KR100856351B1 - 천마추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및치료용 조성물 - Google Patents
천마추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 천마추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 골다공증의 예방 및 치료용 조성물은 부작용이 없을 뿐 아니라, 조골세포의 증식을 촉진하고, 파골세포의 형성을 억제하여, 골화 작용을 촉진함으로써, 골다공증 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
골다공증, 천마추출물, 조골세포, 파골세포
Description
도 1은 천마추출물의 조골세포의 증식 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 천마추출물의 일차 조골세포의 ALP 활성 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 천마추출물의 조골세포에 의한 무기질화 골 결절 형성 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 천마추출물의 파골세포에 의한 골 흡수 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 천마추출물의 파골세포 형성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
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본 발명은 일반적으로 골다공증 치료제 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 천마추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골다공증은 다발성 골수증, 골관절염 등의 골 관련 질병들 중 가장 흔한 골격계 질환으로서, 일반적으로 골절의 증가 및 골 강도의 감소로 특징 된다. 정상적인 골의 기능을 위해서는 조골세포에 의한 골의 형성과 파골세포에 의한 골의 파 괴가 동시에 일어나는, 계속적 골의 재구축 과정이 필요하다.
그러나, 골 흡수와 골형성으로 이루어지는 재구축 과정에서 그 균형이 골 흡수로 치우치게 되면, 파골세포에 의한 골 흡수가 증가하게 되고, 이로 인해 골량의 감소와 골강도의 약화가 일어나 결국 골절 위험이 매우 증가된 골다공증이 유발되게 되는 것이다 [Sakai et al, 1998]. 이러한 골다공증은 고령 인구의 증가와 함께 골다공증에 의한 골절환자도 급격히 증가하고 있으며, 특히 노인환자에서의 엉덩이뼈 골절은 환자의 생명을 위협하는 매우 심각한 문제이다 [Yamaguchi et al., 1999].
이러한 골다공증의 치료제는 크게 조골세포와 관련된 골 형성 촉진제와 파골세포와 관련된 골 흡수 억제제로 구분될 수 있다.
조골세포는 중간엽세포 유래의 세포로서, 골 메트릭스를 합성하고 이를 축적시킴으로써 골 질량을 증가시킨다 [Aubin, 2001]. 골을 생성하는 이러한 골모세포의 형성과정은 복잡한 과정으로서 크게 다음의 세 단계로 구분될 수 있다: 1) 골형성 전구세포의 형성 및 증식; 2) 세포외 메트릭스의 발달 및 성숙; 3) 메트릭스의 미네랄화 [Benayahu, 2000; Aubin, 2001]. 골 형성에 있어서는 골모세포의 형성, 증식 및 활성이 가장 중요한 것으로서, 따라서, 이에 영향을 주는 다양한 후보물질의 효능이 시험되었다 [Hwang et al., 2005].
파골세포는 조혈세포에서 유래된 골 흡수에 관여하는 세포로서, 골의 재형성에서 중요한 역활을 한다. 파골세포에 의한 골 흡수는 파골세포 전구체로의 분화, 융합에 의한 다핵 성 파골세포의 형성, 및 골 흡수를 위한 성숙한 파골세포의 활성 화를 포함하는 여러 단계로 구성된다 [Jimi et al., 1999]. 성숙한, 다핵성 파골 유사 세포(OCL)는 골의 재흡수 동안에 정상적 액틴 세포골격구조, 파상의 가장자리, 및 산성 조건을 유지한다 [Suda et al., 1996]. 그러므로, 다수의 항-골다공증 제제의 효능은 골 흡수의 방해를 위한 파골세포 형성의 방해 및 피트(pit)형성 분석과 같은 파골세포의 활성화에 미치는 영향의 관점에서 분석되었다 [Suda et al., 1997; Hwang et al., 2005].
골 흡수 억제제로서는 에스트로겐 및 프로제스테론과 같은 여성호르몬, 비스포스포네이트, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 칼슘, 칼시토닌, 및 비타민 D 유도체 등이 있으며, 골형성 촉진제로서는 동화성 스테로이드, 및 부갑상선 호르몬제 등이 사용되고 있다.
그러나, 비스포네이트는 흡수율이 낮으며, 위장관 등에 부작용이 있고, 여성호르몬 역시 장기간 투여시 유방 및 자궁암 유발 가능성 등의 단점으로 인하여 이를 개선하기 위한 연구와 신규 목표 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다 [Goltzman, 2002; Gowen et al., 2000; Rodan and Martin, 2000].
나아가, 현재 대부분의 골다공증 치료제는 골 흡수 제해제로서, 이는 골의 전환율을 저하시킴으로써 그 효과를 나타내는데, 이미 골 소실이 많이 진행된 경우나, 골 전환율이 높은 환자의 경우 및 장기적인 골절예방을 고려하면, 골 형성 촉진제에 대한 필요성이 높아지고 있다. 이에, 기존의 불소화합물 및 부갑상선 호르몬 이외에도 골 형성을 담당하는 조골세포를 표적으로 하는 연구가 많이 진행되고 있으나, 현재, 골형성 촉진제로서 미국식품의약국의 승인을 받은 것은 부갑상선호 르몬이 유일하다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래 골다공증 치료제의 문제점을 인식하여 완성된 것으로서 종래의 치료제를 대체할 수 있으며 종래의 치료제와는 달리 파골세포의 활성을 현저하게 억제함과 동시에 골의 생성을 촉진하는 조골세포를 활성화시키는, 안전한 천연물질을 탐색하던 중, 천마 (Gastrodia elata Blume)가 골다공증의 치료에 우수한 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 골 흡수의 억제 및 골 형성의 촉진 효과를 동시에 나타내어 골다공증의 치료에 효과적으로 사용될 수 있는, 천마추출물 및 이러한 천연물질을 유효성분으로 포함하는 골다공증 치료 및 예방용 조성물의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적달성을 위해, 본 발명은 골다공증 치료 또는 예방용 천마(Gastrodia elata Blume) 추출물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 추출물이 물 또는 알콜, 또는 이들의 혼합 용매를 추출용매로 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 추출물을 제공한다.
본 발명은 나아가 상기 추출물이 물을 용매로 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 추출물을 제공한다.
본 발명은 나아가 상기 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 나아가 상기 조성물이 식품, 식품첨가제 또는 음료로 제공되는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 천마 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
천마는 뽕나무버섯균과 공생하는 난과식물 (蘭科植物)의 일종으로 학명은 Gastrodia elata Blume이며, 생약명은 Gastrodiae Rhizoma (GER)이다.
천마는 주로, 한국, 중국, 일본 등지에 분포하며, 우리나라를 비롯한 동양권에서는 고혈압, 뇌졸중, 두통, 간질, 진통, 현기증, 신경성질환 등 주로 머리 쪽의 질환에 효능이 있는 것으로 알려져 왔으나 [Hsieh et al., 2000; Kim et al., 2001; Ha et al., 2001; Yu et al., 2005], 이의 골다공증의 치료 및 예방에 대한 효과는 본 발명 이전에는 전무하다.
천마는 우리나라의 제주도와 남부지방 및 중국 등지에서 자라며, 일부 지역에서 재배되기도 한다. 천연 또는 재배종 모두가 본 발명에 사용될 수 있으며, 자연상태, 반건조, 건조 등의 가공된 천마의 추출물도 본 발명의 범위에 포함된다.
나아가, 천마 전체 또는 일부, 예컨대 천마의 잎, 가지 뿌리, 열매, 줄기, 꽃 및/또는 껍질 등의 본 발명의 추출물 제조에 사용될 수 있으며, 특히 땅속 덩이줄기(地下塊莖)가 사용된다.
본 발명의 천마 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다(예를 들면, Nomura T, 1988 등을 참조). 즉, 천마의 일부 또는 전체를 물 또는 유기용매로 추출 및/또는 분획하여 제조할 수 있으며, 예컨대 천마의 줄기 등 또는 이의 분쇄물에 용매를 가한 후 추출물을 수득하는 방법이다. 예를 들면, 천마에 용매를 1: 1 내지 1: 20 중량비로 가열 순환식 추출탱크에 넣고, 정제수 또는 식용 알콜을 가하여 80 내지 100℃에서 6-24시간 정도 추출한 후 여과하여 여액을 얻고, 잔여물에 다시 정제수 또는 식용 알콜을 가하여 동일한 과정을 수회 반복할 수 있다. 여액을 합하여, 그 자체로 사용하거나, 이를 진공 농축기로 감압하에서 농축한 후, 열풍 또는 동결 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.
상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 5의 저가 알콜 또는 알콜희석수일 수 있으며, 상기 저가 알콜은 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 알콜희석수는 알콜을 50 내지 99 부피 %로 물에 희석한 것일 수 있다. 또한 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획시 용매는 2종이상 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하여 각 용매 추출물을 제조할 수 있다. 추출물 제조온도는 4 내지 120 ℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나 10분 내지 30일 일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 또는/및 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다.
일예로, 천마 추출물은 천마 100 g당 물 0.1 내지 10ℓ를 가한 후 추출하는 방법으로 실시된다. 추출 온도는 80 내지 150℃일 수 있으나, 이에 한정되진 않는다. 추출시간은 한정되진 않으나 30분 내지 수일 일 수 있으며, 통상의 추출기기나 초음파분쇄 추출기를 이용할 수 있다. 제조된 추출액은 이후 감압 여과 및 동결건조하여 사용될 수 있다.
다른 일예로 천마 100 g당 에탄올 0.1 내지 5ℓ를 가해 얻어진 천마 에탄올 추출물을 농축하여 얻은 농축물 10 내지 15 g을 물 100 내지 1000 ㎖에 현탁하고, 헥산 100 내지 1000 ㎖를 가한 후 추출하여 천마 헥산 분획추출물을 얻어낸다. 상기 천마 헥산 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 메틸렌 클로라이드 100 내지 1000㎖ 를 가한 후, 추출하여 천마 메틸렌 클로라이드 분획추출물을 얻는다. 상기 메틸렌 클로라이드 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 에틸아세테이트 100 내지 1000㎖를 가한 후, 추출하여 천마 에틸아세테이트 분획추출물을 얻는 방법으로 실시된다. 또한, 상기 천마 에틸아세테이트 분획추출물을 제거한 후, 나머지 물층에 다시 부탄올 100 내지 1000㎖를 가한 후, 추출하여 천마 부탄올 분획추출물을 얻을 수 있으며, 이 때 상기 부탄올 분획추출물을 제외한 물 층을 천마 물추출물로 얻을 수 있다. 상기 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트, 또는 부탄올로 추출할 경우 추출 온도는 20 내지 40℃일 수 있으나, 이에 한정되진 않으며, 추출시간도 한정되진 않으나 30분 내지 20 시간일 수 있으며, 통상의 추출기기나 초음파분쇄 추출기를 이용할 수 있다. 제조된 추출액은 이후 감압 여과 및 동결건조하여 용매를 제거한다.
또 다른 일예로, 천마 추출물은 천마 100 g당 메탄올 0.1 내지 5 ℓ를 가하 여 추출하여 메탄올 추출물을 제조한다. 상기 메탄올 추출물은 추후 헥산 또는 메틸렌클로라이드를 가하여 각 용매별 분획물을 수득함으로써 헥산 추출물 또는 메틸렌클로라이드를 제조한다. 이후 잔류물에 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가하여 분획함으로써 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물을 각각 제조하며, 상기 용매에서 추출되지 않은 물 분획은 물 추출물로 제조된다. 상기 용매를 이용한 분획시, 추출대상물에 대하여 용매를 1: 0.1 내지 10 부피비로 가하여 실시된다.
정제 수(물) 및/또는 알콜을 유기용매로 하여 추출된 본 발명에 따른 천마 추출물은 시험관내 실험 및 골다공증이 유발된 동물에서, 골다공증의 치료 및 예방에 대하여 우수한 활성을 나타낸다. 본 발명의 일 실시예에서는 정제수를 사용하여 추출한 천마추출물의 제조 및 이의 효능만을 제시하였으나, 이는 단지 예시적인 것으로서, 정제수이외에, 알콜 단독 또는 이를 정제수와 조합으로 사용하여 추출한 추출물도 골다공증의 치료 및 예방에 대하여 활성을 갖으며, 본 발명의 범위 내에 속한다.
구체적으로 본 발명의 조성물은 시험관내 실험에서 조골세포의 증식, 형성, 분화 및 활성을 증가시켜 이로 인한 조골세포에 의한 골형성 증가, 및 파골세포의 형성 및 활성을 현저히 억제하여 이에 의한 피트 형성의 현저한 감소를 유발하였다. 나아가 동물실험에 있어서도, 골중량, 골밀도, 골무기질을 증가시키며 골다공증으로부터 유래되는 골중량, 골밀도 및 골무기질 함량의 감소를 억제하는 우수한 효과를 나타냈다. 이러한 효과는 종래 골다공증 치료제로서 널리 사용되는, 골흡수 억제제인 질소함유 비스포스포네이트인 알랜드로네이트(Alendronate)(FOSA)[상 표명 FOSAMAX]보다 우수하거나 이에 필적하는 것으로서, 본 발명에 따른 천마추출물을 포함하는 조성물의 우수성을 입증하는 것이다.
본 발명의 천마추출물을 포함하는 골다공증 치료 또는 예방용 조성물은 천마추출물 이외에 제형 및 사용방법에 따라 약학적으로 사용가능한 담체나 부형제를 부가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 조성물 단독으로 또는 골다공증 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다. 이 경우 골다공증 조성물내 유효성분의 함량은 0.001 내지 99 중량% 일 수 있다. 조성물내 유효성분의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우 효과적인 효능을 위해선 다량의 투여가 필요할 수 있으며, 99 중량% 초과하는 경우 사용량에 비해 효능이 일정할 수 있어 비경제적일 수 있다. 그러나 바람직하기로는 골다공증 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절하는 것이 좋다.
상기 약리학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제는 제형에 따라 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제를 사용할 수 있다. 대표적인 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라틴 및 생리식염수가 있다.
본 발명의 골다공증 치료 및 예방 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 이의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으므로 하기 기술한 바에 한정되는 것은 아니다. 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제 (LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS) 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물의 투여량 또는 사용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 바람직하며, 예컨대 1일 유효 투여량은 통상적으로 성인(70kg)의 경우, 0.1 내지 1000mg/kg이며, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있다.
일반적인 골다공증 치료제들이 동물실험에서의 체중당 유효량의 3~4배 정도가 성인 권장량으로 실제 사용되고 있어, 본 발명의 예시적 구현예에 따르면, 천마추출물 125mg/kg 투여군을 시작으로 모든 투여군에서 일관성 있는 약효가 인정되었으므로, 실제 사람에서 유효 용량은 대략 375 ~ 500mg 정도로 예상되나, 이로 한정하는 것은 아니다.
투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물은 그대로 경구투여하는 것 이외에, 임의의 음식물에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.
본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물은 우수한 골다공증 예방 및 치료 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 의한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
이에 따라, 천마 추출물을 포함하는 조성물은 골다공증의 예방 및 치료에 효과가 있는, 식품의 주, 부원료 및 식품 첨가제, 기능성 건강기능 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본 발명의 천마 추출물을 포함하는 건강 기능 식품으로는 약제, 식품 및 음료 등을 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민복합체, 건강보조 식품류 등을 들 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있다.
이때, 식품 또는 음료 중의 천마 추출물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 50중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20중량%로 할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 천마 추출물과 함께 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 천마 추출물을 포함하는 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수성분으 로서 천마 추출물을 함유하는 외에는 액체 성분에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당; 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올을 들 수 있다. 상술한 것 외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 바우디오시드A, 글리시르히진(glycyrrhizin) 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스프르탐 등)을 사용할 수도 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 건강음료 조성물 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
또한 상기 외 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 건강기능식품은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그다지 중요하진 않지만 건강기능식품 100중량부당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택하는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1> 천마 추출물의 제조
건조 천마 (대한민국 서울, 경동시장에서 구입) 2kg을 잘게 파쇄하여, 이를 4000ml 에 넣고 환류 하에서 12시간 동안 100℃로 가열하여 충분히 달인 후, 이를 흡입여과 하여 추출액을 준비하였다. 여과 후 남은 잔류물에 대하여 동일한 추출과정을 추가로 2회 반복하였다. 추출액을 모두 모아, 회전식 진공증발기 (N-N type; LAB Camp, Dajeon, Korea)로 감압/농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결건조기(PVTFD10A; ilShin Lab., Seoul, Korea)를 사용하여 동결 건조시켜 826.4g(수율 약 41.31%)의 물 추출 동결건조물을 얻은 후, 투여 시 이를 멸균 증류수에 적정량을 녹여 사용하였다. 상기 천마 추출물은 사용 시까지 빛으로부터 차단되어 4℃에서 보관하였다.
<실험예 1> 천마추출물이 조골세포의 증식, 활성 및 형성에 미치는 영향
다음과 같은 실험을 실시하여, 본 발명에 따른 천마추출물이 조골세포 미치는 영향을 증식, 활성 및 형성 측면에서 조사하였다. 본 실험예의 실험에서, 대조군으로서는 천마추출물을 첨가하지 않은 멸균증류수(매체대조군)를 사용하였다.
1) 세포배양 및 실험에 사용된 시약
세포배양에 사용된 최소기본알파변형배지 (Minimal Essential Medium alpha Modification,α-MEM), 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 페니실린, 스트렙토마이신, 및 트립신-EDTA는 모두 Gibco-BRL사(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 조골세포의 시험에 사용된, 아스코르브산, β-글리세로포스페이트 및 ALP 효소분석에 사용된 모든 시약 및 알리잘린 레드-S(Alizalin Red-S, AR-S) 염색약과 파골세포의 시험에 사용된 1,25(OH)2D3, 덱사메타손, TRAP 염색키트, 및 기타 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 세포는 다른 언급이 없으면 습식 조건, 37℃로 5% CO2의 배양조건하의 배양기 (incubator)에서 배양하였다.
갓 태어난 ICR 마우스는 Biolink Co.(대한민국)에서 구입하였으며, 6주령의 ddY 마우스는 SLC (일본)에서 구입하였다.
2) 조골세포의 직접분리 배양법
6주령의 ICR 마우스의 두개관(頭蓋冠)의 일부를 절제하여, 0.2%의 콜라게나제를 사용하여 골 주위의 성분을 깨끗이 떼어낸 후, 클린 벤치로 옮기고, 미리 얼음에 넣어 두었던 페니실린 100 유니트/㎖와 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 함유하는 α-MEM에 넣어 1분간 강하게 진탕하여 조골세포가 배지로 분리되어 나오게 하였다. 얼음에 5분간 방치한 후 세포 현탁액을 800 g에서 3분간 원심분리하였고 침전된 세포를 페니실린 100 유니트/㎖와 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 10% FBS를 함유하는 α-MEM의 배양배지에 현탁하였다. 수득한 세포는 10% FBS를 포함하는 α-MEM 배지 중에서 무성할때까지 증식시켰다 [Hwang et al., 2005]. 이후, 상기 세포를 0.25% 트립신 (trypsin) 용액으로 처리하여 1x105 세포/ml의 농도로 계대배양하였다. 24시간 후에, 상기 세포의 배지를 아스코르브산(50㎍/ml) 및 β-글리세로포스페이트(10mM)를 포함하는 분화용 배지로 갈아주고, 그 후 매 3일마다 배지를 교환하였다. 세포는 습식 조건, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 각 실험에 사용하기 직 전 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 수확하였다.
3) 통계분석
모든 데이터는 평균± 표준편차(SD)로 나타냈다. 통계 분석은 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test (MW test) with SPSS for Windows (Release 6.1.3., SPSS Inc., USA)를 이용하여 수행하였으며, 매체 대조군에 대한 백분율 변화(PC)는 하기의 식으로부터 계산하였다:
PC vs 매체 대조군(%)= [(시험군의 데이터-매체 대조군의 데이터)]/매체 대조군의 데이터] x 100.
4) 천마추출물의 농도에 따른 조골세포 증식 실험
상기 2)에서 준비한 세포를 96-웰 플레이트에 1x104 세포/웰로 접종하고 상기 실시예 1에서 수득한 천마 추출물을 10-8, 10-7, 10-6 g/ml의 농도가 되도록 각 농도별로 6개의 웰에 첨가한 후, 3일간 배양하였다. 이어서, 헤마토사이토미터를 사용하여 현미경하에서 각 웰의 조골세포 수를 측정하여 각 농도에서의 조골세포 수의 변화를 대조군과 비교하였다. 같은 농도의 천마추출물로 처리한 6개 웰의 세포의 수를 평균하였다.
결과는 도 1에 기재하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 천마 추출물 처리군에서 대조군에 비해 유의성(p<0.05) 있는 용량의존적인 조골세포 증식의 촉진이 관찰되었다. 구체적으로 10-8, 10-7, 10-6 g/ml 처리군에서 매체대조군에 비햐여 세포 수에 있어 각각 9.80, 23, 53 및 39.2%의 증가를 나타내었다.
이는 본 발명의 천마 추출물이 골형성을 담당하는 조골세포의 직접적 증식 촉진 효능을 증명하는 것이다.
5) 조골세포의 ALP(Alkaline
phosphatase
) 활성 검색
조골세포는 ALP 활성을 나타내므로, 본 발명에 의한 천마 추출물이 조골세포에서 ALP 활성에 미치는 영향을 하기와 같은 방법으로 측정하였다.
상기 3)의 세포증식 실험에서와 동일한 세포 수의 조골 세포주에 시험 물질을 동일한 농도로 처리하고 동일한 조건에서 3일간 배양하였다. 이어 세포를 1mM MgCl2를 포함하는 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)중의 0.05% 트라이톤 X로 처리한 후, 1000 x g에서 5분간 원심분리하여 ALP 활성검색에 필요한 시료를 수득하였다.
한편, ALP가 p-니트로페닐포스페이트 (p-nitrophenylphosphate)를 p-니트로페놀 (p-nitrophenol)과 포스페이트 (phosphate)로 분해시키는 것을 이용하여 405 nm에서의 흡광도의 변화를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다. 단백질의 농도는 BioRad 단백질 분석키트를 사용하였다.
결과는 도 2에 기재하였으며, ALP 활성은 PNP/㎍ 단백질/분으로 나타냈다. 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 천마 추출물 처리군에서 매체 대조군에 비해 유의성(p<0.01) 있는 용량의존적인 ALP 활성의 증가가 관찰되었다. 구체적으로 10-8, 10-7, 10-6 g/ml 처리군에서 매체대조군에 비하여 ALP의 활성에 있어 각각 29.10, 35.78 및 37.21%의 증가를 나타내었다.
ALP는 조골세포의 분화 및 활성 증가에 의해 방출되는 효소로 이러한 ALP의 활성증가는 조골세포 활성 및 증가와 직접적으로 연관되어 있으므로, 본 발명의 천마 추출물에 의한 ALP 활성의 증가는 직접적인 조골세포의 분화 및 활성증가에 의한 골형성 촉진효과를 증명하는 것이다.
6)
골결절
(bone nodule) 형성 촉진 측정
본 발명에 의한 천마 추출물이 무기질화 골결절 형성에 미치는 영향을 하기와 같은 방법으로 측정하였다.
상기 2)에서 준비한 세포를 12-웰 플레이트에 1x105 세포/웰로 접종하고 상기 실시예 1에서 수득한 천마 추출물을 10-8, 10-7, 10-6 g/ml의 농도가 되도록 각 농도별로 6개의 웰에 첨가한 후, 14일간 배양하였다. 이어서, 세포를 10%의 포르말린으로 고정하고, AR-S를 사용하여 공급자의 방법대로 염색하고 10% 세틸피리디니움 클로리드 용액에서 30분간 처리하였다. 방출된 AR-S의 양은 562nm에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다.
결과는 도 3에 기재하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 천마 추출물 처리군에서 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 용량의존적인 골결절 형성의 증가가 관찰되었다. 구체적으로 천마 추출물 10-8, 10-7 및 10-6g/ml 처리군에서는 매체 대조군에 비해 각각 27.04, 90.02 및 99.45%의 증가를 나타내었다.
이러한 골결절 형성 시험은 조골세포에 의한 최종적인 골형성 정도를 평가는 실험으로, 골결절 형성의 증가는 본 발명의 천마 추출물이 조골세포를 통한 골형성 촉진효과가 있음을 나타내는 증거이다.
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실험예
2> 파골세포 형성 억제 실험
본 발명에 의한 천마추출물이 파골세포의 형성 또는 증식 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다. 대조군으로서는 천마추출물을 첨가하지 않은 멸균증류수(매체대조군)를 사용하였다.
1) 파골세포의 선별 및 세포 배양
본 발명에 사용되는 파골세포는 골수 세포 (2.5 x 105 세포/cm2)와 두개관 유래 조골세포 (4 x 104 세포/cm2)(실험예 1의 2) 참조)를 1,25(OH)2D3 (10-8M)과 덱사메타손 (10-7M), 10% FBS를 포함하는α-MEM 배지 중에서 공동 배양하여 수득하였다.
① 골수 세포의 배양
구체적으로, 골수세포는 다음과 같이 준비하였다. 골수세포는 6주령의 ddY 마우스의 대퇴골 (femur) 주위의 근육 조직을 깨끗이 떼어내어 클린 벤치로 옮기고, 미리 얼음에 넣어 두었던 10% FBS, 페니실린 100 유니트/㎖와 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 포함하는 α-MEM 배지에 대퇴골을 넣었다. 대퇴골의 끝을 자르고 주사기 바늘을 꽂은 뒤 골수 (bone marrow)가 완전히 빠질 때까지 배지로 씻어 내렸다. 골수를 모아 800 g로 7분간 원심분리하여 펠렛 (pellet)을 얻고, 이것을 상기 배양 배지에 재현탁시켜 배양 플라스크에 분주한 후 37℃, 습식 조건인 5% CO2 배양 기에서 배양하였다. 24 시간 뒤 점착되지 않은 세포들을 수집하여 800 g, 4℃에서 7분간 원심분리하여 펠렛을 모았다. 이것을 0.02% 프로나제 (pronase)와 1.5 mM EDTA를 함유하는 pH 7.4의 PBS 용액에 재현탁시켜 37℃에서 15분간 반응시켰다. 15분 뒤 FBS를 가하여 반응을 종료시키고 4℃에서 15분간 보관하였다. 현탁액을 다른 튜브로 옮겨 4℃에서 1,200 g로 10분간 원심분리한 후, 침전된 세포를 상기 배양 배지에 부유시켜 실험예 1의 2)에 따라 제조된 조골세포와 공동배양에 사용하였다.
② 골수세포와 조골세포의 공동 배양
상기와 같이 준비된 골수세포 (2.5 x 105 세포/cm2 )와 두개관 유래 조골세포 (4 x 104 세포/cm2)(실험예 1의 2) 참조)를 배양 플레이트에서 1,25(OH)2D3 (10-8M)과 덱사메타손 (10-7M), 10% FBS를 포함하는α-MEM 배지 중에서 공동 배양하면서 매 2일 마다 새로운 배지로 교환하였다. 공동배양 6 내지 8일째에, 0.2%의 콜라게나제를 처리하여 다핵성 파골세포를 플레이트에서 탈착시킨 후 새로운 플레이트에 접종하여 목적하는 실험에 사용하였다. 이러한 공동배양에 의해 다핵성 파골유사세포(multinucleated osteoclast like cell, OCL)가 형성된다.
2) 파골세포의 형성에 미치는 영향
상기 공동배양으로 수득한 세포를 1x104 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하고 상기 실시예 1에서 수득한 천마 추출물을 10-8, 10-7, 10-6 g/ml의 농도가 되도록 각 농도별로 6개의 웰에 첨가한 후, 6일간 배양하였다. 이어서, 세포를 10%의 포름알데하이드로 고정하고 TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 실시하였다. 파골세포의 수는 TRAP을 발현하는 다핵세포의 수를 세어 측정하였다. 염색은 시판되는 키트 (kit) (Sigma사, 미국)를 사용하였으며, 6개 이상의 핵을 갖는 TRAP-양성 세포 (TRAP-positive MNC)를 파골세포로 측정하였다.
결과는 도 5에 기재하였다. 10-8g/ml 처리군을 제외한 모든 천마추출물 처리군에서 무처리 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 용량의존적인 OCL 형성 감소가 관찰되었으며, 10-8g/ml 처리군에서도 유의성은 인정되지 않았으나, 매체 대조군에 비해 다소 감소된 OCL 형성이 인정되었다. 구체적으로, 천마물 추출물 10-8, 10-7 및 10-6g/ml 처리군에서는 파골세포의 형성에 있어서, 매체 대조군에 비해 각각 -8.81, -17.62 및 -22.02%의 변화를 나타내었다.
골흡수는 성숙한 OCL의 형성이 필수적인 것으로, 성숙한 OCL의 감소는 골흡수를 억제하는 직접적인 증거로 알려져 있다. 따라서 상기와 같은 본 발명의 천마추출물에 의한 파골세포 형성의 감소는 천마추출물의 골흡수의 근본적인 억제를 통한 골다공증 치료 효과를 증명하는 것이다.
3)
골흡수
(피트 형성)에 미치는 영향
상기와 같이 공동배양으로 수득한, 10% FBS를 포함하는 α-MEM 배지 중의 OCL 세포를 1x104 세포/웰로 96-웰 플레이트 상의 상아질 절편(dentine slice, 직경 4mm)에 접종하였다. 2시간의 예비배양 후에, 상기 상아질 절편을 48-웰 플레이트로 옮기고, 상기 실시예 1에서 수득한 천마 추출물을 10-8, 10-7, 10-6 g/ml의 농도가 되도록 각 농도별로 6개의 웰에 첨가하였다. 이어서, 24시간 동안 배양한 후, 세포에 1M NH4OH를 처리하여 파골세포를 제거하고, 상기 상아질 슬라이스 상에 형성된 피트를 메이어 헤마톡실린으로 염색을 하여 그 수를 측정하였다. 골흡수로 인해 형성된 피트는 자동화 영상분석기(analySIS Image Processing; SIS, Germany)를 사용하여 측정하여 매체대조군과 비교하였다.
결과는 도 4에 기재하였다. 모든 천마추출물 처리군에서 매체대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 용량의존적인 파골세포에 의한 피트 형성의 감소가 관찰되었다. 구체적으로, 천마물 추출물 10-8, 10-7 및 10-6g/ml 처리군에서는 피트 형성에 있어서, 매체 대조군에 비해 각각 -34.81, -46.00 및 -51.51%의 감소를 나타내었다.
상아질 절편상에 형성되는 피트는 파골세포의 활성에 의한 것으로 이러한 피트형성의 감소는 본 발명의 천마추출물이 파골세포의 활성을 억제하는 직접적인 증거이며, 나아가, 파골세포의 형성 억제를 통한 본 발명의 천마추출물의 골다공증에 대한 치료효과를 증명하는 것이다.
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실험예
3> 난소 적출 흰쥐에 대한 동물 실험
1) 실험동물
수령시 생후 6주령의 60마리의 ddY 마우스 (SLC, 일본)를 본 실험에 사용하 였으며, 실험에 사용 전 12일 동안 환경에 적응시켰다. 5마리를 하나의 케이지에 넣고, 실험기간 동안 사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 동물 실험실의 온도는 20 내지 25℃, 습도는 40 내지 45%로 유지하였다. 또한 12시간 마다 낮과 밤이 반복되도록 실험실 내 명암주기(light-dark cycle)를 조절하였다.
실험 과정은 크게 난소 적출의 시행, 적출 후 회복기 과정, 그 후 농도별 약물 투여, 일정 기간 후 마우스를 희생하여 표본골 및 혈장 채취, 조직학적관찰, 조직형태계측학적 분석으로 나눌 수 있다.
2) 난소 적출 및 천마추출물의 투여
① 난소적출
Sham군 (정상대조군)을 제외한, 매체대조군과 시험군의 모든 마우스에서 양측 난소 적출술을 시행하였다. 케타민 (ketamine) (ICN Biochemicals Inc., USA) 5㎎/체중100g과 자일라진 (xylazine) (Wako Pure Chemicals Industries Ltd., Japan) 1㎎/체중 100g을 흰쥐의 좌측 및 우측 후지 대퇴근에 근육 주사하여 흰쥐 암컷을 전신 마취시켰다. 하복부의 털을 제거하고 동물의 체위을 반듯이 눕힌 상태에서 포타딘액 (삼일제약: 요오드, 대한민국)으로 수술 부위를 소독한 후, 무균 조작 하에서 수술을 시행하였다. 정중선 (백선)을 중심으로 하복부에서 2 cm 정도로 피부, 복근 및 복막을 절개하고, 소독된 핀셋으로 난소를 노출시켜 난관을 견사로 결찰한 후 좌우 난소를 적출하였다. 항생제 (썰파포르테-4, 유니화학 주식회사) 0.3㎖를 복강 내에 주입하여 감염을 방지하였으며, 흡수성 봉합사로 복막, 복근 및 피부를 봉합하였다.
정상대조군은 난소를 적출하지 않은 것으로서, 난소를 적출하고 약물 투여를 하지 않은 매체대조군에 대한 비교군으로서, 난소 적출로 인한 변화를 비교하기 위한 것이며, 매체대조군은 난소 적출 후, 천마추출물이 투여된 동물들과 비교하여, 천마추출물의 투여에 기인하는 변화를 비교하기 위한 것이다.
② 천마추출물의 투여
실시예 1에 따라 제조된 천마추출물을 총부피 10ml 중에 125, 250 및 500mg의 양으로 증류수로 희석하였다. 이어서, 상기 용액을 각각 125, 250 및 500mg/kg의 투여량으로, 랫트 경구용 존데(sonde)가 달린 3ml 주사기를 사용하여, 상기와 같이 준비된 실험 동물 (총 6개 군: 비교군, 정상대조군, 매체대조군, 각 농도당 시험물질 투여군, 각 군당 5마리씩)에 난소적출 7일 후부터 매일 4주간 일간 경구 투여하였다. 정상대조군과 매체대조군에는 동 부피의 증류수를 투여하였다.
비교군으로서는 현재 골다공증 치료제로 주로 사용되고 있는 FOSA를 10mg/kg 경구 투여하였다.
일반적인 방법을 통하여 조직학적 변화와 조직형태 계측학적 분석을 실시하였고, 경골 내 무기질함량 (칼슘, Ca 및 인 P)과 골강도 및 골밀도를 각각 측정하였다. 또한 최종 희생 1일 전 및 최종 희생일의 혈액에서 오스테오칼신, Ca 및 P 함량의 혈액 분석을 실시하였다.
3) 골 중량의 변화
최종 희생일 (투여 후 28일째)에 대퇴골 및 경골을 적출한 다음 중량을 g 단위로 측정하였다. 개별 마우스별 체중 차이로부터 유래되는 오차를 줄이기 위해서 상대적 골 중량을 하기와 같이 계산하였다.
상대적 골 중량 (%) = [(절대적
골중량
/희생시 체중) x 100]
측정 결과는 표 1에 요약하였다.
상기 표에서 보는 바와 같이, 정상대조군에 비해 매체 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.05) 경골과 대퇴골의 절대 및 상대중량의 감소가 인정되었으나, FOSA 투여군에서는 매체 대조군에 비해 대퇴골 상대중량 및 경골 절대중량의 유의성 있는 (p<0.05) 증가를 나타내었고, 모든 천마추출물 투여군에서도 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 골 중량의 증가를 나타내었다.
구체적으로, 대퇴골 절대 중량치는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -12.96%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 3.71, 10.10, 10.74 및 13.96%의 변화를 나타내었다. 대퇴골 상대 중량치는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -16.84%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 9.06, 12.16, 10.68 및 11.63%의 변화를 나타내었다.
경골 절대 중량치는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -14.77%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 8.97, 13.77, 16.34 및 18.62%의 변화를 나타내었다. 경골 상대 중량치는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -18.08%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 13.89, 15.00, 15.77 및 16.17%의 변화를 나타내었다.
일반적으로 골다공증 환자의 경우, 골중량의 현저한 감소가 초래되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 천마추출물 투여에 따른 현저한 대퇴골 및 경골 중량의 증가는 천마추출물이 골다공증에 의해 초래되는 골 중량의 감소를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 종전의 골다공증 치료제로 널리 알려진 FOSA의 효능보다 월등한 것으로서, 이는 본 발명의 천마추출물이 우수한 골다공증 치료제로서의 기능할 수 있음을 입증하는 것이다.
4) 골 길이 및 두께의 변화
최종 희생일 (투여 후 28일째)에 대퇴골 및 경골을 적출한 다음, 우측 대퇴골 및 경골의 골두에서의 두께 및 세로 길이를 전자식 디지털 칼리퍼를 사용하여 mm 단위로 측정하였다.
측정 결과는 표 2에 요약하였다.
상기 표에서 보는 바와 같이, 정상군에 비해 매체 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 경골과 대퇴골 골두 두께의 감소가 인정되었으나, 천마추출물 125mg/kg 투여군을 제외한 모든 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 증가를 나타내었다. 천마추출물 125mg/kg 투여군의 경우, 매체 대조군에 비해 유의성은 인정되지 않았으나, 현저한 경골 골두의 두께 증가가 인정되었으며, 대퇴골 골두는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 증가를 나타내었다. 뼈의 길이는 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 유사하게 관찰되었다.
구체적으로, 대퇴골 골두의 두께는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -19.59%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 17.09, 11.17, 12.38 및 16.15%의 변화를 나타내었다. 대퇴골의 길이는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -0.74%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 1.70, 1.44, 1.03 및 1.60%의 변화를 나타내었다.
경골 골두의 두께는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -5.50%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 5.08, 4.02, 7.41 및 7.72%의 변화를 나타내었다. 경골의 길이는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -0.51%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 0.60, 1.13, 0.30 및 1.90%의 변화를 나타내었다.
일반적으로 골다공증의 환자의 경우, 뼈의 길이는 변화하지 않으나, 골량 감소에 의해 뼈의 두께는 현저히 감소되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 천마추출물 투여에 따른, 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 현저한 대퇴골 및 경골 골두의 두께 증가는 천마 추출물이 골다공증에 의해 초래되는 골량의 감소에 의한 뼈 두께의 감소를 직접적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 종전의 골다공증 치료제로 널리 알려진 FOSA의 효능보다 월등한 것으로서, 본 발명의 천마추출물이 우수한 골다공증 치료제로서의 기능할 수 있음을 입증하는 것이다.
5) 골 무기질 함량의 변화
최종 희생일 (투여 후 28일째)에 우측 경골을 적출한 다음 이를 120℃에서 8시간 동안 건조하였다. 건조된 경골을 800℃ 화로에서 6시간 동안 탄화하고, 질산에 용해하였다. 상기 용액을 희석하여, 칼슘(Ca) 및 인(P) 함량을 각각 오소크레솔프탈레인 컴플렉손 방법, 및 효소 방법을 사용하여 mg/g의 단위로 측정하였다.
칼슘/인 비(ratio)는 다음과 같이 계산하였다:
Ca/P ratio (%) = (경골 Ca 함량 / 경골 P 함량) x 100.
측정 결과는 표 3에 요약하였다.
상기 표에서 보는 바와 같이, 정상군에 비해 매체 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 경골 내 Ca 및 P 함량의 감소가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 증가를 나타내었다. 한편 경골내 Ca/P 비율은 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 유사하게 관찰되었다.
경골 Ca 함량은 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -37.62%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 33.03, 26.49, 32.05 및 33.57%의 변화를 나타내었다. 경골 P함량은 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -45.33%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 42.53, 21.04, 28.57 및 44.75%의 변화를 나타내었다
경골 Ca/P 함량비는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 14.80%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 -5.06, 7.09, 3.01 및 7.25%의 변화를 나타내었다.
일반적으로, 골다공증이 진행됨에 따라 골 무기질 함량 특히 Ca 및 P의 함량은 현저히 감소되며, Ca/P 함량에는 변화가 없는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 천마추출물의 투여에 따른, 매체 대조군에 비해 현저한 경골내 Ca 및 P 함량의 증가는 천마 추출물 이 골다공증에 의해 초래되는 골 무기질함량의 억제를 효과적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 종전의 골다공증 치료제로 널리 알려진 FOSA의 효능보다 월등한 것으로서, 본 발명의 천마추출물이 우수한 골다공증 치료제로서의 기능할 수 있음을 입증하는 것이다.
6) 혈액
화학치의
변화
최종 희생일 (투여 후 28일째)에 대정맥에서 정맥혈 1ml을 채취하였다. 채취한 혈액을 응고활성 혈장용 튜브를 사용하여 실온 3,000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈장의 오스테오칼신 농도는 RIA (Radio-Immuno-Assay) 키트 (DiaSorin Inc., MN, USA) 및 자동화 감마 계측기(HE model, ICN Co., CA, USA)을 사용하여 ng/ml로서 검출하였다. 혈중 칼슘 농도는 CA 스트립(WAKO, JAPAN)을 사용한 OPCP (o-cresol-phthalein complexone) [Sodikoff, 1995] 및 자동화 혈액분석기 (Toshiba 200FR, JAPAN)을 사용하여 mg/dl로서 검출하였다. 인(P)의 농도는 P 스트립을 사용한 카이네틱 UV 방법 [Sodikoff, 1995] 및 자동화 혈액분석기 (Toshiba 200FR, JAPAN)을 사용하여 mg/dl로서 검출하였다.
결과는 표 4에 요약하였다.
상기 표에서 보는 바와 같이, 정상군에 비해 매체 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 오스테오칼신 함량의 증가 및 Ca과 P 함량의 감소가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) Osteocalcin 함량의 감소, 혈중 Ca 및 P 함량의 증가를 나타내었다.
구체적으로, 혈중 Osteocalcin 함량은 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 59.90%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 -23.16, -11.84, -17.50 및 -17.25%의 변화를 나타내었다.
혈중 Ca함량은 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -22.68%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 10.85, 10.62, 15.24 및 17.32%의 변화를 나타내었다.
혈중 P함량은 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -37.90%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 23.71, 22.07, 26.98 및 30.25%의 변화를 나타내었다.
오스테오칼신은 대표적인 골전환 표지로 이용되고 있으며, 혈중 Ca 및 P 함량은 골형성 지표로 알려져 있다. 일반적으로 골다공증이 진행됨에 따라 골전환이 증가하고, 이에 의해 혈중 오스테오칼신 함량은 증가되며, 골형성 억제에 의해 혈중 Ca 및 P의 함량은 현저히 감소된다. 따라서 본 발명의 천마추출물의 투여에 의한, 매체 대조군에 비해 현저한 오스테오칼신 함량의 감소는, 골다공증에 의해 초래되는 골전환의 증가를 억제할 뿐만 아니라, 이는 종전의 골다공증 치료제로 널리 알려진 FOSA의 효능보다 월등한 것으로서, 본 발명의 천마추출물이 우수한 골다공증 치료제로서의 기능할 수 있음을 입증하는 것이다. 한편, 천마추출물에 의한 Ca 및 P의 함량 증가는 골형성 촉진 효과와 관련이 있을 것으로 생각된다.
7) 골밀도 및
골강도의
변화
좌측 경골의 골두의 골밀도(Bone Mineral Density, BMD)는 이중-에너지 x-ray 흡수계측기(DEXA, PXImus; Lunar Medison WI USA)를 제조자의 권고대로 사용하여 mg/cm2로서 측정하였다. 골강도는 FL (Fall Load)로 측정된다. 좌측 경골간 부위를 제조자의 권고대로 컴퓨터 검사장비 (Instron 6022; Instron, USA, speed 20mm/min)를 이용하여 3지점 굽힘 골절 검사(three point bending test)(Jamsa et al., 1998)을 사용하여 측정하였으며, 단위는 Newton (N)으로 환산하였다.
결과는 표 5에 요약하였다.
① 골밀도의 변화
상기 표에서 보는 바와 같이, 정상군에 비해 매체 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 경골 골밀도의 감소가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 골밀도의 증가를 나타내었다.
경골 골밀도는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -39.53%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 27.80, 10.73, 18.05 및 21.46%의 변화를 나타내었다.
일반적으로 골다공증 환자는 골다공증의 원인에 상관없는 현저한 골밀도의 감소가 초래되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 천마추출물에 의한 현저한 대퇴골 골밀도의 증가는 골다공증에 의해 초래되는 골밀도 감소를 억제할 뿐만 아니라, 이는 종전의 골다공증 치료제로 널리 알려진 FOSA의 효능에 필적하는 것으로서, 본 발명의 천마추출물이 우수한 골다공증 치료제로서의 기능할 수 있음을 입증하는 것이다.
②
골강도의
변화
상기 표에서 보는 바와 같이, 정상군에 비해 매체 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 경골 골강도의 감소가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 골강도의 증가를 나타내었다.
경골 골강도는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -43.57%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 33.33, 18.84, 24.22 및 26.09%의 변화를 나타내었다.
골강도는 피질골의 강도를 가장 직접적으로 판단할 수 있는 지표로서, 골다공증 환자는 골다공증의 원인에 상관없는 현저한 골밀도의 감소가 초래되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 천마추출물에 의한, 매체 대조군에 비해 현저한 경골 골강도의 증가는 골다공증에 의해 초래되는 골강도 감소를 억제할 뿐만 아니라, 이는 종전의 골다공증 치료제로 널리 알려진 FOSA의 효능에 필적하는 것으로서, 본 발명의 천마추출물이 우수한 골다공증 치료제로서의 기능할 수 있음을 입증하는 것이다.
8) 조직형태학적 변화
조직형태학적 검사를 위해, 각 마우스에서 우측 대퇴골을 적출하여, 10%의 중성 pH로 완충된 포르말린(NBF)에 12시간 동안 고정시킨 후, 칼슘제거 용액 [24.4% 포름산, 0.5N 수산화나트륨]에서 5일 동안 두어 칼슘을 제거하였으며, 상기 용액은 5일 동안 매일 교환하였다. 칼슘제거 후에 공지된 방법에 따라 파라핀포매를 실시한 후 마이크로톰으로 3~4μm 두께의 절편으로 절단한 후 헤마톡실린&에오신 (hematoxyline & eosin, H&E) 염색을 실시한 후, 지주골량 (TBV), 지주골 길이 (Tbl), 두께 (Tbt) 및 수 (Tbn) 및 피질골의 두께 (Cbt) 및 파골세포의 수를 다음과 같이 측정였다.
① TBV 의 측정:
우측 대퇴골의 활차골두(trochlea epiphyseal) 부위 중 균일한 영역 (성장판 부위는 제외함)을 100배 배율의 현미경 (Zeiss, Germany)하에서 자동화 영상분석기 (analySIS Image Processing; SIS, Germany)를 사용하여 계측하였다. TBV는 백분률(%)로서 계산하였다.
②
Tbl
,
Tbn
및
Tbt
측정:
좌측 대퇴골의 활차골두(trochlea epiphyseal)의 균일한 부위 중 가장 잘 발달된 영역에서 100배 배율의 현미경 (Zeiss, Germany)하에서 자동화 영상분석기 (analySIS Image Processing; SIS, Germany)를 사용하여 Tbl, Tbn 및 Tbt를 계측하였다. Tbt 및 Tbl μm 단위로 측정하였으며, Tbn은 상기 부위의 단면적당의 수로 측정하였다.
③
Cbt
의 측정:
대퇴골의 활목(trochlea neck)의 영역에서 200배 배율의 현미경 (Zeiss, Germany)하에서 자동화 영상분석기 (analySIS Image Processing; SIS, Germany)를 사용하여 Cbt를 계측하였다. 두께는 μm 단위로 측정하였다.
④
Ocn
의 측정:
좌측 대퇴골의 활차골단(trochlea epiphyseal)의 단면에서 200배 배율의 현미경 (Zeiss, Germany)하에서 자동화 영상분석기 (analySIS Image Processing; SIS, Germany)를 사용하여 Ocn을 측정하였다. Ocn은 200μm2 골단 단면적당 세포의 수로 측정하였다.
결과는 표 6에 요약하였다.
상기 표에서 보는 바와 같이, 매체 대조군에서는 난소적출에 의해 대퇴골내 지주골의 현저한 조직학적 감소가 인정되었으며, 피질골의 경우 골막부분에서부터의 뼈조직의 재흡수에 의한 결합조직의 증가 등, 전형적인 골다공증 소견이 인정 되었고, 정상군에 비해 조직형태학적으로 지주골량 (TBV), 지주골 길이 (Tbl), 두께 (Tbt) 및 수 (Tbn) 및 피질골 두께 (Cbt)의 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었으며, 파골세포의 수 (Ocn)의 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었다.
FOSA 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 TBV, Tbn 및 Tbl의 증가가 인정되었으며, Ocn 역시 매체 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 인정되었다.
천마추출물 투여군에서는 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) TBV, Tbn, Tbl, Cbt의 증가가 용량 의존적으로 인정되었으며, Tbt 역시 용량 의존성 및 유의성은 인정되지 않았으나 현저한 증가를 나타내었다. 한편 Ocn은 매체 대조군과 매우 유사하게 관찰되었다.
구체적으로, 대퇴골의 TBV는 매체대조군의 경우, 정상군에 비해 -50.01%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 129.26, 25.54, 42.10 및 50.96%의 변화를 나타내었다.
대퇴골의 Tbt 는 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -54.70%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출 물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 5.27, 26.08, 25.88 및 14.35%의 변화를 나타내었다.
대퇴골의 Tbn은 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -39.98%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 127.78, 33.33, 47.22 및 58.33%의 변화를 나타내었다.
대퇴골의 Tbl은 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 -48.87%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 50.46, 35.17, 36.74 및 40.73%의 변화를 나타내었다.
대퇴골의 Ocn은 매체 대조군의 경우, 정상군에 비해 213.64%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 매체 대조군에 비해 각각 56.52, -4.35, 8.70 및 -4.35%의 변화를 나타내었다
대퇴골의 Cbt는 매체대조군의 경우, 정상군에 비해 -60.53%의 변화를 나타내었으나, FOSA, 천마추출물 125, 250 및 500mg/kg 투여군에서는 는 매체 대조군에 비해 각각 6.46, 28.15, 37.91 및 44.46%의 변화를 나타내었다.
일반적으로 골다공증 환자에의 골에서는 조직형태학적으로 현저한 지주골 및 피질골량의 감소가 초래되며, 골흡수를 담당하는 파골세포는 수적 증가를 나타낸다. 따라서 본 발명의 천마추출물에 의한, 매체 대조군에 비교하여, 현저한 지주골량, 지주골 수 및 길이의 용량의존적 증가는 천마추출물이 골다공증에 의해 초래되는 지주골량 감소를 억제하는 직접적인 증거이며, 피질골량의 용량 의존적인 증가 역시 피질골량의 감소를 억제하는 증거이다. 특히 파골세포의 수의 현저한 감소는 종래 골다공증 치료제로 널리 사용되는 FOSA의 효능과 비교하여 월등한 것으로서, 본 발명에 따른 천마추출물의 골다공증 치료 및 예방제로서의 우수성을 입증하는 것이다.
본 발명의 천마추출물은 조골세포의 직접적인 증식, 분화 및 활성을 증가시 키며, 파골세포의 형성 및 활성을 현저히 억제한다. 또한 난소적출로 유발된 마우스 골다공증 모델에서 FOSA에 필적하거나 우수한 골다공증 치료약효를 갖는다. 나아가, 천연물인 천마추출물은 현재 골다공증 치료제로 사용중인 비스포네이트(Bisphosphonate) 계열 (상부 소화기 장애) 및 부갑상선 호르몬 유사체(고칼슘혈증) 등이 가지고 있는 부작용에 대한 문제가 없을 것으로 예상되어, 골다공증 및 골다공증에 의한 골절 등의 새로운 예방 및 치료제로서 매우 가치가 높을 것으로 판단된다.
Claims (7)
- 천마(Gastrodia elata Blume) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 5의 알콜, 또는 이들의 혼합 용매를 추출용매로 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 추출물은 물을 용매로 사용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 식품.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 식품첨가제.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 음료.
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