KR20140011209A

KR20140011209A - 멜리사엽 추출물을 포함하는 혈관신생 또는 ｍｍｐ 활성 매개 질환의 예방 또는 치료용 정제

Info

Publication number: KR20140011209A
Application number: KR1020120078349A
Authority: KR
Inventors: 윤은진; 김경수; 김용일; 박재현; 우종수
Original assignee: 한미약품 주식회사
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2014-01-28
Also published as: WO2014014271A1; CN104470507A

Abstract

본 발명은 로즈마린산, 카페인산 및 루틴을 주요 활성성분으로 하는 멜리사엽 추출물을 포함하는 혈관신생 또는 매트릭스 메탈로프로테미나제(Matrix metalloproteinase, MMP) 활성 매개 질환의 예방 또는 치료용 정제에 관한 것으로, 상기 정제는 로즈마린산 또는 카페인산의 용출률이 30분 내에 80% 이상으로 용출 속도가 우수하고, 가속 조건에서도 안정하여 혈관신생 또는 MMP 활성 매개 질환, 특히 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

멜리사엽 추출물을 포함하는 혈관신생 또는 ＭＭＰ 활성 매개 질환의 예방 또는 치료용 정제{TABLET COMPRISING MELISSA OFFICINALIS EXTRACTS FOR PREVENTING OR TREATING ANGIOGENESIS OR MMP ACTIVITY MEDIATED DISEASE}

본 발명은 로즈마린산, 카페인산 및 루틴을 주요 활성성분으로 하는 멜리사엽 추출물을 포함하는 혈관신생 또는 매트릭스 메탈로프로테미나제(Matrix metalloproteinase, MMP) 활성 매개 질환의 예방 또는 치료용 정제에 관한 것이다.

멜리사(Melissa officinalis)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 다년생 초본으로, 레몬밤(Lemon Balm)이라는 별칭을 갖는다.

멜리사엽 추출물(Melissa Extract)은 플라보노이드(flavonoid)와 테르펜산(terpene acids), 휘발성 오일(volatile oil), 알콜 및 페놀 화합물 등의 배당체 및 카페인산 유도체를 함유하고 있다. 특히 멜리사엽에 다량 함유된 플라보노이드는 시나로사이드(cynaroside), 코스모신(cosmosin), 람노시트린(rhamnocitrin), 이소쿼르시트린(isoquercitrin) 등이 있으며, 테르펜산으로는 우르솔산(ursolic acid)이 함유되어 있다. 또한 비휘발성 성분으로는 로즈마린산(rosmarinic acid)이 있고, 카페인산(caffeic acid) 유도체는 약 4.7%를 함유하며, 휘발성 오일로는 제라니올(geraniol), 네랄(neral), 시트로네랄(citronellal), 유게놀(eugenol)이 함유되어 있다. 이외에도, 멜리사엽 추출물에는 폴리페놀의 일종인 쿠마린산(coumaric acid) 및 약한 방향성을 띠는 신남산(cinnamic acid) 등이 포함되어 있다.

멜리사엽 엑스에 포함된 주요 약리 성분의 역할을 설명하면 다음과 같다.

로즈마린산은 소염해열의 작용이 강하며, 잎에 포함되어 있는 정유는 특히 우울증, 신경성 두통, 기억력 저하, 신경통, 발열 등의 병에 널리 쓰여 왔다. 그 이외에도 진정작용, 항균작용, 항바이러스 작용 및 항호르몬 작용이 있다고 알려져 있다. 현재 로즈마린산을 다량 포함하는 것으로 알려진 멜리사엽 건조 엑스는 혈액순환 개선제 성분으로 사용되고 있다.

카페인산은 커피를 비롯해 과일, 채소, 허브 등의 식물에 포함되어 있다. 발암억제제로서 작용하고, 생체 안과 밖에서 우수한 항산화제로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 카페인산의 흡수는 클로로젠산(chlorogenic acid) 형태에서 퀸산(quinic acid)으로 에스터화될 때 제한되며, 많은 양의 카페인산을 구강 투여한 쥐에서는 위장 유두종을 유발시켰으며, 카페인산을 발암물질로서 인식하였다. 항산화제와 혼합하여 많은 양을 복용하였을 때는 결장종양의 성장을 줄이는 것으로 나타났다.

루틴은 플라보놀 배당체물질로 천연에 널리 분포하고 있다. 주요한 생리활성은 모세혈관 수축작용인데, 예전부터 지혈제로 사용하여 왔지만 그 작용은 그다지 강력하지 않고 일과성이다. 또한, 모세혈관을 강화시키는 작용이 있고, 뇌출혈, 방사선 장애, 출혈성 질병 등을 예방 또는 치료하는 데 사용할 수 있다.

한편, 혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아의 발생시, 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절된다.

성인의 경우 혈관 내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다. 그러나 성인의 혈관신생은 호르몬 신호반응, 염증 세포에서의 전혈관신생(pro-angiogenesis) 사이토카인의 방출, 세포 외부기질에 고립된 혈관 신생 매개체를 방출하는 가수분해성 효소의 활성에 따른 결과로서, 또는 혈관신생촉진 인자의 자극 등에 의해 필요에 따라 유발된다. 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어 진다. 혈관신생이 일어나기 위해 가장 중요한 과정의 하나는 혈관내피세포를 둘러싸고 있는 혈관 기저막이 효소에 의해 분해되는 과정으로, 이때 중요한 역할을 하는 효소는 매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix metalloproteinase, MMP)에 속하는 효소들이다.

혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하거나 혈관신생에서 중요한 역할을 하는 MMP가 과다하게 활성화됨으로써 병적으로 혈관이 성장하게 되면 다양한 질환, 예를 들면, 암의 성장과 전이; 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증, 재협착증 등과 같은 심혈관계 질환; 당뇨병성 망막증, 황반 변성(노인 황반변성과 같은 노화와 관련된 황반 변성 포함), 익상편, 망막 변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 각막궤양, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 각막이식 거부 등과 같은 안질환; 비만 등이 발생하는 것으로 알려져 있다(Polverini PJ, Critical Reviews in Oral Biology, 6(3), 1995, 230-247; Arup Das, et al., Progress in Retinal and Eye Research, 22, 2003, 721-748; Nick Di Girolamo, et al., IOVS, Vol. 42, No.9, August 2001, 1963-1968; Patricia Lee, et al., Survey of ophthalmology, vol 43, No. 3, Nov-Dec 1998, 245-269; D.B. Holland, et al., British Journal of Dermatology, 150, 2004, 72-81; Anthony H Vagnucci Jr, et al., The Lancet, vol 361, Feb. 15, 2003, 605-608; Berislav V. Zlokovic, Trends in Neuroscience, Vol. 28, No.4, April 2005, 202-208; Jaap G. Neels, et al., The FASEB Journal express article 10. 1096/fj.03-1101fje. Published online April 14, 2004; D.L. Crandall, et al., Microcirculation, 4, 1997, 211-232; G. Voros, et al., Endocrinology, 146, 2005, 4545-4554; M.A. Rupnick, et al., PNAS, 99, 2002, 10730-10735; E. Brakenhielm, et al., Circ. Res., 94, 2004, 1579-1588; H.R. Lijnen, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 22, 2002, 374-379; 및 D. Demeulemeester, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 329, 2005, 105-110 참조).

따라서 혈관 신생 억제제나 MMP 활성 억제제를 개발하게 되면 위와 같은 질환을 치료할 수 있게 된다.

이와 관련하여, 대한민국 특허등록 제10-550298호에서는 사람의 제대혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)를 이용한 모세혈관과 같은 관구조 형성 억제실험, 마우스 마트리젤 모델과 계태자 융모 요막(CAM) 실험을 이용한 생체내 실험을 통하여 멜리사엽 엑스가 혈관신생억제 효능을 가지고 있음을 밝힌 바 있다.

대한민국 특허등록 제10-473688호에서는 멜리사엽 추출물이 혈관신생의 중요한 과정인 혈관내피세포를 둘러싸고 있는 기저막의 분해에 있어 중요한 역할을 하는 MMP의 활성을 억제하는 효능을 가지고 있음을 추가로 밝힌 바 있다.

대한민국 특허등록 제10-903030호는 멜리사엽 추출물의 약효를 증대시킬 수 있는 추출 방법으로서 멜리사엽을 50 내지 100% 에탄올 또는 메탄올로 추출한 후 건조시키고, 상기 알코올 추출물을 물로 현탁시킨 후 에틸아세테이트로 분획하여 건조시키고, 상기 에틸아세테이트 분획을 물로 재현탁시킨 후 건조시켜 얻은 멜리사엽 추출물 분획을 수득하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 또한 멜리사엽 추출물을 포함하는 경질 캡슐제에 대한 실시예를 개시하고 있는데, 멜리사엽 추출물은 캡슐 제형으로 제조할 경우 활성성분이 캡슐 기제에 의해 방출이 용이하지 않게 될 뿐만 아니라, 캡슐 기제와 덩어리지는 현상이 있어 약물 방출에 유리하지 않다. 고온 다습한 조건에 방치할 경우 활성성분의 용출 속도가 더 느려지게 되어 멜리사엽 추출물 함유 캡슐 제제는 원하는 약리 효과를 나타내기에 적합하지 않다.

그러나, 상기 선행문헌들은 멜리사엽 추출물로부터 유래한 약리 활성을 나타내는 활성 성분들, 및 상기 추출물을 생체에 투약하기에 적합한 제형에 대해서는 충분하게 고찰하고 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 멜리사엽 추출물로부터 유래한 주요 활성성분들의 용출 속도에 따른 약효 발현 효과에 대해 예의 연구한 결과, 멜리사엽 추출물을 포함하는 약학 조성물의 용출패턴 및 제형에 따라 약효가 달라진다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하였다.

[특허문헌 1] 대한민국 특허 등록 제 10-903030호

[특허문헌 2] 대한민국 특허 등록 제 10-550298호

[특허문헌 3] 대한민국 특허 등록 제 10-473688호

[비특허문헌 1] Polverini PJ, Critical Reviews in Oral Biology, 6(3), 1995, 230-247;

[비특허문헌 2] Arup Das, et al., Progress in Retinal and Eye Research, 22, 2003, 721-748;

[비특허문헌 3] Nick Di Girolamo, et al., IOVS, Vol. 42, No.9, August 2001, 1963-1968;

[비특허문헌 4] Patricia Lee, et al., Survey of ophthalmology, vol 43, No. 3, Nov-Dec 1998, 245-269;

[비특허문헌 5] D.B. Holland, et al., British Journal of Dermatology, 150, 2004, 72-81;

[비특허문헌 6] Anthony H Vagnucci Jr, et al., The Lancet, vol 361, Feb. 15, 2003, 605-608;

[비특허문헌 7] Berislav V. Zlokovic, Trends in Neuroscience, Vol. 28, No.4, April 2005, 202-208;

[비특허문헌 8] Jaap G. Neels, et al., The FASEB Journal express article 10. 1096/fj.03-1101fje. Published online April 14, 2004;

[비특허문헌 9] D.L. Crandall, et al., Microcirculation, 4, 1997, 211-232;

[비특허문헌 10] G. Voros, et al., Endocrinology, 146, 2005, 4545-4554;

[비특허문헌 11] M.A. Rupnick, et al., PNAS, 99, 2002, 10730-10735;

[비특허문헌 12] E. Brakenhielm, et al., Circ . Res ., 94, 2004, 1579-1588;

[비특허문헌 13] H.R. Lijnen, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol., 22, 2002, 374-379; 및

[비특허문헌 14] D. Demeulemeester, et al., Biochem . Biophys . Res . Commun., 329, 2005, 105-110

따라서 본 발명의 목적은, 로즈마린산, 카페인산 및 루틴을 주요 활성성분으로 하고, 혈관 신생억제 및 복부비만 치료 효과가 있는 멜리사엽 추출물을 포함하며 약효의 발현이 우수한 약학 제형을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 로즈마린산, 카페인산 및 루틴을 주요 활성성분으로 하는 멜리사엽 추출물을 포함하며, 상기 로즈마린산 또는 카페인산의 용출률이 30분 내에 80% 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 또는 MMP 활성 매개 질환의 예방 또는 치료용 정제를 제공한다.

본 발명에 따른 정제는 활성 성분의 용출 속도가 우수하고, 가속 조건에서도 안정하며 혈관신생 또는 MMP 활성 매개 질환의 치료 또는 예방을 극대화시킬 수 있는 용출패턴을 나타내므로 상기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1 및 2는 각각 실시예 2 및 3, 및 비교예 1의 제제의 로즈마린산 및 카페인산의 용출시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3 내지 5는 각각 실시예 2 및 3, 및 비교예 1의 제제의 가속 조건 하의 보관 기간에 따른 로즈마린산, 카페인산 및 루틴의 함량 안정성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 6 및 7은 각각 실시예 2 및 3, 및 비교예 1의 제제의 가속 조건 하의 보관 기간에 따른 로즈마린산 및 카페인산의 용출 안정성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 비교예 2 및 3, 및 실시예 4의 제제의 래트 투여시 체중 변화율을 나타낸 것이다.

본 발명은 로즈마린산, 카페인산 및 루틴을 주요 활성성분으로 하는 멜리사엽 추출물을 포함하며, 상기 로즈마린산 또는 카페인산의 용출률이 30분 내에 80% 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 또는 MMP 활성 매개 질환의 예방 또는 치료용 정제를 제공한다.

본 발명에서 "용출률"은 정제수 900mL을 용출 시험액으로 하여 37±0.5℃의 조건에서 대한약전 일반시험법 용출시험 제2법인 패들법에 따라 50rpm의 회전속도로 용출시험을 진행한 후, 일정 시간 후에 0.45μm 필터로 용출액을 여과하고, 대한약전 일반시험법 액체크로마토그래피(HPLC) 분석법을 이용하여 하기 기재된 이동상 A(5% 포름산 수용액) 및 이동상 B(메탄올)의 농도 구배조건에 따라 분당 1ml의 속도로 작동시키고, 분석 컬럼(예를 들면, Zorbax Eclipse Plus C18(150 x 4.6mm) 컬럼)에 시료 10μl를 주입한 후 285nm 파장에서 유효 성분들을 분석하여 측정된 값을 의미한다.

<이동상의 농도 구배조건>

시간(분) 이동상 A(%) 이동상 B(%)

0 100 0

5 100 0

25 0 100

35 0 100

35.1 100 0

45 100 0

본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 정제는 로즈마린산 또는 카페인산의 용출률이 15분 내에 80% 이상인 것을 특징으로 한다(도 6 및 7 참고).

또한, 본 발명의 정제는 정제 총 중량을 기준으로 멜리사엽 추출물을 10 내지 90 중량%의 양으로 포함한다.

본 발명의 멜리사엽 추출물 함유 정제는 활성성분의 방출을 용이하게 할 수 있어 로즈마린산 또는 카페인산과 같은 활성성분을 30분 이내에 80% 이상 방출시킬 수 있을 뿐만 아니라, 고온 다습한 가속 조건에 장기간 방치되더라도 그 고유의 용출 속도의 변화가 거의 없이 안정하여 우수한 약효를 나타낼 수 있다. 천연물 추출 의약품의 경우 활성성분이 혼합되어 있는 것을 특징으로 볼 수 있는데, 이러한 유효 성분들이 약효를 동시에 나타낼 수 있도록 빠른 붕해력을 갖는 제형이 유리하다. 따라서, 멜리사엽 추출물을 포함하는 약학 조성물은 본원 발명과 같이 정제 형태인 것이 바람직하다.

본 발명에서 멜리사엽 추출물은 에탄올을 이용하는 통상적인 추출방법을 이용하여 다음과 같은 과정에 따라 제조될 수 있다. 먼저, 멜리사엽을 10 내지 40중량배의 50 내지 100%의 에탄올, 바람직하게는 70 내지 80%, 더욱 바람직하게는 75% 에탄올을 사용하여 환류 추출한 후 여과하여 1차 농축 과정을 거친다. 이어 상기 추출물을 에틸아세테이트와 물의 혼합물(예를 들면, 에틸아세테이트:물=1:1 (v/v))로 분획하는 과정을 2회 반복한다. 상기 과정을 거쳐 생성된 에틸아세테이트 층을 회수한 후, 이를 2차 농축하고 건조 및 분쇄함으로써 본 발명에 따른 멜리사엽 추출물을 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 추출물은 본 발명에서 멜리사엽 초산에틸 건조엑스로서 사용된다.

이때, 상기 멜리사엽은 건조시킨 멜리사엽, 건조시키지 않은 멜리사엽 또는 이의 혼합물을 이용할 수 있으며, 효과적인 추출을 위해 멜리사엽은 잘게 부수어 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 멜리사엽 추출물은 추출물 총 중량을 기준으로 로즈마린산 5 중량% 이상, 카페인산 0.5 중량% 이상 및 루틴 1중량% 이상을 포함하며, 바람직하게는 로즈마린산 5 내지 10중량%, 카페인산 0.5 내지 1중량%, 및 루틴 1 내지 2중량%를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 멜리사엽 초산에틸 건조엑스는 로즈마린산 약 5.5중량%, 카페인산 약 0.65중량% 및 루틴 약 1.42중량%를 포함한다(표 2 참고).

또한, 상기 멜리사엽 추출물은 로즈마린산 및 카페인산을 1:0.1 내지 1:0.2의 중량비로, 카페인산 및 루틴을 1:1 내지 1:4의 중량비, 더 구체적으로는 1:1 내지 1:3의 중량비, 및 로즈마린산 및 루틴을 1:0.1 내지 1:0.3의 중량비로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 정제는 부형제, 활택제, 붕해제, 결합제 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방식에 따라 멜리사엽 초산에틸 건조 엑스 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 혼합한 후 직타, 또는 건식 또는 습식 방식으로 타정함으로써 제조될 수 있다.

상기 부형제는 미결정 셀룰로오스(MCC), 경질 무수규산, 만니톨, 유당, 인산이수소칼슘, 전분, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 정제 총 중량을 기준으로 7 내지 87중량%의 양으로 포함될 수 있다.

상기 활택제는 스테아르산, 스테아린산 마그네슘 및 스테아르산 칼슘과 같은 스테아르산 금속염류, 탈크, 자당지방산에스테르, 수소첨가된 식물성 오일, 고융점의 왁스, 글리세릴지방산 에스테르류, 글리세롤디베헤테이트 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 정제 총 중량을 기준으로 0.2 내지 5중량%의 양으로 포함될 수 있다.

상기 붕해제는 소디움스타치 글리콜레이트(SSG), 크로스포비돈, 크로스카멜로오스 나트륨, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 정제 총 중량을 기준으로 1 내지 10중량%의 양으로 포함될 수 있다.

상기 결합제는 히드록시프로필셀룰로오스(HPC-L), 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 코포비돈 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 정제 총 중량을 기준으로 1 내지 10중량%의 양으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 정제는, 혈관신생 관련 질환 또는 MMP 매개질환, 예를 들면, 암의 성장과 전이; 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증 및 재협착증 등과 같은 심혈관계 질환; 당뇨병성 망막증, 황반 변성(노인 황반변성과 같은 노화와 관련된 황반 변성 포함), 익상편, 망막 변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 각막궤양, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양 및 각막이식 거부 등과 같은 안질환; 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환, 바람직하게는 비만의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 멜리사엽 초산 에틸 건조 엑스의 구성성분 및 비율 분석

멜리사엽 원초로부터 유효 성분을 추출하기 위하여 다음과 같이 추출물을 제조한 후 구성성분 분석에 이용하였다.

구체적으로, 건조 멜리사엽 200kg을 20 중량배의 75%의 에탄올을 이용하여 4시간 동안 환류 추출한 후 카트리지필터로 여과하고 감압농축 방법으로 1차 농축하였다. 얻어진 농축물(양: 50kg)을 에틸아세테이트와 물의 혼합물(1:1(v/v))(양: 50kg)로 분획하는 과정을 2회 반복하였다. 이어, 에틸아세테이트 층을 회수한 후, 감압농축 방법으로 2차 농축하여 건조 후 분쇄하여 멜리사엽 초산에틸 추출물(양: 8.2kg)을 수득하였다. 상기 공정을 3회 반복하여 추출물에 대한 재현성을 확인하였으며, 멜리사엽 추출물에 포함되는 구성성분 및 상기 성분의 비율을 다음과 같이 분석하였다.

멜리사엽 추출물의 분석방법은 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하였으며, Zorbax Eclipse Plus C18 (150 × 4.6 mm) 컬럼에 상기에서 제조한 멜리사엽 초산에틸 추출물 시료 10μl을 주입한 후, 이동상 A(5% 포름산 수용액) 및 이동상 B(메탄올)를 하기 표 1에 기재된 비율에 따라 분당 1ml의 속도로 작동시켜 285nm 파장에서 유효 성분들을 분석하였다.

시간(분)	이동상 A	이동상 B
0	100	0
5	100	0
25	0	100
35	0	100
35.1	100	0
45	100	0

멜리사엽 추출물의 유효 성분을 분석한 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 멜리사엽 추출물은 평균적으로 로즈마린산 약 5.5중량%, 카페인산 약 0.65중량%, 루틴 약 1.42중량%를 포함하는 것으로 확인되었다. 상기 분석결과를 바탕으로 멜리사엽 추출물에는 로즈마린산 및 카페인산이 1:0.1 내지 1:0.2의 비율로, 카페인산 및 루틴이 1:1 내지 1:3의 비율로, 로즈마린산 및 루틴이 1:0.1 내지 1:0.3의 비율로 존재할 수 있음을 확인할 수 있었다.

로즈마린산, 카페인산, 루틴의 약물 비율이 적절히 조화를 이루며 일정한 비율로 유지가 될 때, 멜리사엽 초산에틸 추출물이 연구자가 원하는 약효를 나타낼 수 있으리라 판단된다.

또한, 멜리사엽 추출물 총 중량을 기준으로 로즈마린산이 5.0중량% 이상, 카페인산이 0.5중량% 이상, 루틴이 1.0중량% 이상 함유되는 것이 약효의 재현성에 있어서 바람직하다고 판단되며, 이를 유지하기 위하여 재현성 있게 지속적으로 관리하는 것이 중요함을 알 수 있다.

	함량 (중량%)
	로즈마린산	카페인산	루틴
1	5.8	0.63	1.38
2	5.7	0.69	1.41
3	5.0	0.63	1.47
평균	5.5	0.65	1.42

실시예 2: 멜리사엽 추출물이 포함된 정제의 제조-(1)

하기 표 3에 기재된 함량(단위: mg)에 따라, 상기 실시예 1에서 제조한 멜리사엽 초산에틸 건조엑스에 부형제로서 미결정 셀룰로오스(MCC, Avicel PH101, FMC bio polymer)와 경질무수규산(Aerosil 200, Degussa), 붕해제로서 소디움스타치 글리콜레이트(SSG, YUNG ZIP Chem) 및 활택제로서 스테아린산 마그네슘(S-Mg, NOF Corporation)을 혼합한 후 바로 타정하는 방법으로 정제를 제조하였다.

실시예 3: 멜리사엽 추출물이 포함된 정제의 제조-(2)

하기 표 3에 기재된 함량(단위: mg)에 따라, 상기 실시예 1에서 제조한 멜리사엽 초산에틸 건조엑스를 MCC 및 SSG를 혼합한 후, 히드록시프로필셀룰로오스(HPC-L, Shin-Etsu)를 물에 녹인 액을 결합액으로 하여 상기 혼합물들과 균질하게 혼합한 후 과립을 제조하였다. 제조된 과립을 50℃에서 2시간 동안 건조한 후 20 mesh 체로 체과한 다음, 부형제인 경질무수규산 및 활택제인 S-Mg와 혼합한 후 타정하여 정제를 제조하였다.

비교예 1: 멜리사엽 추출물이 포함된 캡슐의 제조

하기 표 3에 기재된 함량(단위: mg)에 따라, 상기 실시예 1에서 제조한 멜리사엽 초산에틸 건조엑스를 부형제로서 MCC와 경질무수규산 및 활택제로서 S-Mg를 혼합한 후 0호 캡슐에 충전하여 캡슐을 제조하였다.

성분	비교예 1	실시예 2	실시예 3
멜리사엽 초산에틸건조엑스	300.0	300.0	300.0
미결정 셀룰로오스	165.0	225.0	175.0
SSG	-	54.0	54.0
HPC-L	-	-	6.0
(정제수)	-	-	(60.0)
경질무수규산	5.0	15.0	15.0
스테아린산 마그네슘(S-Mg)	5.0	6.0	6.0
캡슐	77.0	-	-
전체질량	552.0	600.0	556.0

비교예 2: 멜리사엽 추출물이 포함되지 않은 래트 투여용 정제의 제조

상기 실시예 2 및 3에서 제조한 정제의 경우 실제 사람(약 60kg)에게 적용 가능한 용량 및 크기이다. 래트 투여를 통한 체중 측정 실험을 위해 사람의 체중 대비 래트 체중(약 250g)과 거의 비례하는 비율로 멜리사엽 추출물이 포함되지 않은 래트 투여용 정제를 제조하였다.

하기 표 4에 기재된 조성에 따라, 멜리사엽 초산에틸 건조엑스를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 방식으로 래트 투여용 정제를 제조하였다.

성분	비교예 2
미결정 셀룰로오스	6.0
SSG	1.8
HPC-L	0.2
(정제수)	(3.0)
SiO₂	0.5
S-Mg	0.2
전체질량	8.7

비교예 3: 멜리사엽 추출물이 포함된 래트 투여용 캡슐의 제조

하기 표 5에 기재된 함량(단위: mg)에 따라, 상기 실시예 1에서 제조한 멜리사엽 초산에틸 건조엑스를 부형제로서 MCC와 경질무수규산 및 활택제로서 S-Mg를 혼합한 후 5호 캡슐에 충전하여 래트 투여용 캡슐을 제조하였다.

실시예 4: 멜리사엽 추출물이 포함된 래트 투여용 정제의 제조

하기 표 5에 기재된 함량(단위: mg)에 따라, 상기 실시예 3과 동일한 방식으로 래트 투여용 정제를 제조하였다.

성분	비교예 3	실시예 4
멜리사엽 초산에틸건조엑스	10.0	10.0
미결정 셀룰로오스	5.5	6.0
SSG	-	1.8
HPC-L	-	0.2
(정제수)	-	(3.0)
SiO₂	0.2	0.5
S-Mg	0.2	0.2
캡슐	10.0	-
전체질량	25.9	18.7

시험예 1: 로즈마린산과 카페인산의 용출시험

비교예 1의 캡슐, 실시예 2 및 3의 정제를 대상으로 멜리사엽 추출물의 주요 활성성분인 로즈마린산 및 카페인산의 용출시험을 실시하였다.

상기 용출시험은 물 900 ml를 용출 시험액으로 하여, 37 ±0.5℃의 조건에서 대한약전 일반시험법 용출시험 제2법인 패들법에 따라 50rpm의 회전속도로 실시하였으며, 용출 시험 시작 후 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 및 120분 후에 용출액을 취하여 0.45μm 필터로 여과한 후, 상기 실시예 1에 기재된 HPLC 분석법과 동일한 방법으로 로즈마린산 및 카페인산의 용출률을 측정하였다. 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.

도 1 및 2에 나타난 바와 같이, 비교예 1의 캡슐보다 실시예 2 및 3의 정제의 경우 각 활성성분들의 용출 속도 및 최종 용출률이 더 높은 것을 알 수 있었다. 또한, 건식 공정으로 제조한 실시예 2의 정제 및 습식 공정으로 제조한 실시예 3의 정제가 모두 로즈마린산 및 카페인산을 30분 이내에 80% 이상 방출하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 2: 가속조건 유효성분 함량시험

비교예 1의 캡슐, 실시예 2 및 3의 정제를 HDPE병에 포장하여 가속 보관조건(40℃ 및 75% 상대 습도)에서 6개월간 보관한 후, 멜리사엽 추출물의 주요 활성성분인 로즈마린산, 카페인산 및 루틴의 함량을 확인함으로써 제제 안정성을 확인하였다. 가속 보관 1개월, 3개월 및 6개월이 되는 시점에서 로즈마린산, 카페인산 및 루틴의 함량을 측정하였으며 그 결과를 도 3 내지 5에 나타내었다.

그 결과, 캡슐 제제와 건식 및 습식 제조 방식에 따른 정제의 안정성은 상호 유의적인 차이가 없었으며, 각 성분의 함량 역시 크게 변화하지 않았다. 특히, 본 발명에 따른 정제는 로즈마린산 5.0중량% 이상, 카페인산 0.5중량% 이상, 루틴 1.0% 이상인 기준 조건을 만족하여 가속 보관조건에서도 안정함을 알 수 있었다.

시험예 3: 가속조건에서의 용출 변화 확인 시험

비교예 1의 캡슐, 실시예 2 및 3의 정제를 HDPE병에 포장하여 가속 보관조건(40℃ 및 75% 상대습도)에서 6개월간 보관한 후, 상기 시험예 1과 동일한 방식으로 로즈마린산 및 카페인산의 용출률을 측정하였다. 용출시험 시작 후 15분, 30분, 60분 후의 샘플을 취하여 평가하였으며, 용출률을 초기값과 비교 평가하여 변화정도를 확인한 후, 그 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.

도 6 및 7에서 보는 바와 같이, 비교예 1의 캡슐은 초기 용출 속도부터 느릴 뿐만 아니라, 가속 조건 보관시 시간이 지남에 따라 방출속도가 지속적으로 느려지는 것을 확인할 수가 있었다. 이는 캡슐에 의해 멜리사엽 추출물의 방출 속도가 영향을 받는 것으로 판단되며, 용출이 느려짐에 따라 약효가 변화될 수 있는 가능성이 있으므로 약제학적으로 바람직하지 못한 제형으로 판단되며, 본 발명의 정제는 모두 방출속도의 큰 변화 없이 안정한 것을 알 수 있었다.

시험예 4: 동물 투여 및 체중 변화 측정

고지방 식이에 의해 유발되는 비만에 있어서 멜리사엽 추출물의 생체내 효능을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

1주간 순화시킨 7주령 래트(Rat)를 그룹당 3마리로 나누어 45kcal% 고지방사료를 8주간 급식하면서 존대(Zonde)를 사용하여 비교예 2 및 3과 실시예 4의 조성물을 1일 1회(하루 투여 멜리사엽 추출물 용량 10mg) 투여하고 체중을 측정한 후, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 개체의 평균 체중 측정 비교분석 결과 모든 경우에 각각이 유의한 결과임을 알 수 있다(p<0.05).

도 8에 나타난 바와 같이, 멜리사엽 추출물이 포함되지 않은 비교예 2의 정제는 시간이 경과함에 따라 체중이 급격하게 증가하였다. 한편, 멜리사엽 추출물이 포함된 비교예 3의 캡슐은 실시예 4의 정제와 비교하여 상대적으로 높은 체중 증가량을 나타냄을 알 수 있었다. 이는 시험예 1의 용출시험 결과와 연관된 것으로 보이며, 이를 통해 멜리사엽 추출물의 유효성분인 로즈마린산 및 카페인산의 용출속도가 멜리사엽 추출물의 약효 발현에 있어 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 달리 말하면, 비교예 3과 같이 캡슐제로 제조되어 멜리사엽 추출물의 약리 활성성분이 잘 방출되지 않을 경우, 그 성분들이 체내로 흡수되는 양이 적어지므로 약효 발현이 잘 이루어지지 않는다.

따라서, 멜리사엽 추출물의 주요성분인 로즈마린산 및 카페인산이 30분 내에 80% 이상 방출되어 약효를 빠르게 발현할 수 있으며 제품 보관 중에 용출 변화가 없는 정제 제형이 멜리사엽 추출물의 제형으로 가장 적합함을 알 수 있었다.

Claims

로즈마린산, 카페인산 및 루틴을 주요 활성성분으로 하는 멜리사엽 추출물을 포함하며, 상기 로즈마린산 또는 카페인산의 용출률이 30분 내에 80% 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix metalloproteinase, MMP) 활성 매개 질환의 예방 또는 치료용 정제.
제 1 항에 있어서,
상기 로즈마린산 또는 카페인산의 용출률이 15분 내에 80% 이상인 것을 특징으로 하는 정제.
제 1 항에 있어서,
상기 멜리사엽 추출물이, 멜리사엽을 50 내지 100%의 에탄올로 환류 추출한 후 여과 및 농축하고, 얻어진 농축물을 에틸아세테이트와 물로 분획하는 과정을 2회 반복하여 생성된 에틸아세테이트 층을 회수한 후, 이를 농축, 건조 및 분쇄함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 정제.
제 1 항에 있어서,
상기 멜리사엽 추출물이 추출물 총 중량을 기준으로 로즈마린산 5 내지 10중량%, 카페인산 0.5 내지 1중량% 및 루틴 1 내지 2중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제.
제 1 항에 있어서,
상기 멜리사엽 추출물이 로즈마린산 및 카페인산을 1:0.1 내지 1:0.2의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제.
제 1 항에 있어서,
상기 멜리사엽 추출물이 카페인산 및 루틴을 1:1 내지 1:4의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제.
제 1 항에 있어서,
상기 멜리사엽 추출물이 로즈마린산 및 루틴을 1:0.1 내지 1:0.3의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제.
제 1 항에 있어서,
상기 정제가 부형제, 활택제, 붕해제, 결합제 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 정제.
제 8 항에 있어서,
상기 정제가 정제 총 중량을 기준으로 10 내지 90중량%의 멜리사엽 추출물, 7 내지 87중량%의 부형제, 0.2 내지 5중량%의 활택제, 1 내지 10중량%의 붕해제 및 1 내지 10중량%의 결합제를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제.
제 1 항에 있어서,
상기 혈관신생 또는 MMP 활성 매개 질환이, 암의 성장과 전이; 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형, 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증 및 재협착증; 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 익상편, 망막 변성, 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 각막궤양, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양 및 각막이식 거부; 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 정제.
제 10 항에 있어서,
상기 혈관신생 또는 MMP 활성 매개 질환이 비만인 것을 특징으로 하는 정제.