KR101724870B1 - 두피 염증 완화와 Wnt/β-catenin 신호전달 활성을 갖는 모발성장 촉진 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전호(Anthriscus Sylvestris)와 목향(Saussurea Lappa)과 지모(Anemarrhena Asphodeloides root), 고삼(Sophora Angustifolia), 새삼씨(Cuscuta Japonica Seed), 황금(Scutellaria Baicalensis)의 추출물을 투여함으로서 Wnt/β-catenin signaling을 촉진하고, 자가면역 활성에 의한 모낭세포 축소를 방지하기 위해 목향 추출물을 이용하여 항염증을 완화하여 모발성장을 촉진하도록 한 조성물을 제공한다.

Description

두피 염증 완화와 Wnt/β-catenin 신호전달 활성을 갖는 모발성장 촉진 조성물{Activity promoting composition of Wnt/β-catenin signaling with Anthriscus sylvestris Hoffm extract}

본 발명의 모발성장 촉진조성물은 전호(前胡)(Peaucedani Radix) 추출물과 지모 추출물을 유효성분으로 하여 Wnt/β-catenin signaling 활성을 촉진하고 목향 추출물을 이용하여 항염증을 완화하여 모발성장을 촉진하도록 한 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 전호 추출물로부터 Wnt/β-catenin signaling을 활성화하여 피부하에 존재하는 줄기세포를 자극하여 모낭세포로 전환시키거나 또는 모낭세포의 재생을 돕고 목향 추출물을 이용하여 염증을 완화하여 두피와 모낭세포를 건강하게 하여 탈모방지 및 모발재생에 효과적인 모발성장 촉진 전호 추출물을 유효성분으로 하는 모발성잘 촉진 조성물에 관한 것이다.

탈모란 모발이 있어야 할 부위에 없거나 빈약한 상태를 말하며 모발 생성에 필요한 영양공급과 신진대사가 원활하게 이루어지지 않아 생기는 진행성 질환으로 분류하기도 한다. 탈모는 크게 남성형 탈모, 여성형 탈모, 원형 탈모 등으로 나누어지며 일반적으로 남성에게는 M자형 탈모가 많고 여성에게는 원형탈모가 많이 발생 한다. 탈모로 인해 외형적 변화는 많은 스트레스와 심리적 불안, 외형적 컴플랙스를 안겨 주어 탈모로 인해 많은 시간과 돈을 투자 하게 되므로 현대인에게 있어서 탈모는 심각한 고민거리로 자리잡고 있다.

탈모의 일으키는 요인들은 아직까지 명확하지 않지만, 유전적 요인, 남성호르몬 작용, 혈액순환 장애, 피지분비의 이상, 모낭충, 스트레스, 영양불량, 과도한 헤어제품사용, 질병 및 약물, 면역계의 혼란(자가면역 대식세포의 활성), 피부질환, 노화현상등 여러 가지 요인들에 의해 복합적으로 발생할 수 있고 탈모의 근본적인 원인은 모낭(hair follicle)의 순환생리를 근거하여 설명할 수 있다.

모낭세포의 순환생리는 머리카락이 성장하는 성장단계(Anagen), 퇴화단계(catagen), 휴지기 또는 정체기단계(Telogen)의 3가지 단계가 순차적으로 거듭되어 이루어지고 이에 따라 머리카락이 자라고 탈락하는 과정이 반복된다.

상기 여러 가지 요인에 의해서 수많은 유전자와 단백질들이 상호작용을 통해서 모낭세포를 축소시키면 주기가 순환하지 못하고 휴지 또는 정체기단계(Telogen)에 머무르는 모낭세포가 많아지게 되어 머리카락이 탈락하는 alopecia(대머리)상태가 되는데 이러한 상태를 탈모라 한다.

탈모를 치료하기 위한 방법으로 약물치료, 모낭이식수술, 민간요법, 한방치료, 탈모 기능성 샴푸 및 헤어토닉 제품등 다양한 방법등이 있다. 최근 연구개발을 통해서 로게인, 판토가, 드로젠등 다양한 발모 치료제가 시판되고 있다. 최초의 탈모 치료제인 로게인(Rogain)은 미 식약청 (FDA) 허가를 받은 안전한 제품이고 두피 혈액순환을 촉진시키지만 근본적인 치료효과는 없고 판토가(pantogar)는 맥주 효모에 포함된 다양한 아미노산과 미네랄이 모발에 영양을 공급하나 큰 치료는 없으며 한방 동의보감의 감초 약재 성분을 포함하여 아리메진산 비타민이 주성분인 드로젠(Drogen)은 발모에 대한 근거가 부족한 한방성분 발모 치료제로 상기의 탈모 치료제들은 부작용을 수반하거나 효과적인 치료는 기대하기 힘들뿐더러 근본적인 탈모치료방법이 아니다.

근본적인 탈모를 치료하기 위해서 Anagen의 모낭세포를 증가시키고 Catagen 과 Telogen의 세포를 감소시키는 치료하는 방향으로 접근하고 있다. 모낭세포를 telogen 상태로 유지키는 중심되는 유전자로는 Dkk-1가 있고 Dkk-1은 모낭세포에 필요한 단백질의 발현을 억제함으로써 모낭세포가 Apoptosis로 이르게 한다. Dkk-1의 발현을 증가시키는 cytokine으로는 TGF-1β, BMP2/4, IL-1β등과 testosteron의 변형체인 DHT의 작용을 들 수 있다. Testosterone 호르몬은 5α-reductase에 의하여 DHT로 변화하고 DHT가 모낭세포에 작동하여 세포분열을 억제하고 모낭세포를 휴지기(telogen phase)로 이동하게 하기 때문에 5α-reductase을 불활성화 시키거나 억제(inhibition) 시켜 주면 탈모 증상이 완화되고 모발이 가늘어지게 되는 연모화 현상 또한 호전시킬 수 있다.

따라서 DHT의 발생을 방지하는 발모치료제가 일반적인데 프로페시아와 아보다트(Avodart)가 대표적인 예이다. 그러나 프로페시아의 경우 여성이 장기복용하면 기형아 출산확률이 높고 남성의 경우 발기부전과 같은 부작용이 발생하며 아보다트 또한 부작용이 높은 문제점이 있다.

최근 부작용을 수반하지 않는 모낭세포의 재생을 이용하는 방법에 대한 연구가 활발해지고 있고, 모낭세포의 재생에는 Wnt/β-catenin, Noggin, shh, IGFs등이 매우 중요한 역할을 수행하고 있으며 특히 Wnt/β-catenin은 모낭세포 활성화와 재생에 있어서 매우 중요한 위치에 있다.

국내특허공보 제10-2004-0012121호에는 전호 추출물은 각종 염증 및 알러지 질환의 원인이 되는 PAF의 생성을 억제하며, 시클로옥시게나제-2 및 리폭시게나제(5-LO)의 활성을 저해하여 에이코사노이드 (eicosanoid)의 생성을 방지함과 동시에 비만세포로부터 히스타민(histamin)의 방출을 억제하는 전호 추출물을 포함하는 염증 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관하여 개시되어 있다. 국내특허공보 제10-2004-0081943호에는 박테리아, 바이러스 질병을 위한 백신과 같은 항원과 동시에 투여되는 경우 면역학적 보조제로 작용하는 신규의 조성물, 적어도 본 발명의 조성물을 포함하는 신규한 면역보조제 조성물, 항원과 본 발명의 보조제 조성물을 포함하는 신규한 약학적 조성물 및 면역화하려는 동물에 대한 항원과 함께 동시 투여함으로써 동물을 면역화하는 전호 추출물을 포함하는 면역보조제에 관하여 개시되어 있다. 국내특허공보 제10-2008-0124722호에는 바디나물(자화전호) 추출물 또는 이의 분획물은 염증성 매개체인 사이토카인 및 케모카인의 생산 또는 분비를 억제하며, 부종을 억제하므로, 이를 유효성분을 함유하는 조성물은 부종 또는 피부염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 바디나물 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 부종 또는 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관하여 개시되어 있다. 그러나 상기 선행문헌들은 전호 추출물을 염증관련 질환을 치료 목적으로 이용하고 있고, 본 발명에서와 같이 전호 추출물을 이용하여 모낭세포 재생에 작동 기작인 Wnt/β-catenin signaling을 활성화하여 피부하에 있는 줄기세포를 자극하여 모낭세포의 재생에 우수한 효과를 갖도록 한 본 발명의 기술적 특징과는 차이를 보인다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 전호(前胡)(Peaucedani Radix) 추출물과 지모 추출물을 유효성분으로 하여 Wnt/β-catenin signaling 활성을 촉진하고, 자가면역 활성에 의한 모낭세포 축소를 방지하기 위해 목향 추출물을 이용하여 항염증을 완화하여 모발성장을 촉진하도록 한 조성물을 제공한다.

본 발명은 전호(Anthriscus Sylvestris)와 목향(Saussurea Lappa) 과 지모(Anemarrhena Asphodeloides root) , 고삼(Sophora Angustifolia) , 새삼씨(Cuscuta Japonica Seed) , 황금(Scutellaria Baicalensis) 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 모낭세포활성 촉진 조성물을 제공한다.

전호와 목향과 지모, 고삼, 새삼씨, 황금 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 모낭세포활성 촉진 조성물을 제공한다. 상기 추출물은 물 또는 70~95% 농도의 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출한 것을 특징으로 하며, 전호는 15 - 25중량%, 지모는 15 - 25중량%, 목향은 5 - 15중량%, 고삼 20중량%, 새삼씨 15중량%, 황금 10중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 모낭세포활성 촉진 조성물을 제공한다.

특히, 전호 추출물과 지모 추출물은 각각 100ug/ml 이하의 양으로 포함되고 목향 추출물은 5-10ug/ml의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 모낭세포활성 촉진 조성물을 제공한다

본원방명의 전호, 지모, 새삼씨, 황금, 고삼, 목향 추출물로 구성된 본원발명의 추출물이 함유하는 헤어토닉 제품이 두피를 관리 하여 염증을 완화하고 Wnt/β-catenin signaling을 활성화하여 모낭세포의 생리활성을 높이고 재생을 촉진하며 또한 5a-reductase활성을 저해하여 두피와 모낭세포를 건강하게 하여 탈모 방지, 두피 가려움증 개선, 비듬생성 억제에 우수한 효과를 갖는다.

도 1은 목향 추출물의 처리농도에 따른 NO(Nitro -oxide)측정 결과이다.
도 2는 목향 추출물의 처리농도에 따른 NO(Nitro -oxide)측정 결과이다.
도 3은 목향 추출물의 처리농도에 따른 XTT-assay를 실행한 결과이다. 도 4는 목향 추출물의 농도에 따른 유전자 IL-1β의 발현 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 목향 추출물의 농도에 따른 유전자 IL-6의 발현 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 목향 추출물의 농도에 따른 유전자 iNOS의 발현 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 목향 추출물의 농도에 따른 유전자 HO-1의 발현 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 (D-51)전호 추출물과 미녹시딜이 HEK293 세포에 미치는 cytotoxity 및 proliferation에 대한 실험을 위한 XTT-assay를 시행한 결과이다.
도 9는 전호 추출물의 Wnt/β-catenin signal 활성을 실험한 결과이다.
도 10은 지모 추출물의 Wnt/β-catenin signal 활성 실험결과이다.
도 10은 동물에 대한 본 발명의 모발 성장 촉진 조성물의 효능 시험결과 사진이다.

이하, 본 발명과 관련된 실시예와 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

I. 목향의 항염증 효과 실험

1. 목향의 알코올 추출물 제조

목향 중량 1kg을 깨끗이 세척하고 잘게 절단한 후 부직포에 담아, 메탄올, 에탄올과 같은 저급 알코올, 바람직하게는 70~95% 에탄올을 중량 비율로 10배 가하여 추출기(Cosmo660)를 이용하여 70℃에서 9시간 동안 추출하였다. 추출물을 냉각시킨 후 여과지(Whatman사 제조)를 이용하여 잔여 고형분을 제거 하였다. 걸러진 여과액을 회전 증발기 통산의 농축기를 사용하여 감압 건조시켜 최종 추출물을 제조하였다.

2. 항염증 효과 실험

1) 세포배양

RAW264.7 mouse의 대식세포(macrophage)를 RPMI1640 배지와 FBS(Fetal Bovine Serum) 10%와 anti-biotics(pen-strep)를 포함하는 배지에서 5% Co2와 37℃의 Co2 incubator에서 배양한다. 대식세포는 culture plate에서 세포 confluence 가 80%가 넘지 않도록 유지하며 키운다.

2) Griess assay

mouse의 대식세포인 RAW264.7에 천연 추출물(목향)의 농도별 시간별로 처리하고 inflammatory factor인 LPS(Lipopolysaccaride)을 처리하여 NO(Nitro -oxide)을 측정함으로서 염증 방호 효능에 대한 기초 자료를 확보하였다.

RAW264.7 대식세포를 96 well culture plate에 각 Well 당 5X10⁴개 세포씩 배양 하고 24시간 동안 안정화 시킨 후 NO가 분비 되는 조건을 주기 위하여 염증 유발 물질인 LPS를 처리하고 여기에 시료농도 별로 각각 같이 처리하여24시간 동안 노출 후 배양된 배지를 수집하여 배양배지와 Griess reagent를 섞어준 후 상온에서 15분간 반응 후 Elisa leader 장비를 이용하여 흡광도 540nm에서 측정하여 그 값을 확인 하였다.

도 1은 목향 추출물의 처리농도에 따른 NO(Nitro -oxide)측정 결과이다. 목향 추출물을 배양된 RAW264.7 세포에 1ug, 5ug, 10ug/ml의 농도로 처리 하고 동시에 LPS를 처리하고 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양 하고 결과를 확인하기 위하여 배양된 배양액과 Griess reagent와 혼합하고 상온에서 15분간 반응 하고 난 후, ELISA leader기로 540nm의 파장으로 결과 값을 읽어 주었다.

목향 추출물 1ug/ml의 농도에서도 높은 NO 생성 억제 효과를 보여 주고 있고 5ug/ml이상에서의 농도에서는 LPS를 처리하지 않은 N.C(negative control)의 결과 값과 비슷한 수치를 보여 주고 있다. 이로부터 목향 추출물은 강력한 NO 생성 억제 효능을 나타내고 있음을 확인하여 주었다.

3) 세포 독성 및 세포 성장률 측정

96well plate에 RAW264.7 대식세포를 5X10⁴개 세포 수로 각 well에 분주한 후 24시간 동안 배양하고 시료를 농도별로 처리하고 다시 24시간 동안 노출 시켰다. Tetrazolium salt를 이용한 dehydrogeanse assay (XTT assay) 방법을 이용하여 세포 독성 및 성장률을 측정하였다.

도 2는 목향 추출물의 처리농도에 따른 XTT-assay를 실행한 결과이다. 목향 추출물의 RAW264.7 세포에게 있어서 독성을 나타내는지에 대한 확인을 위하여 세포 생존율 및 증식률 체크을 위한 XTT assay 을 시행 하였다. 추출물은 1ug/ml~10ug/ml의 농도까지 확인 하였다. 본 실험의 최고 농도인 10ug/ml에서도 세포에 독성을 나타내지 않고 있음을 확인할 수 있었다.

4) 항염증 유전자 발현 확인

RAW264.7 대식세포를 6well plate에 배양하고 시료를 LPS 처리 1시간 전에 먼저 처리하고, LPS를 처리하여 6시간 동안 배양하여 Trizol(QIAGEN)시약을 이용하여 세포의 totla RNA를 추출한다. 추출된 total RNA를 reverse transcriptase와 oligo dT를 이용하여 cDNA를 합성한다. cDNA는 특정유자자의 primer (b-actin, IL-1β, IL-6, iNOS)를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)를 시행하고 agarose gel에 전기영동하여 특정 유전자의 발현 수준을 확인하였다.

도 3은 목향 추출물의 농도에 따른 유전자 IL-1β의 발현 결과를 나타내는 그래프이다. 목향 추출물의 항염증 기작을 확인하기 위하여 RAW264.7 세포에서 추출물이 유전자 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 염증관련 cytokine 유전자인 IL-1β을 조사한 결과 목향 추출물에 대하여 농도 의존적(dose-dependant) 결과를 보여주고 있다.

도 4는 목향 추출물의 농도에 따른 유전자 IL-6의 발현 결과를 나타내는 그래프이다. 목향 추출물의 항염증 기작을 확인하기 위하여 RAW264.7 세포에서 추출물이 유전자 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 염증관련 cytokine 유전자인 IL-6을 조사한 결과 목향 추출물에 대하여 농도 의존적(dose-dependant) 결과를 보여 주고 있다.

도 5는 목향 추출물의 농도에 따른 유전자 iNOS의 발현 결과를 나타내는 그래프이다. 목향 추출물의 항염증 기작을 확인하기 위하여 RAW264.7 세포에서 추출물이 유전자 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인 하였다. 염증관련 cytokine 유전자인 iNOS을 조사한 결과 목향 추출물에 대하여 농도 의존적(dose-dependant) 결과를 보여 주고 있다.

도 6은 목향 추출물의 농도에 따른 유전자 HO-1의 발현 결과를 나타내는 그래프이다. 목향 추출물의 항염증 기작을 확인하기 위하여 RAW264.7 세포에서 추출물이 유전자 발현에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인 하였다. 항산화 지표 유전자인 HO-1의 발현 양상을 확인한 결과 목향 추출물에 대하여 농도 의존적(dose-dependant) 결과를 보여 주고 있다.

이상과 같이 목향 추출물의 경우 염증 관련 유전자 지표물질 IL-6, IL-1β, 와 iNOS의 발현을 현격히 감소시켜 염증 발생을 억제하는 강력한 항염증 효과를 나타내고 있는 것을 알 수 있다. 또한 항염증 효능이 높은 물질의 경우 생체내에 존재하는 항산화 효소인 HO-1 (Hemo-oxygenase-1)의 발현을 증가시키는 경우가 있어 HO-1의 발현에 영향을 미치는지에 대한 유전자 조사를 시행한 결과 목향 추출물이 높은 HO-1 발현을 증가시킴을 확인하였다. HO-1은 세포의 섬유화(fibrosis)와 매우 밀접한 상관관계가 있고, ROS의 제거에도 효과적인 효소이다.

II. 전호와 지모의 Wnt/β-catenin 신호전달 활성화 능력 측정 (TOP-Flash assay)

1. 전호와 지모 추출물의 제조

전호(Peaucedani Radix)와 지모를 각각 0.1mm 이하로 분쇄시키는 세절과정, 분쇄된 전호와 지모를 각각 유기용매를 사용하여 추출하는 과정을 거쳐 30~95% 농도의 에탄올 또는 3차 증류수를 전호와 1:10의 비율로 혼합시켜주는 혼합과정으로 이루어진다,

상기 혼합물을 40~90℃온도에서 약 6~24시간 동안 교반하여 추출액을 얻는 추출과정, 상기 추출액을 농축기를 이용하여 에탄올을 제거하고 동결건조 또는 speed vac system을 이용하여 건조 추출물을 얻고 추출물의 함량을 결정하는 건조과정으로 이루질 수 있고, 상기 건조 추출물을 물 또는 에탄올과 같은 용매에 용해시켜 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다.

1) TOP-Flash plasmid vector transfection

HEK293 세포를 24-well plates에 2X10⁴ cells/wll로 분주하고 incubator에서 하루 동안 배양한다. 배양배지는 anti-biotics을 제거한 배지로 교환하고 Opti-MEM 50ul, TOP-flash plasmid 0.5ug, β-galactosidase plasmid 0.1ug, Lipofectamine 6ul를 상온에서 혼합하여 반응시킨 후 혼합액을 각 well의 세포 배양배지 위에 뿌려주는 방식으로 세포에 plasmid들을 transfection 시켜준다. transfection 4~6 시간 후에 PBS로 두 번 세척하고 완전 배지로 교체하여 24시간 동안 CO₂ incubator에서 배양한다.

2) Luciferase Assay

Transfection 한 후 24시간이 지난 시점에 추출물들을 특정 농도로 처리하고 다시 24시간 동안 배양한다. 배양이 끝나면 세포를 차가운 PBS로 두 번 washing하고, 세포에 reporter lysis buffer를 15분 동안 처리하여 세포를 파괴한다. 이렇게 얻어진 lysate을 Luciferase 측정 전용 white 96 well plate와 β-galactosidase 측정을 위해 96well plate에 각각 분주한다.

각 실험군의 Wnt 활성도는 시료와 luciferase substrate을 4:1비율로 혼합하고, Luminometer로 방출되는 빛의 양을 측정함으로써 비교 분석한다. positive control로는 Wnt3b recombinant protein 200ng/ml를 세포에 직접 처리하였다. 2 X β-galactosidase enzyme assay buffer를 동량의 cell lysate가 분주된 96 well plate에 혼합하여 반응 시켜 주고 상온에서 약 15분간 반응시킨 후 420nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 각 시험군의 β-galactosidase 활성도가 각 세포의 transfection 효율을 나타내어준다. 각 실험군의 Wnt 활성도를 각각의 β-galactosidase의 활성도로 나누어 실험 군간 transfection 효율 차이를 보정하고, 이 보정값을 통계 처리하여 추출물의 최종 Wnt 활성능력을 도출하였다.

도 7은 (D-51)전호 추출물과 미녹시딜이 HEK293 세포에 미치는 cytotoxity 및 proliferation에 대한 실험을 위한 XTT-assay를 시행한 결과이다. 전호 추출물의 경우 최적의 용량은 100ug/ml의 농도 이하로 결정하였고, 마이녹실의 경우 3%이하의 농도로 결정하였다. 그 이상의 농도에서는 세포독성이 나타나기 때문에 실험 적정 농도를 결정할 수 있었다.

3) 전호 추출물의 Wnt/β-catenin signal 활성을 실험한 결과

도 8은 전호 추출물의 Wnt/β-catenin signal 활성을 실험한 결과이다. 실험결과의 신빙성을 주기 위하여 negative control(무처리), 에탄올 처리, DMSO만을 처리 한 것을 control로 사용하였다. 에탄올과 DMSO처리군은 전호 추출물의 용매로 사용 되었기에 이들이 실험 결과에 영향을 미치는지에 대한 검증을 하였으나 Luciferase의 발현에는 아무런 영향도 미치지 않았다. 탈모 치료제중 대표적인 물질인 미녹시딜 2.5%을 실험 대조군으로 사용하였고, 실험법이 제대로 작동하는지에 대한 검증을 위하여 positive control로 recombinant protein 인 Wnt3a 200ng/ml 을 처리 하였다. Wnt3a가 Top-flash system에 작동하여 높은 Lucifease 활성을 보여 주고 있다. 전호 추출물 100ug/ml처리한 실험군은 PC의 반응과 비슷한 수준으로 높은 반응도를 보여 주고 있다. 전호 추출물은 강력한 Wnt/β-catenin signaling activator로 작동함을 확인할 수 있었다.

4) 지모 추출물의 Wnt/β-catenin signal 활성을 실험한 결과

도 9는 지모 추출물의 Wnt/β-catenin signal 활성 실험결과이다. 실험결과의 신빙성을 주기 위하여 negative control(무처리), 에탄올 처리, DMSO만을 처리 한 것을 control로 사용하였다. 에탄올과 DMSO처리군은 D-51 추출물의 용매로 사용 되었기에 이들이 실험 결과에 영향을 미치는지에 대한 검증을 하였으나 Luciferase의 발현에는 아무런 영향도 미치지 않았다. 탈모 치료제중 대표적인 물질인 미녹시딜 2.5%을 실험 대조군으로 사용하였고, 실험법이 제대로 작동하는지에 대한 검증을 위하여 positive control로 recombinant protein인 Wnt3a 200ng/ml을 처리하였다. Wnt3a가 Top-flash system에 작동 하여 높은 Luciferase 활성을 보여 주고 있다. 지모 추출물 100ug/ml처리한 실험군은 control 군들에 비하여 높은 Luciferase 활성을 나타내었다.

<실시예>

1. 모발성장 촉진 조성물의 제조

모발 성장 촉진 조성비율은 표 1의 조성 비율에 따라 약재 원료를 구입(삼흥건재약업사)하여 준비하였다.

모발 성장 촉진 조성비율

천연 약재	조성비율(중량%)
전호	15 - 25
지모	15 - 25
고삼	20
새삼씨	15
황금	10
목향	5 - 15

1-1: 알코올 추출물 제조

상기 각각의 천연 약재 전체, 잎 또는 열매 총 중량 1kg을 깨끗이 세척하고 잘게 절단한 후 부직포에 담아, 메탄올, 에탄올과 같은 저급 알코올, 바람직하게는 70~95% 에탄올을 중량 비율로 10배 가하여 추출기(Cosmo660)를 이용하여 70℃에서 9시간 동안 추출하였다. 추출물을 냉각시킨 후 여과지(Whatman사 제조)를 이용하여 잔여 고형분을 제거 하였다. 걸러진 여과액을 회전 증발기 통산의 농축기를 사용하여 감압 건조시켜 최종 추출물을 235g을 제조하였다(이하 본원발명의 추출물이라한다.).

2. 모발 성장 촉진 조성물의 동물 효능 시험

2-1. 1차 모발 성장 촉진 효능 시험

2-1-1. 실험군 설정

동물에 대하여 본 발명의 모발 성장 촉진 조성물의 효능을 시험하였다. 6주령의 C57/BL-6 마우스 수컷 12마리(오리엔트)를 7일 동안 온도 21±3℃, 상대습도 50±5%, 조도 200~300 룩스, (12시간 on, off 순환) 실험실에서 적응시킨 후 건강한 동물 9마리만을 선택하여 시험에 사용하였다. 음용수로는 증류수를 자유 섭취시켰고 사료로는 실험 동물용 사료를 자유 섭취시켰다. 적응 기간중 건강에 이상이 없는 동물들의 체중을 측정한 후 평균 체중에 가까운 동물 9마리를 선택 하였다. 이렇게 선택된 동물을 무작위 선택하는 방법으로 3마리씩 3개군으로 분배하였고, 1군은 50% 에탄올 용액만을 도포하는 음성 대조군으로 2군은 모발 성장 효능이 알려진 미녹시딜 5%제품(현대약품)을 도포하여 양성대조군으로, 제 3군은 본 발명의 실시예에서 제조한 조성물이 포함된 실험군으로 책정하였다.

2-1-2. 시험 약물 도포

C57/BL6 마우스의 목뒤에서 꼬리 부분까지 등의 털을 우선 동물용 전기 이발기로 제거한 후, 다시 치오글리콜산(thioglycolic acid)성분의 제모제(태극약품, 비키로크림)를 바르고 3분 이내에 부드러운 휴지에 물을 적셔 털을 완전히 제거함과 동시에 약품을 제거하였다. 제모 후 3일간 안정시킨 후 각 시험 약물을 도포를 시작하였다.

각 시험 약물을 스프레이 용기에 담아 1회 도포시 약 1.5ml씩 제모한 마우스의 등쪽에 균일하게 도포하였다. 시험 약물 도포는 매일 20일 동안 계속하여 동일한 양과 동일한 방법으로 도포 실시하였다. 실험 결과를 확인하기 위하여 도포일을 Day 0부터 사진 촬영을 실시 하였다. 사진 촬영일은 Day 0, Day 7, Day 14, Day 16에 각각 촬영하였다. 도 10은 동물에 대한 본 발명의 모발 성장 촉진 조성물의 효능을 시험결과 사진을 나타낸다.

결과에 의하면 아무것도 도포하지 않은 마우스는 등전체가 회색 빛을 띄는 것으로 나타나 털의 성장이 가장 느리며, 대조군 미녹시딜을 도포한 쥐의 등부분은 꼬리부분의 성장이 느린 것으로 나타났다. 그러나 본원발명의 추출물을 도포한 경우 마우스의 등부분 전체가 검은 털이 성장하여 검정색의 밀도가 가장 높은 결과를 나타내었다.

3. 헤어토닉 조성물 제조

본 발명의 혼합 추출물의 효능을 토닉조성물(시료무첨가)과 비교하기 위하여 하기와 같아 대조군과 실험군의 헤어토닉 조성물을 제조하였다.

헤어토닉 조성물(단위:중량%)

원 료 명	대조군	실험군
D-판테놀	0.5%	0.5
멘톨	0.15	0.15
살리실릭 애씨드	0.15	0.15
본원발명의 추출물	-	10
에탄올	적량	적량
정제수	잔량	잔량
합계	100.0	100.0

4. 실험예

4-1. 실험예1 : 두피의 가려움 및 비듬 생성 억제 효과 측정

상기 실시예에서 얻은 헤어토닉 조성물의 대조군과 실험군의 두피 가려움 증 및 비듬생성 억제효과를 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 평소 비듬, 가려움증이 있는 남녀 피실험자 각각 20명을 대하여 하루 2회 헤어토닉 화장료를 사용하게 하였다. 4주간 사용 후 다음의 판정 방법에 따라 두피의 가려움 제거, 비듬생선 억제 효과를 관찰 하였다.

두피의 가려움 및 비듬 생성 억제 효과 측정결과

두피의 가려움 제거 및 비듬 생성 억제 효과	대조군	실험군
아주 우수	0	12
우수	3	7
조금 있음	12	1
효과없음	5	0

4-2. 실험예2 : 탈모 방지 효과 측정

상기 실시예에 얻은 헤어토닉조성물들의 탈모 방지 효과를 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 평소 탈모 현상이 있다고 느끼는 남녀 피실험자 각각 20명을 대상으로 하루 2회(아침 저녁)사용하게 하였고, 1주간 사용한 후에 빗질을 하여 탈모의 수를 체크하였다.

탈모 방지 효과 측정 결과

샴푸시 탈모의 수(개)	대조군	실험군
0-1	0	2
2-5	0	7
6-10	2	7
10-15	9	3
15개 이상	9	1

표 3, 4에 나타난 바와 같이 두피의 가려움 및 비듬 생성 억제, 탈모방지 효과에 대하여 전호, 지모, 새삼씨, 황금, 고삼, 목향 추출물로 구성된 본원발명의 추출물이 함유하는 헤어토닉 제품이 두피를 관리 하여 염증을 완화하고 Wnt/β-catenin signaling을 촉진하며 또한 5a-reductase활성을 저해하여 두피와 모낭세포를 건강하게 하여 탈모 방지, 두피 가려움증 개선, 비듬생성 억제에 우수한 효과를 보이는 것을 알 수 있었다.

또한 상기 실험예를 통하여 본원 발명의 추출물에 대한 홍반이나 피부자극 여부를 조사한 결과 어느 피실험자에게서도 부작용이 나타나지 않아 매우 안전한 조성물임이 입증되었다.

탈모관련 제품 시장의 규모는 매년 확대될 것으로 예상됨에 따라 기능성 천연 추출물을 이용한 본 발명을 통해서 국내 생산한 원료의 사용함으로서 농가소득 증대를 이룰수 있고, 두피의 염증을 완화시키거나 탈모의 주요한 원인 물질인 DHT의 발생을 억제를 통한 기술을 사용하는 현재 시판되는 제품들과는 달리 본 발명은 탈모의 근본적인 문제인 telogen phase의 모낭세포를 anagen phase로 재생시킬 수 있도록 전호와 지모 조성물을 이용한 Wnt/β-catenin signaling 활성화로 모낭세포 재생과 성장 및 유지에 도움을 주고 목향 추출물을 이용하여 항염증 효과를 얻을 수 있는 경쟁기술을 보유함으로서 대외국과의 수출을 통해 국부 창출에 기여 가능하므로 산업상 이용 가능성이 있다.

Claims (4)

1. 전호(Anthriscus Sylvestris) 15 - 25중량%와 목향(Saussurea Lappa) 5 - 15중량%와 지모(Anemarrhena Asphodeloides) 15 - 25중량%, 고삼(Sophora Angustifolia) 20중량%, 새삼씨(Cuscuta Japonica Seed) 15중량%, 황금(Scutellaria Baicalensis) 10중량%를 물 또는 70~95% 농도의 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 모낭 세포활성 촉진 조성물
2. 전호(Anthriscus Sylvestris)와 목향(Saussurea Lappa)과 지모(Anemarrhena Asphodeloides), 고삼(Sophora Angustifolia), 새삼씨(Cuscuta Japonica Seed), 황금(Scutellaria Baicalensis)의 원료를 각각 0.1mm 이하로 분쇄시키는 세절과정,
   상기 분쇄된 원료를 각각 70~95% 농도의 에탄올 또는 3차 증류수를 1:10의 비율로 혼합시켜 상기 혼합물을 40~90℃ 온도에서 6~24시간 동안 교반하여 추출액을 얻는 추출과정,
   상기 추출액을 농축기를 이용하여 에탄올을 제거하고 동결건조 또는 저온진공건조시스템(speed vac system)을 이용하여 건조 추출물을 얻는 과정,
   상기 건조 추출물 중 전호는 15 - 25중량%, 지모는 15 - 25중량%, 목향은 5 - 15중량%, 고삼 20중량%, 새삼씨 15중량%, 황금 10중량%으로 혼합하여 물 또는 에탄올과 같은 용매에 용해시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 모낭세포활성 촉진제의 제조방법
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