역할을 하는 MMP가 과다하게 활성화됨으로써 병적으로 혈관이 성장하게 되면 다음과 같은 질환이 발생하는 것으로 알려져 있다 (Polverini PJ, Critical Reviews in Oral Biology, 6(3), 1995, 230-247; Arup Das, et al., Progress in Retinal and Eye Research, 22, 2003, 721-748 ; Nick Di Girolamo, et al., IOVS, Vol. 42, No.9, August 2001, 1963-1968; Patricia Lee, et al., Survey of ophthalmology, vol 43, No. 3, Nov-Dec 1998, 245-269; D.B. Holland, et al., British Journal of Dermatology, 150, 2004, 72-81; Anthony H Vagnucci Jr, et al., The Lancet, vol 361, Feb. 15, 2003, 605-608; Berislav V. Zlokovic, Trends in Neuroscience, Vol. 28, No.4, April 2005, 202-208; Jaap G. Neels, et al., The FASEB Journal express article 10. 1096/fj.03-1101fje. Published online April 14, 2004 ; D.L. Crandall, et al., Microcirculation, 4, 1997, 211-232; G. Voros, et al., Endocrinology, 146, 2005, 4545-4554; M.A. Rupnick, et al., PNAS, 99, 2002, 10730-10735; E. Brakenhielm, et al., Circ. Res., 94, 2004, 1579-1588; H.R. Lijnen, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 22, 2002, 374-379; D. Demeulemeester, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 329, 2005, 105-110 등 참조).

암의 성장과 전이;

혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증, 재협착증 등과 같은 심혈관계 질환;

당뇨병성 망막증, 황반 변성(노인 황반변성과 같은 나이와 관련된 황반 변성 포함), 익상편, 망막 변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 각막궤양, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 각막이식 거부 등과 같은 안질환;

비만;

관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, MMP-매개 골감소증, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실 등과 같은 골 질환;

중주신경계의 염증 질환, 염증성 장질환 등과 같은 염증성 질환;

건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환;

알츠하이머 질환;

그 외, 이상 창상 유합, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 신경계의 수초탈락 질 환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 치근막 질환 등이 있다.

특히 암의 경우 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 종양은 신생혈관을 통하여 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급받으며, 또한 종양까지 침투한 신생 혈관들이 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어가는 기회를 줌으로써 암세포가 전이(metastasis)되게 한다[Folkman and Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, 1977, 94-103; Polverini PJ, Critical Reviews in Oral Biology, 6(3), 1995, 230-247].

암 환자가 사망하는 주원인은 전이이며, 현재 임상에서 사용되는 화학요법이나 면역요법들이 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

염증성 질환의 대표적인 질환인 관절염은 자가면역 이상이 원인이지만, 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 혈관이 없는 연골이 파괴된다. 즉, 염증을 유도하는 시토킨의 도움으로 활액세포와 혈관내피세포가 활액강에서 증식을 하여 혈관신생이 진행되면서 연골부에 발생하는 결합조직층인 관절판누스를 형성하여 쿠션 역할을 하는 연골이 파괴된다[Kocb AE, et al., Arth Rheum, 29, 1986, 471-479; Stupack DG, et al., Braz J Med Biol Rcs, 32, 1999, 578-581, Koch AE, Atrhritis Rheum, 41, 1998, 951-962]. 한편, 이러한 관절염 및 관절 외상에서 스트로멜리신이 주요한 효소로 인식 되었으며, 프로콜라 게나제를 활성 콜라게나제로 전환시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다[Murphy, G. et al., Biochem. J., 248, 1987, 265~268]. 따라서, MMP 활성을 억제하면 관절염의 진행을 막을 수 있다.

해마다 전세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 많은 안과질환도 혈관신생이 원인이 되고 있다[Jeffrey MI and Takayuki A, J Clin Invest, 1999, 103, 1231-1236]. 그 대표적인 예로 나이가 들어감에 따라 일어나는 황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장과 신생혈관에 의한 각막 질환과 같은 질병은 혈관신생이 원인이 되는 질병들이다[Adamis AP, et al., Angiogenesis, 3, 1999, 9-14]. 그중 당뇨병성 망막증은 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 질병이다.

콜라게나제, 젤라티나제 및 스트로멜리신은 심장의 세포외 매트릭스의 파괴에 관여한다. 이는 많은 궤양성 눈병에서 나타나는 병적 상태와 시력 상실의 중요한 메커니즘으로 생각된다[Bruns, F.R. et al., Invest. Opthalmol. and Visual Sci., 32, 1989, 1569~1575]. 궤양이 생긴 눈에 존재하는 MMP는 침투성 백혈구 또는 섬유아세포 또는 외재적으로 미생물로부터 유래된다.

붉은 반점과 인설의 피부가 특징인 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데 치유되지 않으며 고통과 기형을 수반한다. 정상인 경우 각질세포가 한달에 한번 증식하는데 비해 건선 환자는 적어도 일주일에 한번 증식한다. 이런 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수 밖에 없다[Folkman J, J Invest Dermatol, 59, 1972, 40-48].

염증매개체의 자극에 의하여 분비된 콜라게나제 및 세균으로부터 분비된 콜라게나제에 의하여 치주조직의 기질인 콜라겐이 분해되어 잇몸 퇴축이 일어나고, 계속 방치하게 되면 치주질환으로 진행하게 된다. 염증을 일으킨 잇몸에서 분리된 섬유아세포에서 콜라게나제 및 스트로멜리신의 활성이 확인되었고, 효소의 수준은 관찰된 치은염의 정도와 상호 연관됨을 관찰하였다[Beeley, N.R.A. et al., supra.; Overall, C.M. et al., J. Periodontal Res. 22, 1987, 81~88].

MMP는 여러가지 중추신경계(CNS)의 발병과 관련이 있어, 염증성의 단핵구 세포를 중추신경으로 유입시켜 마이엘린을 파괴시키거나 혈액뇌 관문(Blood-Brain Barrier)을 파괴시키며 알츠하이머 질환에서는 아밀로이드 베타단백질의 축적에 관여할 것이라고 보고하고 있다 [Yong, VW. et al., Trends Neurosci, 21(2), 1998, 75-80].

뇌척수액에서 젤라티나제 B의 수준은 다발성 경화증 및 기타 신경성 질환과 관련되어 있으며[Beeley, N.R.A. et al., supra.; Miyazaki, K. et al., Nature, 362, 1993, 839~841], 또한 아밀로이드 베타단백질을 분해하여 축적시키는데도 기여한다고 알려져 있다[Backstrom JR, et al., J neurosci, 16(24), 1996, 7910-9].

최근 연구에 의하면 알츠하이머 질환의 뇌에서는 정상의 뇌보다 MMP-1이 많이 증가되어 있어 MMP-1과 함께 전구효소형의 MMP를 활성화시키는 MMP-3도 알츠하이머 질환의 병리학적 상태에서 중요한 역할을 한다고 보고 되고 있다[Leake A, Morris CM, & Whateley J. Neurosci Lett, 291(3), 2000, 201-3; Yoshiyama y, Asahina M,& Hattori T. Acta Neuropathol(berl), 99(2), 2000, 91-5].

MMP의 기저막 분해작용은 암의 침윤과 전이에 있어서 반드시 선행되어야 하는 필수적인 과정으로, MMP가 기저막을 분해하여야 상피세포에 생긴 암세포가 혈관으로 들어가거나 주위의 기질로 침윤할 수 있게 된다. 기저막의 분해는 혈관신생이 일어날때도 공통적으로 중요한 과정이므로, MMP가 과다발현되거나 활성화되면 혈관신생, 암의 침윤과 전이를 촉진시킬 수 있다.

선암종의 경우 침해성 기부측 위세포가 콜라게나제 IV형의 72kDa 형태를 발현시키고[Schwartz, G.K. et al.,Cancer, 73, 1994, 22~27], Ha-ras와 v-myc 종양 유전자 또는 단독 Ha-ras에 의해 형질전환된 래트의 태아 세포는 누드 마우스에서 전이 상태를 유지하고 MMP-9를 방출한다[Bernhard, E.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 91, 1994, 4293~4597]. 따라서, MMP 활성을 억제하면 암세포 전이를 막을 수 있다.

따라서 혈관 신생 억제제나 MMP 활성 억제제를 개발하게 되면 위와 같은 질환을 치료할 수 있게 된다.

이와 관련하여 본 발명자들은 대한민국 등록특허 제 10-550298호에서 사람의 제대혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell : HUVEC)를 이용한 모세혈관과 같은 관구조 형성 억제실험, 마우스 마트리젤 모델과 계태자 융모 요막(CAM) 실험을 이용한 생체내 실험을 통하여 멜리사엽 엑스가 혈관신생억제 효능을 가지고 있음을 밝힌 바 있다.

또한 본 발명자들은 대한민국 등록특허 제 10-473688호에서 멜리사엽 엑스가 혈관신생의 중요한 과정인 혈관내피세포를 둘러싸고 있는 기저막의 분해에 있어 중요한 역할을 하는 MMP의 활성을 억제하는 효능을 가지고 있음을 추가로 밝힌 바 있다.

앞선 연구에 뒤이어 본 발명자들은 혈관신생 억제 및 MMP 활성 억제 효능이 뛰어난 멜리사엽 추출물 분획을 제조하기 위하여 연구를 거듭한 결과 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 혈관신생 억제 및 MMP 활성 억제 효능이 뛰어난 멜리사엽 추출물 분획 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 멜리사엽을 50~100% 알코올로 추출한 후 건조시키고, 상기 알코올 추출물을 물로 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 분획하여 건조시키고, 상기 에틸아세테이트 분획을 물로 재현탁시킨 후 건조시켜 얻은 멜리사엽 추출물 분획을 제공한다.

본 발명의 멜리사엽 추출물 분획의 제조시에는 건조시킨 멜리사엽 또는 건조시키지 않은 멜리사엽 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 효과적인 추출을 위해 멜리사엽은 잘게 부수어 사용할 수 있다.

멜리사엽의 알코올 추출물을 제조하기 위해 멜리사엽의 3 내지 10배의 50~100%의 알코올, 바람직하게는 70~80%의 알코올을 사용하여 통상적인 추출방법에 따라 추출할 수 있다.

상기 알코올은 에탄올, 메탄올 등을 포함한 C1-C6 알코올을 말하며, 바람직하게는 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 멜리사엽의 75% 에탄올 추출물을 물에 현탁한 후에 에틸아세테이트로 분획, 건조하고 잔류용매를 제거하기 위해서 물에 재현탁하여 동결건조시키는 방법으로 멜리사엽 추출물 분획(이하 실시예에서는 'ALS-L1023'이라 한다)을 제조하였다.

상기 방법은 50~100%의 알코올을 사용함으로써 수용성 물질과 비수용성 물질을 효과적으로 추출하고, 에틸아세테이트에서의 용해는 물에 대한 용해도는 낮으나 높은 비수용성 물질을 추출하기 위함이다.

수율과 잔류 용매의 독성 여부, 지표성분의 상대적 함량 등을 고려하여 에틸아세테이트를 멜리사엽의 이차 추출용매로 선택한다.

혈관신생 억제 활성이 우수한 멜리사엽 추출물의 대량 생산을 위해 멜리사엽의 50~100%의 알코올 추출물을 물에 현탁한 후에 에틸아세테이트로 분획, 건조시키고, 다시 잔류용매를 제거하기 위해서 물에 재현탁한 후 동결건조 또는 열풍 건조시키는 방법으로 멜리사엽 추출물 분획(이하 실시예에서는 'ALS-L1023'이라 한다)을 대량으로 제조할 수 있으며, 이렇게 얻어진 ALS-L1023을 동물실험 및 전임상 실험에 이용한다.

본 발명의 멜리사엽 추출물 분획에 대해 MMP 억제 효과 실험, HUVEC 관형성 억제 실험, 마우스 마트리젤 실험 등을 통해 혈관신생 억제 효과를 확인하고, 또한 지방조직 및 지방세포 감소 효과 등의 비만 억제 효과를 확인하여 본 발명의 추출물 분획의 혈관신생 억제제 또는 MMP 억제제로서의 효능이 다른 용매에 의한 추출물에 비해 월등함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 멜리사엽 추출물 분획은 혈관신생 관련 질환 또는 MMP 매개 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물의 유효 성분으로 포함될 수 있다.

그러므로 본 발명은 상기 멜리사엽 추출물 분획을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 혈관신생 관련 질환 또는 MMP 매개 질환으로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 암의 성장과 전이; 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증, 재협착증 등과 같은 심혈관계 질환; 당뇨병성 망막증, 황반 변성(나이관련 황반변성 포함), 익상편, 망막 변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 각막궤양, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양 또는 각막이식 거부 등과 같은 안질환; 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, MMP-매개 골감소증, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실 등과 같은 골 질환; 중주신경계의 염증 질환, 염증성 장질환 등과 같은 염증성 질환; 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환; 알츠하이머 질환; 이상 창상 유합, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신 사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 치근막 질환 등을 포함한다.

상기 조성물은 본 발명의 멜리사엽 추출물 분획 뿐만 아니라 기존에 공지된 혈관신생 억제제 또는 MMP 활성 억제제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 멜리사엽 추출물 분획을 포함하는 혈관신생 관련 질환 또는 MMP 매개 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물은 약제학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 멜리사엽 추출물 분획을 유효 성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 멜리사엽 추출물 분획을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 멜리사엽 추출물 분획을 유효 성분으로 함유하는 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 멜리사엽 추출물 분획을 포함하는 혈관신생 관련 질환 또는 MMP 매개 질환의 예방 또는 치료를 위한 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 육류, 음료수, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명은 혈관신생 관련 질환 또는 MMP 매개 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 상기 멜리사엽 추출물 분획을 유효 성분으로 함유하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 멜리사엽 추출물 분획을 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 혈관신생 관련 질환 또는 MMP 매개 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 멜리사엽 추출물 분획을 투여하는 것을 포함하는 MMP 매개 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 멜리사엽 추출물 분획을 1일 1회 내지 수회 투여시, 3㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 멜리사엽 추출물 분획을 유효성분으로 함유하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 멜리사엽 추출물 분획은 수용성 물질과 비수용성 물질이 효과적으로 추출되어 다른 추출방법으로 추출한 멜리사엽 추출물에 비해 뛰어난 혈관신생 억제 및 MMP 억제 효능를 보인다. 따라서 본 발명의 멜리사엽 추출물 분획을 포함하는 조성물은 혈관신생 억제 또는 MMP 매개 질환의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

[실시예]

실시예 1. 멜리사엽 추출물의 제조

혈관신생 억제 효능이 우수한 멜리사엽 추출물을 제조하기 위하여, 우선 증류수, 50% 에탄올, 75% 에탄올, 100% 에탄올 및 메탄올을 각각의 추출 용매로 사용하여 건조된 멜리사엽의 추출물을 제조하고, 각각의 추출물에 대하여 혈관억제 효능을 50㎍/㎖의 농도에서 HUVEC 관형성 억제실험으로 비교해 보았다. 그 결과, 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 50, 75, 100% 에탄올, 100% 메탄올 추출물 모두 HUVEC 관형성 억제 효과가 있었으며, 그 중 75% 에탄올 추출물이 상대적으로 좋은 혈관신생 억제활성을 나타내어 75% 에탄올을 멜리사엽의 일차 추출용매로 선택하였다.

[표 1] 멜리사엽 추출물의 관형성 억제 효과

시료	HUVEC 관형성 억제
대조군	-
수침	+
50% 에탄올	(+)
75% 에탄올	+(+)
100% 에탄올	+
100% 메탄올	+(+)

+++; 관형성이 안됨, ++; 관이 가늘어져 많이 끊김

+; 관이 가늘어지거나 끊겨짐 +/-; 거의 대조군과 비슷, -; 관형성이 됨

보다 우수한 혈관신생 억제 효능을 나타내는 멜리사엽 추출물 분획을 제조하기 위해 상기 75% 에탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후에 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올의 순서로 추출, 분획하였다. 건조 분획물에 대하여 50㎍/㎖의 농도에서 HUVEC 관형성 실험을 수행한 결과, 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 혈관신생 억제활성을 나타내었다.

[표 2] 분획물의 관형성 억제 효과

시료	HUVEC 관형성 억제
대조군	-
75% 에탄올	+(+)
헥산 분획물	+/-
에틸아세테이트 분획물	++(+)
부탄올 분획물	+

상기 실험 결과에 근거하여 혈관신생 억제 활성이 우수한 멜리사엽 추출분획의 대량 생산을 위해 멜리사엽의 75% 알코올 추출물을 물에 현탁한 후에 에틸아세테이트로 분획, 건조하고 잔류용매를 제거하기 위해서 물에 재현탁하여 동결건조시키는 방법으로 멜리사엽 추출물 분획(이하 실시예에서는 'ALS-L1023'이라 한다)을 대량으로 제조하였으며, 이렇게 얻어진 ALS-L1023을 동물실험 및 전임상 실험에 이용하였다.

'ALS-L1023'의 구체적인 대량 생산 방법은 다음과 같다:

건조 멜리사엽 100kg에 75% 에탄올 350L를 투입하여 83℃에서 4시간동안 2회 추출하였다. 10um 필터를 통하여 여과한 후 30L까지 감압농축하고 여기에 40L 씩 두 번의 에틸아세테이트를 투입한 후 분획하였다. 분획물을 정제수로 세척하고 분리한 후 15L까지 감압농축하고 45℃에서 열풍 건조하여 최종적으로 5kg의 ALS-L1023을 제조하였다.

실시예 2. ALS-L1023의 생화학적 효력 실험

(1) MMP 억제 효과의 확인

대량 제법에 의해서 제조된 ALS-L1023의 혈관신생 억제 효력을 측정하기 위해서 혈관신생 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 MMP(matrix metalloproteinase) 효소에 대한 활성 억제 효능을 측정하였다.

MMP 효소 활성은 형광강도계(spectrofluorometer)를 이용하여 측정하였다. 실험에 사용한 인간 MMP 효소는 (주)안지오랩에서 배쿨로바이러스 시스템을 이용하여 곤충세포에서 유전공학적으로 제조한 효소를 사용하였으며, MMP-2와 MMP-9의 기질로는 Calbiochem사에서 판매하는 MMP-2/MMP-9 형광기질을 사용하였다. MMP 효소와 기질을 함유한 반응액에 ALS-L1023을 농도별로 첨가하여 형광도 변화를 측정한 결과 ALS-L1023은 MMP-2 및 MMP-9에 대해서 각각 17.7±1.0㎍/㎖과 12.3±1.4㎍/㎖의 IC₅₀를 나타내었다.

멜리사엽의 75% 에탄올 추출물은 MMP-2 및 MMP-9에 대해서 각각 33.6±1.5㎍/㎖과 26.0±1.7㎍/㎖의 IC₅₀를 나타내어 ALS-L1023이 멜리사엽의 75% 에탄올 추출물보다 상대적으로 MMP 억제 활성이 더 높아진 것을 확인하였다 (도 1).

(2) HUVEC 관형성 억제 효과

혈관신생을 측정하는 in vitro 실험 중에서 in vivo 상태와 가장 상관성이 높다고 알려져 있는 HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) 관형성 억제 실험을 통하여 ALS-L1023의 효능을 측정하였다.

우선 사람의 탯줄 정맥에서 혈관내피세포(HUVEC)를 일차 배양한 후에 Factor VIII의 항체를 이용하여 HUVEC이 성공적으로 분리되었음을 확인하고, 5번 이내 계대 배양한 HUVEC을 기저막 성분인 Matrigel 위에서 배양하여 HUVEC의 이동과 분화를 통한 관형성을 유도하였다.

대량제법에 의해서 제조된 ALS-L1023은 50㎍/㎖의 농도에서 관형성을 억제하여 대조군에서 관찰되는 망상의 관구조 연결이 끊어진 것을 확인할 수 있었으며(도 2), 또한 표 3에서 보는 바와 같이 HUVEC의 관형성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다.

[표 3] ALS-L1023의 농도에 따른 관형성 억제효과

시료	HUVEC 관형성 억제
100 ㎍/㎖	++
50 ㎍/㎖	++
25 ㎍/㎖	+

(3) 세포독성 시험

ALS-L1023의 세포독성을 측정하기 위하여 HUVEC을 96웰 플레이트에 한 웰 당 5,000-10,000개의 세포가 들어가도록 플레이팅한 후에 ALS-L1023을 처리하고 XTT tetrazolium 염 (sodium 3'-[1-(phenylamino-carbony)-3,4-tetrazolium]-bis[4-methoxy-6-nitro]benzene sulfonic acid hydrate) 세포증식 실험 키트 (Roche 사)를 이용하여 세포 독성 실험을 하여 살아남은 세포수를 ELISA 플레이트 리더로 측 정하였다. HUVEC 관형성을 억제하는 농도인 50㎍/㎖에서 ALS-L1023은 세포 생존에 영향을 미치지 않아 혈관신생억제 효능을 나타내는 농도에서 세포독성이 없음을 확인하였다.

(4) 마우스 마트리젤 실험 (Mouse Matrigel assay)

ALS-L1023의 생체내 혈관신생 억제 효능을 정량적으로 측정하기 위해서 마우스 마트리젤 실험을 수행하였다.

50ng/㎖의 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)와 50 unit/㎖의 헤파린을 함유한 마트리젤 0.4㎖를 C57BL/6 마우스에 피하주사하고, 대조군은 10% 에탄올을, 처치군은 10% 에탄올에 녹인 ALS-L1023을 주사일로부터 마리당 1회 0.5mg씩 1일 2회, 4일 동안 총 8회 경구투여 하였다. 5일후 표피를 제거하여 마트리젤을 회수한 후에 혈액에서 총 헤모글로빈 양을 측정하는 Drabkin's reagent (Sigma)를 이용하여 헤모글로빈 양을 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이 ALS-L1023을 경구투여 하였을 때 대조군에 비해서 헤모글로빈 수치가 감소하였으며, ALS-L1023에 의해서 혈관신생이 33% 정도 억제되었다.

[제제예]

ALS-L1023에 적절한 부형제를 가하여 안정성을 높인 후 경질캡슐에 250mg씩 충진하였으며, 그 배합비율은 표 4와 같다.

[표 4] ALS-L1023의 제제화 비율

원료명	배합비율(%)
ALS-L1023	60
스테아린산마그네슘	1
경질무수규산	1
미결정셀룰로스	33
라우릴황산나트륨	5

실시예 3. ALS-L1023의 비만억제 효과

고지방식이에 의해 유발되는 비만에 있어서 ALS-L1023의 복부지방 억제 효과를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 45 kcal% 고지방 사료 (미국 리서치 다이어트 사 제조)에 ALS-L1023이 유효성분으로 0(대조군), 0.1%(저), 0.25%(중), 0.5%(고) (부형제를 포함한 제제화된 ALS-L1023으로서 0, 0.17, 0.42, 0.83%) 함량이 되도록 혼합하였고, ALS-L1023의 유효성분이 없는 대조군에는 제제화된 ALS-L1023에 함유된 부형제가 고용량과 같은 비율인 0.33%가 함유되도록 사료에 혼합한 후 1주간 순화시킨 7주령 수컷 SD 랫드에 그룹당 7마리로 나누어 12주간 급이한 후 체중, 복부지방의 무게, 혈액 생화학적 검사, 간 및 지방조직의 병리조직학적 검사를 실시하였다.

(1) 체중

체중은 동물입수일, 투여개시일, 투여개시 후 매주 1회, 부검일에 측정한 결과 표 5에 정리한 바와 같이 부형제대조군은 투여개시 전 평균 204.73 ± 5.57 g에서 12주간 부형제가 혼합된 지방사료를 급이하였을 때에 평균 633.63 ± 43.08 g으 로 꾸준히 증가하였다. ALS-L1023은 저, 중 및 고용량군은 투여개시 전 평균 210.10 ± 5.19 g, 204.97 ± 6.61 g 및 208.01 ± 7.65 g에서 12주간 시험물질이 혼합된 지방사료를 급이 하였을 때에 623.72 ± 58.02 g, 588.69 ± 33.76 g 및 584.83 ± 33.44 g 으로 꾸준히 증가하였으나 용량 의존적으로 감소하는 양상이 관찰되었다.

[표 5] ALS-L1023 투여에 의한 체중 변화

ALS-L1023 용량 (%)	0 (대조군)	0.1 (저용량군)	0.25 (중용량군)	0.5 (고용량군)
투여 전 무게(g)	204.73 ± 5.57	210.10 ± 5.19	204.97 ± 6.61	208.01 ± 7.65
투여 후 무게(g)	633.63 ± 43.08	623.72 ± 58.02	588.69 ± 33.76	584.83 ± 33.44

(2) 사료섭취량

사료섭취량은 급이기에 분말사료를 채운 무게를 측정하고 실험동물에 급이 한 다음 24시간 후에 다시 급이기의 무게를 측정하여 그 차이를 1일 사료섭취량으로 하며 투여개시 때 및 개시 후 매주 1회 측정하였다.

부형제대조군의 일일 사료섭취량은 12주간 평균 18.46 ~ 22.73 g 범위였으며 시험물질의 저, 중 및 고용량군은 평균 17.14 ~ 21.84 g, 17.29 ~ 22.03 g 및 16.99 ~ 20.84 g의 범위로 부형제대조군과 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

(3) 장기 및 지방조직 무게

실험동물을 부검 및 채혈 전에 18시간 이상 절식시켰으며 Ether로 마취하여 채혈한 후 방혈시켰다. 복강내 장사이에 있는 장간막 지방조직(mesenteric adipose tissue), 부고환 지방조직(epididymal adipose tissue)및 신장후 복막하 지방조직(retro-peritoneal adipose tissue)을 적출하여 무게를 측정하고 간, 심장, 신장, 비장, 및 췌장의 무게도 측정하였다.

그 결과 심장, 간, 췌장, 신장(좌, 우) 및 비장의 무게는 부형제대조군에 비하여 시험물질 투여군은 유의한 차이를 나타내지 않았다. 장간막 지방조직의 무게는 부형제대조군 15.16 ± 4.41 g 에 비하여 시험물질의 저, 중 및 고용량군에서 15.90 ± 4.36 g, 12.64 ± 1.69 g 및 11.23 ± 3.32 g 으로 용량 의존적으로 감소하였다. 부고환 지방조직의 무게는 부형제대조군 20.80 ± 4.41 g에 비하여 시험물질의 저, 중 및 고용량군에서 17.74 ± 3.37 g, 16.29 ± 2.62 g 및 15.67 ± 3.83 g로 용량 의존적으로 감소하였고 고용량군에서 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)가 관찰되었다. 신장후 복막하 지방조직의 무게는 부형제대조군 29.73 ± 3.23 g에 비하여 시험물질의 저, 중 및 고용량군에서 27.20 ± 5.76 g, 21.36 ± 4.03 g 및 23.94 ± 6.24 g로 감소하였고 중용량군에서 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)가 관찰되었다. 장간막 지방조직, 부고환 지방조직 및 신장후 복막하 지방조직의 무게를 합한 총 복부지방 조직 무게는 부형제대조군 65.69 ± 10.13 g에 비하여 시험물질의 저, 중 및 고용량군에서 60.84 ± 11.66 g, 50.29 ± 7.31 g 및 50.84 ± 11.84 g로 감소하였고 중용량군 및 고용량군에서 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)가 관찰되었다 (표 6 참조).

[표 6] ALS-L1023 투여에 의한 장기 및 지방조직 무게 변화

ALS-L1023 용량 (%)	0 (대조군)	0.1 (저용량군)	0.25 (중용량군)	0.5 (고용량군)
장간막 지방조직 무게(g)	15.16 ± 4.41	15.90 ± 4.36	12.64 ± 1.69	11.23 ± 3.32
부고환 지방조직 무게(g)	20.80 ± 4.41	17.74 ± 3.37	16.29 ± 2.62	15.67 ± 3.83^**
신장후 복막하 지방조직 무게(g)	29.73 ± 3.23	27.20 ± 5.76	21.36 ± 4.03^**	23.94 ± 6.24
총 복부지방 조직 무게(g)	65.69 ± 10.13	60.84 ± 11.66	50.29 ± 7.31^**	50.84 ± 11.84^**

^** : p<0.05

(4) 혈액생화학적 검사

혈액생화학적 검사에서 간의 지표가 되는 AST, ALT, ALP는 군간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 혈중 총 콜레스테롤(total cholesterol)은 부형제 대조군의 102.09 ± 21.82 mg/dL에 비하여 저용량, 중용량 및 고용량에서 88.07 ± 14.35 mg/dL, 86.96 ± 17.68 mg/dL 및 79.90 ± 10.45 mg/dL로 용량 의존적으로 낮아지는 경향을 나타내었다. 트리글리세라이드(Triglyceride)역시 부형제 대조군의 58.13 ± 25.04 mg/dL에 비하여 저용량, 중용량 및 고용량에서 50.93 ± 15.28 mg/dL, 46.63 ± 11.77 mg/dL 및 45.50 ± 22.45 mg/dL로 용량 의존적으로 낮아지는 경향을 나타내었다. 혈중 LDL은 부형제 대조군의 12.31 ± 3.70 mg/dL에 비하여 저용량, 중용량 및 고용량에서 9.56 ± 2.67 mg/dL, 9.11 ± 2.92 mg/dL 및 8.56 ± 2.26 mg/dL로 용량 의존적으로 낮아지는 경향을 나타냈다. 그 외의 혈중 글루코스(glucose), 총 단백질(total protein), 및 알부민(albumin)에서는 군 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 따라서 ALS-L1023 투여에 의해 혈중 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, LDL은 부형제대조군에 비하여 용량 의존적으로 낮아지는 경향을 나타내었다 (표 7 참조).

[표 7] ALS-L1023 투여에 의한 혈액 지표의 변화

ALS-L1023 용량 (%)	0 (대조군)	0.1 (저용량군)	0.25 (중용량군)	0.5 (고용량군)
총 콜레스테롤 (mg/dL)	102.09 ± 21.82	88.07 ± 14.35	86.96 ± 17.68	79.90 ± 10.45
트리글리세라이드 (mg/dL)	58.13 ± 25.04	50.93 ± 15.28	46.63 ± 11.77	45.50 ± 22.45
혈중 LDL (mg/dL)	12.31 ± 3.70	9.56 ± 2.67	9.11 ± 2.92	8.56 ± 2.26

(5) 간의 조직 병리학적 검사

간의 무게를 측정 한 후 10% 중성포르말린 용액에 고정하여 일반적인 병리조직 제작과정을 거쳐 조직슬라이드 표본을 만들고 이를 H&E 염색한 후 검경하여 간의 지방간화 등을 관찰한 결과 부형제대조군에서는 간소엽내에 과다한 지방구들이 간세포내에 침착된 형태인 간지방증 소견이 관찰되었다. 주로 microvesicular 또는 macrovesicular 형태의 간세포 지방변성이 간문맥 중심성으로 나타났다. 간지방증의 진행시 나타나는 염증세포의 침윤은 주로 간세포 지방변성이 일어난 balloon된 간세포사이나 주위에서 나타났으며 중등도 이하의 소견에서는 주로 간중심 정맥주위에 침윤되어 나타났다. 다른 특이적 소견은 관찰되지 않았다.

저용량군에서는 부형제대조군과 비슷한 정도의 간지방증이 관찰되었으나 중용량군에서는 부형제대조군이나 저용량군 보다는 간지방증 및 염증세포의 침윤이 약간 감소되어 나타나는 것을 관찰 할 수 있었다.

고용량군은 중용량군과 비슷한 양상으로 간지방증이 억제되거나 염증세포의 침윤이 감소되어지는 것을 관찰 할 수 있었다 (도 4 참조). 이는 ALS-L1023의 영향에 의해 감소되어지는 것으로 판단되어 진다.

(6) 지방조직의 지방세포 면적

적출한 신장 후 복막하 지방조직의 무게를 측정한 후 일반적인 병리조직 제작과정을 거쳐 파라핀 조직절편을 만들어 H&E 염색하였다. 광학현미경과 연결된 stereo investigator software (MicroBrigthField, VT, USA)를 사용하여 무작위로 5군데를 선정하여 각각의 인접한 10개의 지방세포면적을 평균한 값을 개체의 지방세포의 면적으로 계산한 결과 도 5에서 보는 바와 같이 부형제대조군에 비하여 중용량과 고용량군에서 지방세포면적이 감소하는 경향을 나타내었으며 고용량군에서는 통계적으로 유의한 차이(p<0.05)가 관찰되었다.

따라서 이상의 결과로 볼 때 ALS-L1023은 고지방 식이로 유도된 비만 랫드에 12주간 급이 하였을 때에 비만과 관련된 복부지방조직 무게, 혈액 중 콜레스테롤, 트리글리세라이드 등을 낮추고, 간조직의 지방증을 완화시키며, 지방세포의 크기를 감소시키는 작용을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 4. ALS-L1023의 혈관신생 관련 안과질환에서의 효과

ALS-L1023이 망막 혈관신생 억제 효과가 있는지 확인하기위하여 동물모델로 미숙아 망막증 (ROP; retinopathy of prematurity)이 유발된 마우스에 ALS-L1023을 DMSO에 녹여 멸균증류수로 희석한 후 생후 13일부터 5일간 25 mg/kg용량으로 복강주사하였다.

그 결과, 정상 망막은 혈관이 촘촘하고 균일하게 분포하여 있는데 비해 ROP 대조군의 망막은 전반에 걸쳐서 출혈 부위가 관찰되었으며, 많은 수의 비정상적인 혈관이 관찰되었으나, ALS-L1023 투여군은 망막 중심부 및 중심부 주변에서 뚜렷한 혈관 형성 억제가 관찰되었으며, 비정상적인 혈관 형성도 ROP 대조군에 비해 적은 수가 관찰되었다. 따라서 ALS-L1023은 망막병증의 예방 및 치료에 효과가 있을 것으로 기대된다.

실시예 5. ALS-L1023 복용에 따른 황반변성 진행 억제 효과

습성 나이관련황반변성으로 진단받은 남자환자가 제제화된 ALS-L1023 캡슐을 1일 3회, 1회 2캡슐씩 12주간 경구복용 하였으며, 복용 후 환자의 황반부위를 사진 촬영하여 변성부위의 크기 변화를 복용전 사진과 비교한 결과, 도 6과 같이 변성부위의 크기가 더 이상 진행하지 못하고 있음을 확인하였다. 따라서 ALS-L1023은 나이관련 황반변성의 예방 및 치료에 효과가 있을 것으로 기대된다.

[실험예] ALS-L1023의 안전성 확인

시험물질인 ALS-L1023이 분리된 멜리사엽은 이미 사람에게 오랫동안 식용 및 약용으로 사용되어 왔으며 미국 FDA에 의해 GRAS(generally regarded as safe)로 분류되었기 때문에 시험물질은 일반적으로 독성이 없을 것으로 사료되며 이 연구는 ALS-L1023 2000m/kg을 단회투여 하였을 경우의 급성독성의 limit test로써 시험하였으며 실험의 전체과정은 OECD 가이드라인에 따라 수행하였다.

10마리의 수컷쥐(랫드)와 10마리의 암컷쥐를 각각 대조군 5마리와 시험군 5마리로 무작위 분류하였으며 대조군은 1ml/150g 체중의 옥수수유(corn oil)를 투여하였고, 시험군은 ALS-L1023을 옥수수유에 녹여 2000mg/kg을 투여하였다. ALS-L1023 시험물질은 물에 녹지 않아 옥수수유에 현탁하여 제조하였으며 시험물질은 투여하는 날 제조되었고 투여 직전 볼텍싱하여 현탁시켰다.

투여방법은 처음 1마리를 경구투여 하여 24시간 관찰하였고 그 다음 2마리를 경구투여 하여 72시간을 관찰한 후 나머지 17마리에 경구투여 하였다. 투여한 후 30분간 독성소견이 나타나는지를 관찰하였으며 그 후 4시간동안은 30분마다 관찰하였다. 그 이후 14일 동안 하루에 2번씩 관찰하였으며 체중과 체온은 매일 체크하였다.

시험 마지막 날에 CO₂를 이용하여 시험동물을 안락사시켜 부검하였으며 병리학자에 의해 육안으로 이상이 관찰된 몇몇 조직은 제거하여 조직학적 검사를 시행하였다.

그 결과, ALS-L1023을 5마리의 수컷 쥐와 암컷 쥐에 각각 2000mg/kg으로 단회투여 하였을 경우 14일간의 관찰기간동안 중요한 독성증상이 관찰되지 않았다.

시험군과 대조군 모두에서 특이한 임상적 이상이 발견되지 않았으나 1마리의 암컷쥐에서 투여 60분후 약간의 흥분상태가 나타났으나 투여 90분후에는 안정상태 를 유지하였다.

또한, 시험군과 대조군 모두에서 ALS-L1023을 투여한 결과 체중과 체온에 영향이 없었다 (도 7 및 도 8).

전체 체중에 대한 흉선, 심장, 이자, 신장, 간, 뇌의 상대적인 무게 백분율은 도 9에 나타내었다. ALS-L1023을 투여한 암컷 쥐에 비해 대조군 암컷에서 미세하지만 통계적으로 유의하게 간의 무게가 증가되었으나 수컷 쥐에서는 그러한 현상이 발견되지 않았고 부검결과도 이상이 없음으로 나타났으며, 그 외에는 특이 사항은 없었다.

또한, 육안 검시 결과 몇몇 이상 현상이 발견되었으나 조직학적 검사결과는 모두 정상으로 판정되었다.

이상 살펴본 바와 같이, ALS-L1023의 2000mg/kg의 단회투여독성시험 결과 전혀 독성을 나타내지 않았다.

도 1은 ALS-L1023의 MMP 효소 억제 효능을 보여주는 그래프이다.

도 2는 ALS-L1023의 HUVEC 관형성 억제 효능을 보여주는 사진이다.

도 3은 마우스 마트리젤 실험을 통해 확인한 ALS-L1023의 혈관신생 억제 효능을 보여주는 그래프이다.

도 4는 고지방 식이로 유도된 비만 랫드에서 부형제대조군에 비하여 ALS-L1023 고용량군은 간지방증과 염증세포의 침윤이 감소되는 것을 보여주는 사진이다.

도 5는 고지방 식이로 유도된 비만 랫드에서 부형제대조군에 비하여 ALS-L1023 중용량군과 고용량군에서 지방세포면적이 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 6은 ALS-L1023의 경구투여를 통한 습성 나이관련 황반변성 환자의 변성부위의 진행을 억제하는 효과를 보여주는 사진이다.

도 7은 ALS-L1023 2000mg/kg의 단회투여 독성시험에 따른 쥐의 체중 변화를 보여주는 그래프이다.

도 8은 ALS-L1023 2000mg/kg의 단회투여 독성시험에 따른 쥐의 체온 변화를 나타내는 그래프이다.

도 9는 ALS-L1023 2000mg/kg의 단회투여 독성시험에 따른 쥐의 전체 체중에 대한 각 기관의 상대적인 무게 백분율 변화를 나타내는 그래프이다.

Claims

멜리사엽을 50~100% 에탄올 또는 메탄올로 추출한 후 건조시키고, 상기 알코올 추출물을 물로 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 분획하여 건조시키고, 상기 에틸아세테이트 분획을 물로 재현탁시킨 후 건조시켜 얻은 멜리사엽 추출물 분획을 포함하는 혈관신생관련 질환 또는 MMP(Matrix metalloproteinase)매개질환의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 알코올이 70~80% 에탄올 또는 메탄올인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 비만인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 당뇨병성 망막증, 황반 변성(나이관련 황반변성 포함), 익상편, 망막 변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 각막궤양, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양 또는 각막이식 거부인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 암의 성장 또는 암 전이인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증 또는 재협착증인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, MMP-매개 골감소증 또는 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 중주신경계의 염증 질환 또는 염증성 장질환인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 또는 여드름인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 알츠하이머 질환인 조성물.
제1항에 있어서, 혈관신생관련 질환 또는 MMP 매개질환이 이상 창상 유합, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열 또는 치근막 질환인 조성물.