KR102055219B1

KR102055219B1 - 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102055219B1
Application number: KR1020170181838A
Authority: KR
Inventors: 진성우; 김경제; 서경순; 고영우; 임승빈; 정상욱; 제해신; 김광상; 김민숙; 유병조; 장지연
Original assignee: 재단법인 장흥군버섯산업연구원
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2019-12-12
Also published as: KR20190079837A

Abstract

본 발명은 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 세포독성이 없어 안전하고, TGF-β1의 발현을 효과적으로 억제함으로써 정상 모발이 탈모로 진행되는 과정을 줄여 탈모 현상을 늦추는 효과가 있으므로, 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물, 의약외품 또는 화장료 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물{Composition for preventing hair loss or stimulating hair growth comprising Houttuynia cordata extract and thymosin β4 as effective component}

본 발명은 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.

인체의 모발은 약 10만 내지 15만 개 정도이며, 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기(anagen), 퇴행기(catagen) 및 휴지기(telogen)를 거쳐 성장 및 탈락하게 된다. 이러한 주기는 36년에 걸쳐 반복되는데 그 결과 일일 평균 50 내지 100 개의 모발이 정상적으로 탈락하는 양상을 보인다.

탈모는 이러한 주기 중에서 성장기의 모발 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져 비정상적으로 모발이 탈락하는 숫자가 많아지고 정상적으로 자라는 머리털이 어떤 원인에 의해 빠지게 되면 이를 탈모증(alopecia 또는 hair loss)이라고 한다. 특히, 탈모 환자의 대부분을 차지하고 있는 남성형 탈모의 경우에는 모발 밀도의 감소는 없지만 모발의 굵기가 극단적으로 감소한다는 사실이 밝혀지고 있다. 탈모의 원인은 유전적 원인, 환경오염, 호르몬의 불균형, 가공식품의 섭취, 고열, 항암제나 항갑상선제의 복용 등으로 인해 일어나게 된다. 탈모 자체는 심각한 질환은 아니지만 탈모환자는 사회적으로 위축되며, 심각할 경우 우울증과 같은 정신질환으로 발전할 수 있다.

현재까지 알려진 탈모의 기작은 테스토스테론(testosterone)이 5α-리덕타제(5α-reductase)에 의해 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone:DHT)으로 전환되고, 상기 호르몬 작용 이후의 신호전달물질에 대한 연구로서 모낭세포의 혼합배양 실험을 통하여, 탈모증과 관계된 모낭 세포사가 TGF-β와 연계되어 일어난다는 것을 확인하였다. 이러한 활성 남성호르몬 작용 이후의 후속 신호전달물질인 TGF-β를 억제하는 물질을 탐색하는 연구 중에서 수국(Hydrangea macrophylla) 추출물이 효과적으로 TGF-β 유도 protein(PAI-1)을 억제하고 모낭기관배양에서 모발성장을 촉진한다는 연구결과가 있으며, 보리로부터 추출한 프로시아니딘(procyanidin) B-3가 TGF-β1에 의해 마우스 모발 상피세포의 성장 저해현상을 효과적으로 억제하고, 마우스의 성장기 모발주기를 촉진한다는 연구결과 보고도 있다. 또한, 인지질이라고 알려진 포스파티딘산(phosphatidic acid)과 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid)이 MEK(Mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase) 활성화를 통해 TGF-β1에 의한 모낭세포사 경유 퇴행기 모발주기 이행을 효과적으로 저해한다는 연구 보고도 알려져 있다.

이러한 탈모증의 치료나 예방에 있어서 현재까지 가장 널리 사용되는 제제는 미녹시딜(Minoxidil) 함유 제제로서, 현재까지 미국 FDA의 승인을 받은 두 가지 발모제 성분 중의 하나이다. 미녹시딜은 고혈압 치료제이었지만 사용상의 부작용으로 발모 현상이 나타나면서 현재에는 발모제로 더 유명한 약물이 되었다. 미녹시딜의 발모 작용기전에 대해서는 정확히 밝혀져 있지는 않지만, 혈관 확장 효과를 통한 혈류량 증가로 모근에 영양을 공급하여 모발 성장을 촉진하는 것으로 추측하고 있다. 이외에도 머크(Merck)사의 프로페시아(Propecia) 주성분인 피나스테라이드(finasteride)는 남성호르몬 테스토스테론(testosterone)이 더 강력한 형태의 남성호르몬인 디히드로테스토스테론(DHT: dihydrotestosterone)으로 전환되는 것을 억제한다고 알려져 있다.

그러나 현재 주로 사용되고 있는 화학적 탈모 치료제는 장기간 복용시 성호르몬 불균형을 초래하고, 피부염을 일으키는 등 여러가지 부작용이 보고 되고 있다. 따라서 최근에는 허브와 같은 천연물질에서 탈모 치료제를 개발하려는 노력이 계속 진행되고 있으며, 천연물질과 기존의 치료제를 혼합사용하여 화학적 치료제의 부작용을 완화하려는 노력이 있어왔다.

한편, 한국공개특허 제2016-0109332호는 가열처리 인삼, 어성초, 자소엽, 및 녹차엽으로 구성된 조합 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 갖는 조성물을 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2017-0021745호는 티모신 β4 및 시트르산을 유효성분으로 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 어성초 추출물과 티모신 β4를 혼합하여 제조한 혼합물이 케라틴 세포, 인간모유두세포 및 지방전구세포에 대해 세포독성이 없고, 어성초 추출물 및 티모신 β4를 단독으로 처리하였을 때보다 탈모 유도 인자인 TGF-β1의 발현을 현저하게 억제시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 어성초(Houttuynia cordata) 추출물 및 티모신 β4(thymosin β4)의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 어성초(Houttuynia cordata) 추출물 및 티모신 β4(thymosin β4)의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물은 세포독성이 없어 안전하고, TGF-β1의 발현을 효과적으로 억제함으로써 정상 모발이 탈모로 진행되는 과정을 줄여 탈모 현상을 늦추는 효과가 있으므로, 탈모방지 또는 발모촉진용 약학적 조성물, 의약외품 또는 화장료 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 어성초 추출물 및 티모신 β4를 함량별로 혼합하여 제조한 혼합물을 케라틴 세포(HaCaT cell; Keratinocyte cell)에 처리하였을 때, 세포 생존율(cell viability)을 측정한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 대조군이며; 0%는 티모신 β4가 포함되지 않은 어성초 단독 추출물 처리군이며; 3%는 어성초 추출물(97%) 및 티모신 β4(3%)의 혼합물 처리군이며; 6%는 어성초 추출물(94%) 및 티모신 β4(6%)의 혼합물 처리군이며; 8%는 어성초 추출물(92%) 및 티모신 β4(8%)의 혼합물 처리군이며; 10%는 어성초 추출물(90%) 및 티모신 β4(10%)의 혼합물 처리군이며; 20%는 어성초 추출물(80%) 및 티모신 β4(20%)의 혼합물 처리군이며; 30%는 어성초 추출물(70%) 및 티모신 β4(30%)의 혼합물 처리군이며; 40%는 어성초 추출물(60%) 및 티모신 β4(40%)의 혼합물 처리군이며; 50%는 어성초 추출물(50%) 및 티모신 β4(50%)의 혼합물 처리군이며; 및 60%는 어성초 추출물(40%) 및 티모신 β4(60%)의 혼합물 처리군을 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 어성초 추출물 및 티모신 β4를 함량별로 혼합하여 제조한 혼합물을 인간모유두세포(HFDPC; Human follicle dermal papilla cell)에 처리하였을 때, 세포 생존율(cell viability)을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 어성초 추출물 및 티모신 β4를 함량별로 혼합하여 제조한 혼합물을 지방전구세포(3T3-L1 cell)에 처리하였을 때, 세포 생존율(cell viability)을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 어성초 추출물 및 티모신 β4를 함량별로 혼합하여 제조한 혼합물을 Raw 264.7 세포에 처리한 후, NO(Nitric Oxide) 생성량을 측정하여 항염증 효과를 확인한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이며, LPS(Lipopolysaccharaide)는 양성대조군이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 어성초 추출물 및 티모신 β4를 함량별로 혼합하여 제조한 혼합물을 지방전구세포(3T3-L1 cell)에 처리하였을 때, 지방세포로의 분화율을 측정한 결과이다. con은 아무것도 처리하지 않은 대조군이며; dmii(3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), dexamethasone, insulin 및 indomethacin)는 양성대조군이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 어성초 추출물 및 티모신 β4를 함량별로 혼합하여 제조한 혼합물을 세포에 처리하였을 때, TGF-β1의 발현 억제효과를 나타낸 결과이다. A 및 B는 어성초 추출물 및 티모신 β4를 처리하지 않은 대조군이며; C는 어성초 추출물 단독 처리군이며; D는 티모신 β4 단독 처리군이며; E는 어성초 추출물(97%) 및 티모신 β4(3%)의 혼합물 처리군이며; F는 어성초 추출물(94%) 및 티모신 β4(6%)의 혼합물 처리군이며; G는 어성초 추출물(92%) 및 티모신 β4(8%)의 혼합물 처리군이며; H는 어성초 추출물(90%) 및 티모신 β4(10%)의 혼합물 처리군이며; I는 어성초 추출물(80%) 및 티모신 β4(20%)의 혼합물 처리군이며; J는 어성초 추출물(70%) 및 티모신 β4(30%)의 혼합물 처리군이며; K는 어성초 추출물(60%) 및 티모신 β4(40%)의 혼합물 처리군이며; L은 어성초 추출물(50%) 및 티모신 β4(50%)의 혼합물 처리군이며; 및 M은 어성초 추출물(40%) 및 티모신 β4(60%)의 혼합물 처리군을 의미한다. 대조군을 제외한 각 처리군은 모두 동일 농도의 100㎍/ml의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 처리하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 어성초(Houttuynia cordata) 추출물 및 티모신 β4(thymosin β4)의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 어성초 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용한 것일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 어성초 추출물은

1) 어성초를 50~150 메쉬가 되도록 분쇄하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)에서 분쇄된 어성초 분말 1 중량부에 대하여 5~20 중량부의 에탄올을 첨가하여 60~100℃에서 4~8시간 동안 추출하고 여과하는 단계;를 포함하여 제조한 추출물일 수 있으며,

바람직하게는,

1) 어성초를 100 메쉬가 되도록 분쇄하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)에서 분쇄된 어성초 분말 1 중량부에 대하여 10 중량부의 에탄올을 첨가하여 80℃에서 6시간 동안 추출하고 여과하는 단계;를 포함하여 제조한 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 혼합물은 전체 100 중량부에 대하여 35~75 중량부의 어성초 추출물 및 25~65 중량부의 티모신 β4를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 35~55 중량부의 어성초 추출물 및 45~65 중량부의 티모신 β4를 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50 중량부의 어성초 추출물 및 50 중량부의 티모신 β4를 포함하거나 40 중량부의 어성초 추출물 및 60 중량부의 티모신 β4를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 화장료 조성물은 헤어 컨디셔너, 헤어 토닉, 헤어 크림, 헤어 로션, 헤어 오일, 헤어 스프레이, 샴푸 또는 린스의 제형으로 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 이외에, 본 발명의 작용(탈모방지 또는 육모 작용)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 양모제 또는 육모제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 담체로서, 정제수, 일가 알코올류(에탄올 또는 프로필 알코올), 다가 알코올류(글리세롤, 1,3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜), 고급 지방산류(팔미틸산 또는 리놀렌산), 유지류(소맥 배아유, 동백기름, 호호바유, 올리브유, 스쿠알렌, 해바라기유, 마카데미아땅콩유, 아보가드유, 대두 수첨가 레시틴 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 필요에 따라 계면활성제, 살균제, 산화방지제, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제를 첨가할 수 있다.

상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌, 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌, 올레일에테르, 모노올레인산폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌, 글리세릴모노스테아레이트, 모노스테아린산소르비탄, 모노올레인산폴리옥시에틸렌, 소르비탄, 자당지방산에스테르, 모노라우린산헥사글리세린, 폴리옥시에틸렌 환원라놀린, POE, 글리세릴피로글루타민산, 이소스테아린산, 디에스테르, N-아세틸글루타민 및 이소스테아릴에스테르로 이루어진 군에서 선택적으로 포함할 수 있다.

상기 살균제는 히녹티올, 트리크로산, 크롤헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아즐렌(azulene),살리실산 및 징크피리타온으로 이루어진 군에서 선택적으로 포함할 수 있다.

상기 산화방지제는 부틸히드록시아니솔, 몰식자산, 몰식자산프로필 및 에리소르빈산 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.

상기 자외선 흡수제는 디히드록시벤조페논 등의 벤조페논류, 멜라닌, 파라아미노벤조산에틸, 파라디메틸아미노벤조산 2-에틸헥실에스테르, 시녹사이트, 파라메톡시계피산 2-에틸헥실에스테르, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐) 벤조트리아졸, 우로카닌산 및 금속산화물 미립자 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.

상기 소염제로는 글리틸리틴산디칼륨 또는 알란토인을 사용할 수 있고, 청량제로는 고추틴크 또는 1-멘톨을 사용할 수 있다.

본 발명의 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 상처 치료용 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 어성초 추출물 제조

어성초 건조물을 100 메쉬가 되도록 믹서기로 분쇄하여 사용하였으며, 어성초 분말 1 중량부에 대하여 10 중량부의 70%(v/v) 에탄올을 넣고 80℃에서 6시간 동안 추출하였다. 추출물은 필터(3M사, USA)로 여과하여 4℃에 보관하였고, 여과한 후 어성초 잔여물 1 중량부에 대하여 10 중량부의 70%(v/v) 에탄올을 넣고 섞어준 뒤 80℃에서 6시간 동안 추출하여 획득한 추출물은 필터로 여과하여 4℃에 보관하였던 추출물과 혼합한 후, 감압농축 후 동결건조하고 입자 균질화(400 메쉬)를 실시한 후, 4℃에 보관하여 사용하였다.

2. 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 제조

상기 제조한 어성초 추출물과 티모신 β4을 하기 표 1에 개시한 바와 같이 함량별로 혼합물을 제조하여 하기 실시예에 사용하였다.

어성초 추출물 및 티모신 β4의 함량(%)별로 제조한 혼합물

혼합물(%)	0	3	6	8	10	20	30	40	50	60
어성초 추출물(%)	100	97	94	92	90	80	70	60	50	40
티모신 β4(%)	0	3	6	8	10	20	30	40	50	60

3. 세포 배양

케라틴 세포(Keratinocyte; HaCat cell)는 세포라인 서비스(CLS, Eppelheim, Deutschland)에서 구입하여 형태를 관찰하며 10회 이하로 계대배양한 세포를 실험에 사용하였다. HaCat 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지를 사용하여 37℃의 온도 및 5%의 CO₂ 인큐베이터에서 계대배양하며 실험에 사용하였다.

인간모유두세포(Human follicle dermal papilla cell)는 프로모셀 (Heidelberg, Germany)사에서 구매하여, 48세 백인 남성(cell viability: 91%)으로부터 채취한 인간모유두세포를 본 실험에 사용하였다. 인간모유두세포는 Supplement mix(Promocell, Heidelberg, Germany)를 혼합한 모유두세포 생장배지(Promocell, Heidelberg, Germany)를 사용하여 37℃의 온도 및 5%의 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 세포의 특성상 실험은 계대(passage) 4~6 사이의 세포를 사용하였다.

지방전구세포인 3T3-L1 세포는 한국세포주은행으로부터 분양받아 10% FBS와 1% 항생제/항진균제가 들어있는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 실험 전체기간 동안 2일 간격으로 배지 교환을 수행하였다.

4. 세포독성 측정

본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물의 케라틴 세포, 인간모유두세포 및 지방전구세포에 대한 세포독성은 그린 등의 방법(Green LM et al., 1984, J. Immunol. Methods, 70, 257-268)을 통해 측정하였다. 96-웰 플레이트에 섬유아세포(CCD-986sk)를 2×10⁴ 세포/mL, 인간모유두 세포(HFDPC)는 4×10⁴ 세포/mL 및 지방전구세포(3T3-L1)는 1×10⁵ 세포/mL의 농도로 계대배양하고, 24시간 동안 안정화시켰다. 일정 농도의 시료를 처리하여 24시간 반응 후 MTS(5-3-carboxymethoxyphenyl-2-4,5-dimethylthiazolyl-3-4-sulfophenyl tetrazolium inner salt; Promega, Madison, WI, USA) 시약을 10㎕씩 첨가하였다. 반응 4시간 후 마이크로플레이트 흡광도 리더 EPOCH(BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 생존율은 대조구의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

5. 지방전구세포 분화 확인

12-웰 플레이트에 3T3-L1 세포를 1×10⁴ 세포/mL로 접종(seeding)하여 2일 간격으로 배지를 교환하고 4일간 배양하였다. 지방세포로 분화를 유도하기 위해, 분화배지(DMII: 0.5mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 0.25μM dexamethasone, 1mg/mL insulin 및 100μM indomethacin)를 처리하였으며, 이때, 각 시료의 분화 효과를 확인하기 위해 시료를 일정 농도로 동시 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후, 인슐린 배지(1mg/mL의 insulin)로 교체하고 48시간을 더 배양을 하였다. 배양이 끝나면, Oil red O 염색을 이용하여 지방전구세포의 분화를 확인하였다.

6. Oil red O 염색

일정 농도별로 처리한 시료가 3T3-L1 세포의 분화를 유도하는 결과를 Oil red O 염색을 통해 확인하였다. 분화된 3T3-L1 세포에 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 처리하여 48시간 동안 배양한 후, PBS(phosphate bufferd saline, Gibco, Waltham, MD, USA)로 3회 세척한 뒤 4% 파라포름알데히드로 4℃에서 30분간 고정하였다. 고정된 세포는 PBS로 3회 세척한 후 4℃에서 1시간 동안 0.5%　Oil red O 염색시약(in 60% isopropanol and 40% water)으로 염색한 뒤 PBS로 3회 세척하였다. 염색된 지방은 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 용해한 후 500㎚에서 흡광도를 측정하였다. 지방함량은 대조군의 흡광도 평균값에 대해 백분율로 계산하였다.

7. NO(Nitric oxide) 생성 측정

RAW 264.7 세포로부터 생성되는 활성 질소종인 NO(nitric oxide)의 양은 세포 배양액 중 존재하는 NO₂ ^-형태를 그리스 시약(A reagent: 1% sulfanilamide, B reagent: 0.1% naphthylethylendiamine in 25% phosphoric acid)과 반응시켜 측정하였다. 대식세포인 RAW 264.7 세포주를 1×10⁵ 세포/mL 농도로 96-웰 플레이트에 분주한 후 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포배양 상등액 100㎕와 그리스 시약 50㎕를 혼합하여 96-웰 플레이트에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO₂ ^- 표준곡선은 NaNO₂를 농도별로 조제하여 사용하였다.

8. TGF - β1 유전자 발현량 측정

(1) mRNA 추출

1ml의 트리졸을 세포가 들어있는 플레이트에 분주한 후 피펫팅(pipetting) 하여 세포를 용해시킨 후, e-튜브에 세포를 모아 볼텍싱(vortexing) 한 뒤, 스핀다운(spindown)시켰다. 이후에, 200㎕의 클로로포름을 가하고 볼텍싱한 뒤에 원심분리하였으며, 미리 이소-프로판올 500㎕을 첨가한 새로운 e-튜브에 상층을 따서 인버팅(inverting) 해준 뒤 다시 원심분리하고, 이후에 펠렛(pellet)만 남기고 유기 용매를 제거하였다. 마지막으로 완벽하게 펠렛을 말려준 뒤 DEPC-DW에 녹여 보관하였다.

(2) cDNA 합성

분리된 RNA는 실험에 다루기 어렵기 때문에 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용해 모두 DNA로 바꾸는 과정이 필요하다. 합성 과정은 정량해둔 RNA 농도를 통일하여 올리고 1㎕의 올리고 dT 및 1㎕의 dNTP로 총 부피를 10㎕로 맞춘 뒤, 변성(denaturation)을 위해 65℃에 5분간 두었다. 바로 아이싱(icing) 한 후, 하기 표 2에 개시한 바와 같이 혼합물을 제조하였다. 가볍게 태핑(tapping) 해준 후 42℃에서 1시간 정도 반응시키고 효소 비활성화를 위해 95℃에서 5분간 두었다가 아이싱해주었다.

cDNA 합성을 위한 시약

시약	부피(㎕)
Template RNA primer mixture	10
5x primscript buffer	4
Rnase inhibitor(40U/㎕)	0.5(20units)
primescript RTase(200U/㎕)	1.0(200units)
Rnase free DW	총 부피가 20이 되도록 함

(3) RT- PCR

RT-PCR은 그 유전자의 단백질 발현을 확인하려는 목적으로 하는 실험일 뿐만 아니라, 목표 유전자의 양을 정확하게 측정하는데 이용되는 중요한 도구라 할 수 있다. 따라서 2x SYBR 그린 믹스, DNA, 프라이머(forward & reverse) 및 증류수(DW)를 잘 혼합하여 총 부피가 20㎕가 되도록 하고 RT-PCR을 수행하였다.

9. 통계 처리

결과는 SPSS(Statistical Package for Social Science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였으며, 3회 반복한 측정값을 평균값 ± 표준편차(means±SD)로 표시하였다. 시료 간의 유의적인 차이는 DMRT 분석(Duncan's Multiple range Test)으로 유의수준 5%(p > 0.05)에서 검증하였다.

실시예 1. 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 처리에 따른 세포독성 확인

(1) 케라틴 세포

케라틴(HaCaT) 세포주에 어성초 추출물과 티모신 β4의 혼합 비율에 따라 제조한 혼합물(이하 '시료'라 함)들을 10, 50, 100 및 500㎍/mL의 농도로 처리하여 각 시료에 대한 세포 독성을 확인하였다(표 1). 그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 500㎍/mL 처리농도에서 세포 생존율이 약간 감소하였을 뿐, 다른 농도에서는 세포 생존율이 대조군(control)과 유사하게 유지되는 것을 확인하였으며, 특히 10, 50 및 100㎍/mL의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물(40%; 전체 100 중량부에 대해 60 중량부의 어성초 추출물 및 40 중량부의 티모신 β4을 혼합한 혼합물)의 경우, 대조군(control)에 비해 세포 생존율이 증가한 것을 확인하였다.

(2) 모유두세포

인간모유두세포(HFDPC: Human follicle dermal papilla cell)는 모근 아래쪽에 둥근 모양의 모구(hair blub), 그 하부에서 혈관과 신경을 통해 모발에 영양을 공급하고 모모세포(hair matrix cell)를 분열하게 하여 모낭의 성장을 조절하며, 모발을 형성케 함으로써 발모와 탈모에 관여한다. 따라서 인간모유두세포에 어성초 추출물과 티모신 β4의 혼합 비율에 따라 제조한 혼합물(이하 '시료'라 함)들을 10, 50, 100 및 500㎍/mL의 농도로 처리하여 각 시료에 대한 세포 독성을 확인하였다(표 1). 그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 500㎍/mL 처리농도에서 세포 생존율이 약간 감소하였을 뿐, 다른 농도에서는 세포 생존율이 대조군(control)과 유사하게 유지되는 것을 확인하였다.

(3) 지방전구세포

지방전구세포(3T3-L1)는 모낭세포의 활성을 조절하고 생체 내에서 모발 주기의 성장기를 유도하며, 피하조직(hypodermis) 내의 지방조직은 체온조절 및 완충 기능으로 모근을 보호하고 혈관을 통해 영양분을 제공한다. 따라서 지방전구세포에 어성초 추출물과 티모신 β4의 혼합 비율에 따라 제조한 혼합물(이하 '시료'라 함)들을 10, 50, 100 및 500㎍/mL의 농도로 처리하여 각 시료에 대한 세포 독성을 확인하였다(표 1). 그 결과, 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물의 모든 처리농도에서 대조군(control)과 유사하게 세포 생존율이 유지되는 것을 확인함으로써, 세포독성이 없는 것을 확인하였다.

실시예 2. 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 처리에 따른 항염증 효과

본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 처리에 따른 대식세포 내 LPS에 의한 산화질소(NO) 생성에 미치는 효과를 확인하였다. Raw 264.7 세포에 어성초 추출물과 티모신 β4를 함량별로 혼합하여 제조한 혼합물들을 처리하여 NO 생성율을 측정한 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물들은 농도의존적으로 NO 생성을 억제시키는 것을 확인함으로써, 모낭염 등에 의한 탈모증상 완화에 이용 가능할 것으로 판단된다.

실시예 3. 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 처리에 따른 지 방전구세포 분화 촉진효과

지방조직으로 구성된 피하조직(hypodermis)은 체온조절 및 완충 기능과 혈관을 통해 모발에 영양분 제공 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 따라서 지방전구세포(3T3-L1)에 어성초 추출물과 티모신 β4의 함량별로 혼합하여 제조한 혼합물들을 10, 50, 100 및 500㎍/mL의 농도로 처리하여 각 시료에 대한 지방세포로의 분화율을 측정하였다. 그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 대부분의 시료는 농도의존적으로 지방전구세포를 분화시켰으며, 특히 50%으로 표시된 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물(50%; 전체 100 중량부에 대해 50 중량부의 어성초 추출물 및 50 중량부의 티모신 β4을 혼합한 혼합물)과 60%으로 표시된 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물(60%; 전체 100 중량부에 대해 40 중량부의 어성초 추출물 및 60 중량부의 티모신 β4을 혼합한 혼합물)에서 지방전구세포의 분화율이 증가하여 지방 축적율이 현저히 증가한 것을 확인하였다.

실시예 4. 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 처리에 따른 TGF-β1 발현 억제효과

TGF(transforming growth factor)-β1는 탈모를 유도하는 인자로, 다음 세포를 억제함으로써 모모세포의 활성 촉진, 모근세포의 혈행 촉진, 피지분비의 억제, 남성 호르몬 전환의 억제, 발모주기 중 성장기에서 퇴행기 및 휴지기로 이행을 완화 시킬 수 있다. 따라서 본 실시예 4에서는 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 처리에 따른 TGF-β1 발현 억제효과를 확인하였다. 그 결과, 도 6에 개시한 바와 같이 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물은 어성초 추출물 및 티모신 β4를 단독으로 각각 처리하였을 때보다 TGF-β1의 발현을 저해하였으며, 특히 본 발명의 어성초 추출물 및 티모신 β4의 혼합물 L(혼합물 100 중량부에 대하여 50 중량부의 어성초 추출물 및 50 중량부의 티모신 β4를 혼합한 혼합물) 및 M(혼합물 100 중량부에 대하여 40 중량부의 어성초 추출물 및 60 중량부의 티모신 β4를 혼합한 혼합물)의 경우, 어성초 추출물 및 티모신 β4를 단독으로 각각 처리하였을 때보다 TGF-β1의 발현을 현저하게 저해시키는 것을 확인하였다.

Claims

어성초 에탄올 추출물 및 티모신 β4를 35~55:45~65의 중량비로 혼합한 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 헤어 컨디셔너, 헤어 토닉, 헤어 크림, 헤어 로션, 헤어 오일, 헤어 스프레이, 샴푸 또는 린스의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
어성초 에탄올 추출물 및 티모신 β4를 35~55:45~65의 중량비로 혼합한 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 약학 조성물.