KR20120018556A - 마가목 및 현지초 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물(ｓｇ-ⅱ) - Google Patents

마가목 및 현지초 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물(ｓｇ-ⅱ) Download PDF

Info

Publication number
KR20120018556A
KR20120018556A KR1020100081478A KR20100081478A KR20120018556A KR 20120018556 A KR20120018556 A KR 20120018556A KR 1020100081478 A KR1020100081478 A KR 1020100081478A KR 20100081478 A KR20100081478 A KR 20100081478A KR 20120018556 A KR20120018556 A KR 20120018556A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
extract
bone
rowan
mixture
disease
Prior art date
Application number
KR1020100081478A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101249930B1 (ko
Inventor
윤유석
김선여
오명숙
소윤조
Original Assignee
윤유석
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 윤유석 filed Critical 윤유석
Priority to KR1020100081478A priority Critical patent/KR101249930B1/ko
Publication of KR20120018556A publication Critical patent/KR20120018556A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101249930B1 publication Critical patent/KR101249930B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/73—Rosaceae (Rose family), e.g. strawberry, chokeberry, blackberry, pear or firethorn
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/38—Other non-alcoholic beverages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/306—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on bone mass, e.g. osteoporosis prevention
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/21—Plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2300/00—Processes
    • A23V2300/14—Extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 마가목 추출물 또는 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 골 및 연골 조직 손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 억제활성 및/또는 연골세포의 분화 촉진활성을 나타냄으로써 골조직 또는 연골조직의 보호 및 재생 효과를 가지므로, 연골 및 뼈 손상을 동반하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도로 광범위하게 응용될 수 있다.

Description

마가목 및 현지초 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물(ＳＧ-Ⅱ){Compositions comprising extracts of Sorbus commixta and Geranium nepalense for inhibiting osteoclastogenesis and stimulating chondrogenesis}
본 발명은 마가목 추출물(SC), 현지초 추출물(GN) 또는 이들의 혼합물 (SG-Ⅱ)을 유효성분으로 포함하는 골 및 연골 조직 손상의 억제 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 파골세포의 분화를 억제하고 연골세포의 분화를 촉진하여 골조직 또는 연골조직의 보호 및 재생 효과를 가지므로, 연골 및 뼈 파괴를 동반하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도로 광범위하게 응용될 수 있다.
뼈는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 역동적, 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 되는데, 이를 골재형성(bone remodeling)이라고 한다 (Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl):664-669(2005)). 이러한 뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 그 기능을 유지하는데 필수적이다 (Cohen-Solal M. et al., Therapie., 58:391-393 (2003)). 성인에서는 매년 골격의 약 10-30 %가 골흡수-골형성의 리모델링을 통하여 재형성된다.
골재형성에는 크게 두 종류의 세포, 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)가 관여하며 서로 밀접한 연관성으로 골의 항상성이 유지된다. 예를 들어, 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand), 및 그의 유도 수용체인 OPG(osteoprotegerin)과 같은 물질의 분비를 통해 골흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내의 골 항상성을 유지한다. 즉, RANKL이 파골 전구세포 표면 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화되어 골흡수가 일어나며, OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제된다 (Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20:795-823(2002); Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11:527-532(2001)). 전구세포로부터 형성되는 파골세포는 오래된 뼈를 흡수 또는 파괴하며, 뼈에 축적된 소량의 칼슘을 혈류로 방출시켜 신체기능 유지에 사용한다 (William J. et al., Nature., 423:337342(2003)).
이러한 대사는 물리적 영향, 호르몬 체계 및 국소 인자에 의해 조절되는데, 여러 요인에 의해 골 흡수가 골 형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하게 되면 각종 골질환이 발생한다. 골다공증(osteoporosis)은 뼈의 질량이 일정 수준 이하로 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다 (Iqbal MM., South Med J., 93(1):2-18(2000)). 골관절염은 골과 연골을 침범하는 관절염의 가장 일반적인 형태로서, 염증반응에 의해 파골세포의 분화를 과도하게 촉진하게 된다. 이는 IL-1, TNF-α, MMP와 같은 골흡수 활성화 인자의 발현을 증가시켜 결국 골손실과 연골손상을 유도한다. 암세포의 골전이는 유방암, 전립선암 또는 다발성 골수종의 경우 빈번하게 발생하는데 (Kozlow W. et al., J Mammary Gland Biol Neoplasia., 10(2):169-180(2005)), 특히 골 용해성 골전이(osteolytic metastasis)는 유방암 세포 등이 파골세포를 활성화시킴으로써 일어나는 것으로 알려져 있다 (Boyde A. et al., Scan Electron Microsc., 4:1537-1554(1986)). 활성화 된 파골세포는 뼈 주위의 미세 환경의 균형을 파괴시켜 골용해 및 이로 인한 병적 골절, 백혈구 감소증, 뼈의 기형, 고칼슘혈증, 통증, 신경압박 증후군 등 뼈와 관련된 질환을 발생시킨다 (Roodman GD., N Engl J Med., 350:1655-1664(2004)).
이러한 골조직 손상을 동반한 질환의 치료와 관련하여 과거에는 주로 골 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사 이상만을 중심으로 연구가 진행되어 왔으며, 그 기전 규명에 있어서 진전을 보지 못하였다. 일반적으로, 골다공증의 치료 및 예방을 위하여 칼슘이 함유된 식이요법이 추천되며, 폐경기의 여성들에게는 에스트로겐 또는 비타민 D 투여가 추천되고 있다. 그 외에, 포사맥스(Fosamax)와 악토넬(Actonel)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열제제가 파골세포를 억제하고 사멸을 유도하는 골흡수 억제제로서 새로운 대체 치료제로 주목받고 있다.
그러나, 골질환 치료제로 널리 사용되는 칼슘보강제는 부갑상선 호르몬의 분비를 억제하며 골흡수에 의한 골량 감소를 방지하나, 골량 유지의 개인 차이가 심한 것으로 알려져 있다 (Heandy.R.P. principles of bone biology, Academic press, 1007-1017, 1996). 또한, 에스트로겐이나 칼시토닌을 이용한 호르몬 요법의 경우 골밀도를 증가시키고 직장암의 발생을 감소시킨다는 보고도 있으나, 유방암, 심근경색, 정맥 혈전증 등의 부작용이 보고된 바 있다 (Nelson, H.D et al., JAMA, 288:872-881, 2002; Lemay, A., J.Obstet. Bynaecol. Can., 24:711-7152-3). 또한, 비스포스포네이트 제제의 경우, 최근 복용하는 환자에서 턱뼈의 괴사, 중증 심방세동, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 해마다 증가되고 있다 (Coleman RE., Br J Cancer, 98:1736-1740(2008). 따라서 부작용 발현이 적으면서 효과적으로 골흡수를 억제할 수 있는, 새로운 골질환 치료제의 개발이 당업계에 요구되고 있다.
연골세포(chondrocyte)는 발생 과정에서 중간엽 세포(mesenchymal cell)로 부터 분화되어 연골 조직을 형성한다. 다른 유형의 조직과는 달리 연골은 연골세포 한 종류만으로 구성되어 있으며, 형성된 연골 조직은 관절 연골과 같이 영구적인 연골 조직으로 남아있거나 발생 과정에서 경골 형성을 위한 주형으로 작용한다. 따라서 연골세포 분화를 촉진하는 물질은 일차적으로 뼈(경골) 조직 형성 속도를 증가시켜 골밀도 증가에 기여할 수 있다.
관절 연골은 인체 조직 중 체중의 부하가 가장 큰 조직으로 마모로 인한 손상에 쉽게 노출된다. 관절 내 연골세포는 세포외 기질을 합성 분비하므로 관절 연골의 유지에 중요한 역할을 하며, 노화에 따른 연골세포 수 또는 대사 감소는 골관절염의 주된 병인으로 생각되고 있다. 관절 내 연골세포는 부착성 세포로서 혈관,신경 및 림프 조직이 없으므로 손상이 되면 생체 내에서 스스로 재생이 불가능한 특징을 갖고 있다. 따라서 현재의 의학적 방법으로는 관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이다. 일반적으로, 정상적인 연골 조직 일부를 채취하여 적절한 배양 배지에서 이식에 필요한 수로 연골세포를 증폭하여 연골 결손부에 이식하는 방법으로 환자의 손상된 관절 연골을 재생시키는 방법이 종종 사용된다. 이를 위해, 연골세포화된 줄기세포의 연골세포로의 분화 및 증식을 촉진하기 위한 물질 개발의 필요성이 있다.
마가목(Sorbus commixta, SN)은 장미과의 낙엽활엽 소교목으로, 주로 우리나라와 중국, 일본 등지의 해발 500-1200 m의 심산 산복에 천연 분포한다. 마가목의 수피는 마아피라고 하여 한방에서 신장을 보호하는 약재, 기관지염, 중풍 위염 및 골통에 사용되었으며, 열매는 신경통 억제효과를 갖는 것으로 알려져 예로부터 생식하였다. 마가목의 생리활성으로는 당뇨 및 비만 억제 효과, 항산화 및 광노화 억제 효과, 혈관 염증 억제 효과 및 항동맥경화 등이 알려져 있고, 구성성분으로는 네오사쿠라닌(neosakuranin), 루페올(lupeol) 및 루페논(lupenone)이 알려져 있으나, 골 질환에 있어서의 생리 활성에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
현지초(Geranium nepalense, GN)는 쥐손이풀과에 속하는 다년생초이다. 우리나라 전역, 일본, 대만, 중국 등에 분포한다. 줄기와 잎을 말려서 종기, 절상, 복통, 변비 등에 사용하였으며, 특히 이질의 특효약으로 알려져 있어 이질풀이라고도 한다. 그 밖의 활성으로 항돌연변이, 항산화효과 등이 보고되어 있으나, 골질환에 있어서의 생리활성에 대해서는 개시되거나 교시된 바 없다.
본 발명의 목적은, 안전하고 효과적인 골 또는 연골 조직 손상 질환 및 기타 관련 질환의 예방 또는 치료 방법 및 이를 위한 조성물을 제공하는 것이다. 이를 위하여 파골세포 억제 활성 또는 연골세포 분화 촉진 활성을 가져 상기 골질환의 예방 또는 치료효과가 우수한 조성물을 제공하고자 하였다.
상기 목적을 위해, 본 발명은 마가목(SC) 또는 현지초 추출물(GN) 또는 이들의 혼합물(SG-Ⅱ)을 포함하는, 파골세포 분화 억제 활성 또는 연골세포 분화 촉진 활성을 갖는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 마가목 또는 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 파골세포의 과다 분화 및 활성화에 기인한 질환, 및 골 또는 연골 손상을 동반하는 기타 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 포유동물에 상기 조성물의 유효량을 투여하여 상기 질환을 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물의 유효량을 포함하는, 상기 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 파골세포분화 억제 또는 연골세포 분화촉진 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 약학적 조성물은 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효 성분으로 함유한다. 상기 추출물들은 파골세포 분화(osteeogenesis)를 유의성있게 억제함과 동시에 연골세포 분화(chondrogenesis)를 유의성있게 증가시키므로, 각종 골질환의 예방 및 치료의 용도로 사용될 수 있다.
구체적으로, 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물은 상기 추출물을 투여하지 않은 세포에 비해 파골 세포의 표지 효소인 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 활성을 농도의존적으로 감소시킨다(도 2 및 도 3). 따라서 본 발명의 조성물은 파골세포의 형성을 감소시키고, 파골세포에 의한 골 흡수 및 골 파괴를 억제하는 효능을 나타낸다. 본 명세서에서 용어 "골 흡수(bone resorption)"는 파골세포가 뼈에 강력한 산 및 단백질 분해효소를 분비하여 뼈를 분해하는 대사과정을 의미한다.
이에 따라, 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물은 골질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "골질환"은, 파골세포의 과다 분화 및 활성화로 인해 야기되는 질환 및 골조직 또는 연골조직의 손상을 동반하거나 동반할 가능성이 있는 모든 질환을 포함하는 광범위한 의미로 사용된다. 상기 골질환은 골절, 골다공증, 골관절염, 퇴행성 연골 및 뼈 파괴 질환, 류마티스성 질환, 치주 질환, 골종양, 암세포의 골 전이에 의한 뼈 손상, 파제트씨병, 대사성 골염, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 골 연화증, 뼈의 기형, 구루병, 백혈병, 고칼슘혈증, 신경압박 증후군 및 다발성 골수종 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 골다공증은 원발성(일차성) 골다공증과 속발성(이차성) 골다공증을 포함한다. 원발성 골다공증은 칼슘과 비타민 D를 적절히 섭취하지 않거나 폐경기 이후 여성 또는 노년기 남성에게 주로 발생하는 골다공증을 의미하며 속발성 골다공증은 특정 질환이나 약물에 의해 유발된 경우이다. 후자의 원인 질환으로는 갑상선 기능항진증, 부갑상선 기능항진증, 쿠싱증후군(부신피질호르몬 과다분비질환), 조기폐경, 인위적 수술(난소 절제)에 의한 폐경, 성기능 저하증, 만성 간질환(간경화증), 류마티스 관절염, 만성 신부전증, 위절제수술 등을 들 수 있으며, 약물로는 스테로이드(부신피질 호르몬제), 항경련제(간질약), 헤파린 등이 있다.
상기 암세포 또는 암조직의 골 전이에 의한 골 질환에 있어서, 상기 암세포 또는 암조직은 예를 들면, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 직장암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 자궁내막 암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 백혈병, non-Hodgkin 임파선암, 부갑상선암 및 요관암 세포 또는 조직을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 마가목 추출물, 현지초 추출물 및 마가목과 현지초의 혼합 추출물은 연골 전구세포의 연골세포로의 분화를 농도의존적으로 촉진시켜 연골조직 재생 효과를 나타낸다 (도 4).
이에 따라, 상기 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 연골세포의 생성을 촉진함으로써 연골조직의 재생 또는 보호용 의약으로 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 연골손상, 외상에 의한 관절 손상 및 그 외 연골 파괴를 수반하는 다른 관절 질환이나 병태, 골관절염 (퇴행성 관절염), 류마티스성 관절염의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "마가목 추출물" 및 "현지초 추출물"은 마가목 또는 현지초의 다양한 기관 또는 부분 (예를 들면, 잎, 꽃, 열매, 껍질 및 줄기 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다.
용어 "추출물"은 마가목 또는 추출물에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 마가목 또는 현지초 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화 (예컨대, 분말화)된 가공물도 포함하는 의미를 갖는다. 또한 상기‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 마가목 또는 현지초 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들면, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획물, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의해 분리한 분획물 등, 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물을 포함한다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 마가목 또는 현지초 추출물을 마가목 또는 현지초에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 극성 용매 및 비극성 용매를 포함한 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 극성 용매로서 적당한 것은, 물, 알코올 (바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide) 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 적당한 비극성 용매로, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로부터 선택된다. 가장 바람직하게, 본 발명의 추출물은 물, 부탄올, 에틸아세테이트 또는 이들의 조합을 마가목 또는 현지초에 처리하여 수득된 것이다.
추출은 80 내지 120 ℃, 바람직하게는 약 100 ℃에서, 2 내지 6시간 동안, 바람직하게는 약 2시간 동안 수행될 수 있으나, 상기 추출온도 및 추출시간은 사용되는 생약(마가목 또는 현지초) 및 추출용매의 양에 따라 변경될 수 있다.
상기 과정에 더하여, 필요에 따라 농축 및/또는 건조하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 농축 및/또는 건조는 통상의 방법, 예를 들면, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서 사용되는 마가목 및/또는 현지초 추출물은 감압 농축 및 동결 건조에 의해 건조시킨 분말의 형태일 수 있다.
상기 방법에 의해 얻어진 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 마가목추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
또한 마가목 추출물 및 현지초 추출물의 혼합물에 있어서, 각 추출물의 배합비는 중량 기준으로 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:2 내지 2:1의 범위인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 상기 혼합물은 마가목 추출물과 현지초 추출물을 1:1의 중량비로 함유한다.
본 발명에 따른 조성물에서, 상기 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과의 결합체나 집합체의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 마가목 및/또는 현지초 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 제형은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 액제, 현탁제, 시럽, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제로서, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태일 수 있다. 이러한 고형 제제는 상기 마가목 및/또는 현지초 추출물에 적어도 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예를 들면, 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 젤라틴, 칼슘카보네이트, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 사용될 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구를 위한 액상 제제로서, 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등의 형태일 수 있다. 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위한 제제일 수 있으며 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 주사제의 경우는 이에 한정되는 것은 아니나, 한크액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 생리식염완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액을 사용하여 제조할 수 있다. 또한 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 안정제, 분산제 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 분말 형태로 제조되어, 사용 전에 멸균수와 같은 적당한 담체와 함께 사용될 수 있다. 좌제로 제제화되는 경우, 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 마가목 및/또는 현지초 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 관절 내, 정맥, 근육, 피하, 경피, 직장 내, 비강 내, 복강 내 투여 등이 가능하다. 상기 조성물은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 방법 (예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법들)을 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량 및 투여시기는 제제화 방법, 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 질병 증상의 정도, 배설 속도 및 반응 감응성, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자가 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 성인을 기준으로 1일 0.1 mg/kg 내지 10 g/kg, 바람직하게는 100mg/kg 내지 1 g/kg이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료, 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법, 식이요법 등과 병행하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서는, 마가목 및/또는 현지초 추출물을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써 골밀도를 개선하는 방법을 제공한다. 상기 개체는 인간을 포함한 각종 포유동물일 수 있다. 마가목 또는 현지초 추출물의 파골세포 분화 억제 활성으로 골흡수를 감소시킬 수 있으며, 골밀도의 개선이란 손실된 뼈를 재생시키는 것을 포함하여 뼈 손실 가능성이 있는 개체(예를 들면, 폐경된 여성, 노인, 호르몬 치료를 받고 있는 환자 등)에서 골밀도 감소를 예방하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서는, 마가목 및/또는 현지초 추출물을 포함하는 골 또는 연골 조직 손상질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 마가목 또는 현지초를 적당한 추출 용매, 바람직하게는 물을 이용하여 추출하는 단계; 여과하여 감압 농축하는 단계; 및 선택적으로, 그로부터 수득되는 추출물의 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 및 희석제 중 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함한다. 마가목과 현지초 추출물의 혼합물의 경우, 상기 방법으로 농축된 추출물을 바람직하게는 1:1의 중량비로 혼합하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물의 연골세포와 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 마가목과 현지초 추출물의 혼합물의 유효량을 접촉시키는 단계를 포함하는, 연골세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 접촉 단계는 손상된 관절 연골 조직에서 채취, 분리된 연골세포의 배양 배지에 상기 조성물을 첨가하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 체외에서 생산된 분화된 연골세포는 세포나 조직의 이식을 통한 생물학적인 방법으로 연골손상 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명의 방법에 의해 생산된 연골세포는 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로써 공지의 방법에 따라 환자의 관절내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드(scaffold)와 함께 이식될 수도 있다 (Kim, G. et al, J. Vet. Med. Sci., 66:263, 2004, Lee,J.W. et al., Yonsei Med. J., 30:41, 2004).
다른 구체예에서, 상기 접촉 단계는 포유동물의 연골 조직 내에 마가목 추출물 또는 혼합 추출물을 포함하는 조성물을 직접 주입하는 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 복부 지방 등에서 적출, 배양한 치유줄기세포 또는 치유재생세포를 성장인자와 함께 환부에 주사하여 체내에서 연골세포 조직의 재생을 유도하는 '재생세포 치료법'에 있어서, 본 발명의 조성물을 함께 주입하여 상기 세포의 연골세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 본 발명의 방법으로 생산된 연골세포를 이용하여 치료할 수 있는 연골손상 질환으로는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 외상에 의한 관절 손상 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분화된 연골세포는 골세포 등 다른 세포로 분화할 우려가 적고, 자가 유래의 세포를 사용하므로 면역학적 거부반응이 없어 보다 안전하게 치료에 이용할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 추가적인 양태에서, 본 발명은 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는, 골질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 "건강 기능성 식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"은 인체의 구조 및 기능에 대해 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 마가목 또는 현지초 추출물을 포함하는 조성물은 골조직 또는 연골조직 손상을 동반하는 질환의 예방 및 개선을 위해 건강기능성 또는 및 음료로 제제화되거나, 각종 식품에 첨가되어 사용될 수 있다.
이러한 건강 기능성 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능성 식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강 기능성 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 보조첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 다른 식품에 첨가되어 사용되는 경우, 첨가 가능한 식품류로는 예를 들어, 음료, 육류, 캔디, 초콜릿, 과자류, 껌, 차, 비타민 복합제, 알코올 음료류, 건강보조식품류 등이 있다.
이때, 식품 또는 음료 중의 상기 조성물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 음료 조성물의 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
이 외에 유용하게는 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물: 예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한적이지는 않으나 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 0 내지 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술 용어는 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 균등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명에 따른 조성물은 마가목 또는 현지초 추출물, 또는 이들의 혼합물을 일정 함량 이상 포함함으로써, 파골세포 억제 또는 연골세포 분화 촉진 활성에 있어서 당업자가 예측할 수 없는 정도로 현저한 효과를 가지며, 천연 물질로 이루어져 인체에 부작용이 거의 없어 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 파골세포의 과다 분화 또는 활성화에 의해 야기되는 질환, 또는 골 또는 연골 조직 손상 질환의 예방, 개선 및 치료 목적으로 사용가능한 의약품 또는 건강기능식품의 제조를 위하여 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 연골세포의 분화를 촉진하는 용도로 사용되어, 연골조직 결손 부위의 재생 및 인공 관절의 제조 목적으로 이용될 수 있다.
도 1은 MG-63 세포주에서 본 발명에 따른 마가목 추출물, 현지초 추출물 및 이들의 1:1 혼합물이 ALP 활성에 미치는 영향을 비교하여 나타낸 그래프이다 (SC; 마가목 추출물 처리군, GN; 현지초 추출물 처리군, SG-Ⅱ; 마가목 추출물 및 현지초 추출물의 1:1 혼합물, EST; 베타-에스트라디올 처리군). (*: p <0.05)
도 2는 본 발명에 따른 마가목 추출물, 현지초 추출물 및 이들의 1:1 혼합물을 농도별로 Raw264.7 세포주에 처리했을 때, TRAP의 활성도에 미치는 영향을 비교한 그래프이다 (NC; 음성 대조군, PC; 양성대조군 (RANKL 50 ng/ml 처리), SC; 마가목 추출물 처리군, GN; 현지초 추출물 처리군, SG-Ⅱ; 마가목 추출물 및 현지초 추출물의 1:1 혼합물).
도 3은 마가목 추출물 및 마가목과 현지초 추출물의 1:1 혼합물 (10, 250 ㎍/ml)과 함께 배양했을 때, Raw264.7 세포의 파골세포로의 분화 정도를 나타낸 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 마가목 추출물, 현지초 추출물 및 이들의 1:1 혼합물을 농도별로 분화를 유도한 ATDC5 연골전구 세포에 처리했을 때, 연골 세포로의 분화 정도를 비교한 그래프이다. (*: p <0.05)
도 5는 마가목 추출물, 현지초 추출물 및 이들의 1:1 혼합물을 ATDC5 연골전구 세포에 농도별로 처리한 후, Alciain blue로 염색시켜 연골세포로의 분화 정도를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 하기 제조예 및 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
재료 및 준비
마가목 (Sorbus commixta, SC)은 옴니허브 (영천, 대한민국)에서, 현지초 (Geranium nepalense, GN)는 대람약업사 (서울, 대한민국)에서 각각 구입하였다.
DMEM,-MEM 및 F-12 배지, 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린-스트렙토마이신(PS)은 Gibco (NY, USA)에서 구입하였으며, LabAssayTM ALP 키트는 Wako (오사카, 일본)에서, receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)은 PeproTech (NJ, USA)에서 각각 구입하였다. 그 밖에 β-에스트라디올, 트랜스페린, 소듐 셀레나이트, 소 인슐린, 아질산나트륨 및 알시안 블루 8GS와 같은 물질은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
마가목 및 현지초 추출물의 제조
추출물을 얻기 위하여 각 시료 (마가목의 경우 열매, 현지초의 경우 잎)를 세척 후, 각 시료 중량의 10배의 증류수를 가하고 100 ℃에서 2시간 동안 환류 추출 후, 여과과정을 3회 반복하였다. 이후 여과하여 얻어진 추출액을 감압농축하여 동결건조 하였다. 각 시료의 수율은 마가목 추출물은 8.10 %, 현지초 추출물은 13.15 % 였으며, 마가목 및 현지초 추출물 시료를 각각 1:1의 비율로 섞어서 혼합시료 (MIX)를 제조하였다.
통계 처리
위의 실험들은 각각 3회에 걸쳐서 반복하여 실험 결과를 얻었으며, 모든 자료는 대조군에 대한 백분율로 계산하고 평균±표준편차로 표시하였다. 스튜던트 t-검정(Student’s t test)을 이용하여 실험군들을 비교 분석하였으며, 통계 방법의 유의 수준은 p-값 < 0.05로 정하였다.
실시예 1. 염기성 포스파타아제( Alkaline phosphatase , ALP ) 활성 및 세포 생존율 측정
ALP는 조골세포에서 생성되는 당단백질로써, 골형성 지표로서 이용되는 세포화학적 표지효소이다. 골과 연골의 형성과 재생을 유도하는 조절인자인 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)에 의해 활성화되어 조골세포의 분화를 촉진하고 콜라겐 합성을 자극하는 것으로 알려져 있다 (Wozney, J. M., et al., "Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities", Science, pp. 1528-1534, 1988).
마가목, 현지초 및 이들의 1:1 혼합시료가 조골세포의 ALP 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 MG-63 세포주에 각각의 시료를 48시간 동안 처리한 후, ALP가 무색의 p-니트로페닐포스페이트를 인산과 노란색의 p-니트로페놀로 분해시키는 원리를 이용하여 세포 내의 ALP 활성을 측정하였다.
방법
1) ALP 활성 측정
인간 조골세포-유사 MG-63 세포주 (서울, 한국세포주은행)는 10 % FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃의 5 % CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 배양용기에 85±5 % 정도 자랐을 때, 트립신을 처리하여 세포를 이탈시키고, 6-웰(well) 배양용기에 각 웰 당 1.5×105개의 세포가 포함되도록 분주하였다. 24시간 후, 각각의 시료(10, 100 및 250 μg/ml)를 함께 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 이때, ALP 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 β-에스트라디올 (10 μM)을 양성대조군으로 사용하였다.
세포를 PBS로 세척하고 트립신을 처리하여 떼어낸 후, 0.2 % 트리톤 X-100을 각각 50 μl 씩 넣고 4 ℃에서 3분간 초음파 추출기를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해액은 4℃에서 14000 rpm으로 20분 동안 원심분리시키고, 상층액을 취하여 단백질을 정량하고 ALP 활성을 측정하였다. ALP 활성 측정 실험은 LabAssayTM ALP 키트를 이용하여 수행하였으며, 405 nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다. 또한 세포 내 단백질을 정량하고 ALP/단백량으로 수치화하여 시료의 비활성(relative activity)을 결정하였다.
결과
각각의 시료들은 농도와 무관하게 ALP 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 1). 그러나 양성 대조군인 β-에스트라디올은 10 μM을 처리하였을 때 ALP 활성을 138.3±5.8 % 증가시켰다.
실시예 2. 타르트레이트 -저항성 산성 포스파타아제( Tartrate Resistant Acid Phosphatas, TRAP ) 양성 염색
TRAP은 파골세포에 의해 분비되는 효소로서 파골세포의 분화 정도를 측정할 때 이용되는 세포 화학적 표지효소이다. 골 흡수작용을 할 때 분비가 증가되어 골 기질의 분해에 관여하며 (신충호, "Clinical Utility of Biological Markers of Bone Turnover in Children and Adolescents", 대한소아내분비학회지, 제6권, 제1호, pp. 4-16, 2001.), ATP, 니트로페닐 포스페이트가 존재할 때 높은 활성을 갖는다. 한편, RANKL은 파골세포의 골 파괴 활성을 증대시키고 세포 생존력을 높이는 효과가 있어서 M-CSF와 함께 파골 세포 분화에 필수적인 사이토카인으로 알려져 있다.
본 실험에서는 마가목, 현지초 추출물 및 이들의 1:1 혼합시료가 마우스 대식 세포주 유래인 RAW 264.7 세포주의 파골세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 6일 동안 RANKL을 처리하여 세포를 분화시키면서 각 시료를 함께 처리하여 TRAP 염색에 의해 관찰하였다.
방법
마우스 단핵구/대식세포인 Raw 264.7 세포주 (서울, 한국세포주은행)는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배지를 사용하여 37 ℃의 5 % CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 배양용기에 85±5 % 정도 자랐을 때, 트립신 처리하여 세포를 이탈시키고, 96-웰 배양용기에 각 웰 당 1×103개의 세포가 포함되도록 분주하였다. 24시간 후, Raw 264.7 세포의 파골세포로의 분화를 촉진하기 위해 50 ng/ml RANKL을 처리하였으며, 각각의 시료를 6일간 함께 배양하였다.
시료 처리 6일 후, TRAP 염색을 하기 위해 세포의 배지를 제거한 후, 고정 용액(fixing solution) (시트르산 용액, 아세톤, 37 % 포름알데히드)으로 10분간 세포를 고정시켰다. 0.1% Triton X-100을 넣고 1분 후에 제거하고 기질 용액 (50 μl Fast Garnet GBC Base solution, 50 μl 아질산 나트륨 용액, 4.5 ml 증류수, 50 μl 나프톨 AS-BI 인산 용액, 200 μl 아세테이트 용액, 100 μl 타르트레이트 용액)을 이용하여 고정시킨 세포에 분주하고 37 ℃에서 40분 동안 반응시켜 상기 세포를 염색시켰다. 현미경으로 분화된 파골 세포를 관찰하고, 염색된 다핵성 세포(3개 이상의 핵을 갖는 세포) 수를 counting하여 TRAP 활성을 측정하였다.
결과
파골세포가 분화될수록 세포 형태가 변하고 핵의 수가 증가한다. 따라서 모양이 변하고 핵이 많아진 파골세포 수가 감소할수록 약물의 효과가 더 크다는 것을 나타낸다. 본 실험의 경우 3개 이상의 핵이 생긴 세포수를 세어서 각 샘플의 파골세포 분화 정도 및 약물의 효과를 예측하였다.
관찰 결과, 세 시료 모두 농도 의존적으로 TRAP 활성이 감소하는 경향을 보였다. 마가목은 250 μg/ml의 농도에서 대조군과 비교하여 TRAP 활성을 43.0±19.9 % 억제하였으며, 특히, 마가목과 현지초의 1:1 혼합시료는 100 및 250 μg/ml의 농도에서 23.0±2.9 % 및 95.0±3.8 %를 감소시키는 것으로 보아 그 효과가 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 현지초 추출물은 10 μg/ml의 저농도에서 TRAP 활성에 대하여 높은 감소율을 보였고, 100 μg/ml의 농도에서는 거의 TRAP 활성을 완전히 감소시켰다 (도 2).
실시예 3. 알시안 블루 ( Alcian - blue ) 염색법
마가목, 현지초의 각각 추출물 및 이들의 1:1로 혼합한 시료가 연골세포 분화 촉진에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 연구를 수행하였다. 알시안 블루 염색 시, 연골세포로 분화가 이루어진 경우 교원질이 염색되면서 푸른색을 띠게 되는 원리를 이용하였다.
방법
연골세포의 전구체인 ATDC5 세포(Riken Cell Bank, Japan 에서 구입)구입처 기재요망)를 DMEM과 F-12 가 1:1로 섞여 있는 배지에 5 % FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 혼합된 배지를 사용해서 37 ℃의 5 % CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 배양용기에 75±5 %정도 채워지면 트립신을 처리하여 세포를 이탈시키고, 24-웰 배양용기에 각 웰 당 2×104 개의 세포가 포함되도록 분주하였다. 24시간 후, 10 μg/ml 트랜스페린 및 3×10-8 M 소듐 셀레나이트가 포함된 배지에서 14일 동안 세포 분화를 유도하였으며, 그 기간 동안 각각의 시료를 10, 100 및 250 μg/ml의 농도로 함께 처리하였다. 양성 대조군으로는 10 μg/ml 소 인슐린을 사용하였다.
14일 후, 알시안-블루 염색법을 실시하기 위해 세포의 배지를 제거하고 1×인산 완충 염수 (PBS)로 세척한 후, 95 % 메탄올로 세포를 고정시키고 1 % 알시안-블루 8GS로 16시간 염색하였다. 염색 용액 제거 후 3 % 아세트산으로 30초 동안 세 번 세척하고 염색 정도를 확인하기 위하여 현미경으로 관찰하고 사진을 찍었다. 10 % 아세트산으로 염색을 녹여 낸 후 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과
실험 결과, 마가목 추출물 및 혼합시료는 농도 의존적으로 연골세포 분화를 촉진하였다 (도 4). 마가목은 250 μg/ml의 농도에서 대조군과 비교하여 연골세포 분화를 83.7±2.5 % 증가시켰으며, 이는 소 인슐린을 처리한 양성 대조군 보다도 높은 증가율 (31.2±2.0 %)을 가지는 것이다. 현지초 추출물은 100ug/ml 농도에서 대조군과 비교하여 연골세포 분화를 14.1±1.4 %(음성대조군과 비교) 유도하였다. 또한 마가목 및 현지초의 1:1 혼합시료는 100 ug/ml 농도에서 대조군과 비교하여 연골세포 분화를 31.9±1.6 % 유도하여, 마가목 추출물 단독 또는 현지초 추출물 단독으로 사용하였을 때 보다 높은 값을 보였고, 250 μg/ml의 농도에서 대조군과 비교하여 연골세포 분화를 70.92±1.23 % 유도하였다.
이하 본 발명의 조성물을 포함하는 의약 및 건강기능성 식품의 일부 제제예가 제시되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 과립, 현탁물, 용액, 캡슐, 정제 등의 형태로, 가능한 가장 우수한 제제를 얻기 위하여 당해 기술분야에 알려진 모든 방식으로 제조될 수 있다.
제제예 1. 경구 제제- 정제의 제조
구성 성분 함량(㎎/정제)
본 발명의 추출물 200
유당 150
히드록시프로필셀룰로오스 15
카르복시메틸셀룰로오스 칼슘 20
스테아린산 마그네슘 5
글리세린 2
히드록시프로필메틸셀룰로오스 6
산화티탄 2
본 발명의 추출물, 셀룰로오스 유도체 및 유당을 혼합한다. 얻어진 선혼합물(premix)에 스테아린산 마그네슘과 글리세린을 첨가하고, 혼합한다. 상기 최종 혼합물을 통상의 정제 제조 방법에 따라서 타정하고, 최종적으로 산화티탄으로 피복한다. 1일 3회, 1회 1정씩 복용한다.
제제예 2. 경구 제제 - 과립제의 제조
구성 성분 함량(㎎/ 사쉐 )
본 발명의 추출물 400
부형제 적정량
미세결정 셀룰로오즈 65
옥수수 전분 15.5
소르비톨 2250
폴리비닐피롤리돈 47.5
시트르산 10
아스파탐 32
향미제 180
본 발명의 추출물, 미세결정 셀룰로오즈 및 옥수수 전분을 혼합한다. 이 혼합물을 물과 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 결합제 용액을 사용하여 니딩(kneading)한다. 상기 혼합물이 습윤하게 되면, 2 mm 체를 통해 과립화한다. 과립을 건조시키고, 이를 강제로 0.8 mm 체를 통과하게 하여 사분한다. 얻어진 과립 분말을 소르비톨, 시트르산, 아스파탐 및 적당한 향미제와 혼합한다. 상기 과립을 사쉐(sachet)에 채운다.
제제예 3. 주사용 제제( injectable formulation )의 제조
구성 성분 함량( mg )
본 발명의 추출물 10
소듐 메타비설파이트 3.0
메틸파라벤 0.8
프로필파라벤 0.1
주사용 멸균증류수 2 ml까지 적정량
상기 재료들을 혼합하여 통상의 방법으로 최종 주사액 부피가 2 ml이 되도록 제조하고 앰플에 충전한다. 최종 용액은 멸균 및 비발열성이어야 한다. 또는, 상기 주사용 제제는 동결 건조된 분말 상태로 제조하여 사용 전에 주사용 매질에 용해시켜 투여될 수 있다.
제제예 4. 건강음료의 제조
구성 성분 함량(g)
본 발명의 추출물 1
구연산 1
올리고당 100
매실농축액 2
타우린 1
정제수 900 ml까지 적정량
통상의 건강음료 제조 방법에 따라 상기 성분들을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 제조된 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장보관한다. 본 제제예에서는 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 비율로서 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (10)

  1. 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 파골세포의 분화 억제용 약학적 조성물.
  2. 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 연골세포의 분화 촉진용 약학적 조성물.
  3. 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 뼈 또는 연골 조직의 재생 또는 보호용 약학적 조성물.
  4. 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 골절, 골다공증, 골관절염, 치주질환, 퇴행성 연골 및 뼈 파괴 질환, 류마티스성 질환, 골종양, 파제트씨병, 골 연화증, 다발성 골수종, 백혈병, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 외상에 의한 관절 또는 뼈의 손상, 암세포의 골전이에 의한 뼈의 손상, 연골손상, 골용해, 뼈의 기형, 고칼슘혈증, 신경압박증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 병태의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합 용매, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산, 디에틸에테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 추출용매를 사용하여 추출된 것인 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 마가목 추출물과 현지초 추출물을 1:2 내지 2:1의 중량비로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  7. 포유동물의 연골세포와 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 마가목 추출물 및 현지초 추출물의 혼합물을 포함하는 조성물의 유효량을 접촉시키는 단계를 포함하는, 연골 세포의 분화를 촉진하는 방법.
  8. 마가목 추출물, 현지초 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 골밀도 개선용 건강 기능성 식품 조성물.
  9. 제8항의 조성물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는, 골질환의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품.
  10. 제9항에 있어서, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료의 형태인 것인 건강 기능성 식품.
KR1020100081478A 2010-08-23 2010-08-23 마가목 및 현지초 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물(ｓｇ-ⅱ) KR101249930B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100081478A KR101249930B1 (ko) 2010-08-23 2010-08-23 마가목 및 현지초 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물(ｓｇ-ⅱ)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100081478A KR101249930B1 (ko) 2010-08-23 2010-08-23 마가목 및 현지초 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물(ｓｇ-ⅱ)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120018556A true KR20120018556A (ko) 2012-03-05
KR101249930B1 KR101249930B1 (ko) 2013-04-03

Family

ID=46127783

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100081478A KR101249930B1 (ko) 2010-08-23 2010-08-23 마가목 및 현지초 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물(ｓｇ-ⅱ)

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101249930B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101627705B1 (ko) * 2014-05-29 2016-06-08 숙명여자대학교산학협력단 선이질풀의 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR20240085299A (ko) 2022-12-07 2024-06-17 강원대학교산학협력단 백상산 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물
KR102573243B1 (ko) 2023-04-23 2023-08-30 윤유석 신경병증성 통증 치료 또는 예방용 enu 약학 조성물

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100697319B1 (ko) * 2005-05-30 2007-03-20 한불화장품주식회사 플라보노이드 함량이 증가된 마가목추출물의 제조방법과이를 함유하는 화장료 조성물
JP2009256270A (ja) * 2008-04-18 2009-11-05 Maruzen Pharmaceut Co Ltd インスリン様成長因子−１発現促進剤

Also Published As

Publication number Publication date
KR101249930B1 (ko) 2013-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101686490B1 (ko) 흑미 추출물을 유효성분으로 하는 골대사 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR100813222B1 (ko) 항비만 효능의 약용식물 추출물
KR101269208B1 (ko) 사우치논을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성의 예방 또는 치료용 조성물
KR100967814B1 (ko) 자초추출물로부터 분리되는 시코닌을 유효성분으로함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물
KR101249930B1 (ko) 마가목 및 현지초 추출물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물(ｓｇ-ⅱ)
KR101039053B1 (ko) 물레나물 추출물을 유효성분으로 하는 골질환 예방 및 치료용 조성물
KR102070312B1 (ko) 총백을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물
KR101071044B1 (ko) 황기, 복령 및 적소두의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 조성물
KR101193540B1 (ko) 황기，계지 및 황백의 혼합생약재 추출물을 포함하는 골다공증 및 골질환 예방 및 치료용 조성물
KR102106401B1 (ko) 마치현을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물
KR102372440B1 (ko) 비쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 골대사성 질환으로 유발된 골소실 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
KR100823354B1 (ko) 복숭아 추출물을 함유하는 골 질환의 예방 및 치료용조성물
KR101120499B1 (ko) 골 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR101529493B1 (ko) 조골세포 분화 촉진과 파골세포의 분화 억제 활성을 갖는 자소자 추출물 및 상기 자소자 추출물을 유효성분으로 함유하는 제품
KR101344189B1 (ko) 발효 또는 미발효된 금은화 및 진피 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 조성물
KR101885667B1 (ko) 조골세포 분화를 촉진하며 지방세포 분화를 저해하는 벼 추출물 및 그 용도
KR100856351B1 (ko) 천마추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및치료용 조성물
KR102448274B1 (ko) 보골지 추출물의 조다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20200125154A (ko) 몰로키아 추출물을 포함하는 비만 및 대사성질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물
KR102255000B1 (ko) 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20170140651A (ko) 하니베리 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
KR102410703B1 (ko) 석위 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR102230958B1 (ko) 수분초를 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물
KR102106400B1 (ko) 지유를 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물
KR20120107025A (ko) 한약재의 추출물과 분획물을 포함하는 항비만 및 항당뇨 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160303

Year of fee payment: 6