WO2018021847A1 - 암라 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 - Google Patents

암라 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 Download PDF

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hair growth
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hair loss
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PCT/KR2017/008104
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김종태
강은정
표용현
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주식회사 티젠 농업회사법인
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
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Definitions

  • the present invention has been made by the task number R0004737 in support of the Ministry of Trade, Industry and Energy, the research management professional organization of the project is the Jeonnam regional project evaluation group, the research project name is "economic cooperation zone industry development project", the research project name is "natural vegetable properties (Amra) , Hibiscus, etc.) Development of hair loss improvement fish care products using complex extracts, The leading organization is Damian Co., Ltd., the research period is from October 10, 2015 to September 30, 2018.
  • the present invention relates to a hair loss preventing or hair growth promoting composition, and more particularly to a hair loss preventing or hair growth promoting composition containing Amra extract.
  • Hair loss patients are rapidly increasing in the modern society, and their concern and concern are intensifying.
  • the hair on our scalp grows 0.3mm every day, growing a total of 15cm a year. It is known that 85% of the whole grows and the remaining 15% stops growing. Falling hair is mainly hair that has stopped growing, and hair loss means an increase in the percentage of hair that has stopped growing. Normally, 80 to 100 hairs fall out per day, otherwise 100 hairs Abnormalities are lost, the hair cell's strength is weakened, the growth phase is shortened and the period until the next growth period means that even grown hair does not grow properly.
  • Alopecia ( ⁇ ⁇ , Baldness) refers to the state of lack of hair, especially hair.
  • the most common causes of hair loss are genetic predisposition, male hormones, and aging phenomena.
  • beauty care such as blood circulation disorders, excessive stress, malnutrition, seborrheic dermatitis, and misuse of hair care products or excessive pigmentation It is also known to work in combination.
  • testosterone becomes 5- ⁇ dihydrotestosterone (DHT) by 5-a reductase, which delays protein synthesis of hair follicle cells, increases the proportion of resting hair follicles, and progresses hair loss with age. do.
  • DHT dihydrotestosterone
  • Hair loss treatment includes oral administration, topical application and hair transplantation.
  • FDA-approved drugs include Minoxidil and Finasteride.
  • Minoxidi l was developed as a vasodilator for the treatment of hypertension, but as a side effect, hirsutism was reported.
  • Finasteride which is used as an oral medicine, is used for the treatment of androgenetic alopecia by inhibiting the activity of 5- ⁇ reductase type ⁇ by lowering the concentration of dihydrotestosterone (DHT), an intermediate metabolite of androgens.
  • DHT dihydrotestosterone
  • the efficacy of minoxidil and finasteride is not uniform among people, and side effects have been reported.
  • treatment for alopecia is not perfect, The demand for effective and safe treatments is not decreasing. Therefore, it is necessary to differentiate research through the development of effective hair loss prevention and treatment using herbal medicines.
  • Amla contains a variety of nutrients, including phyl lembi ln, gal l ie acid, zeat in, vitamin C, especially 20 times orange and 160 times apple Contains natural vitamin C equivalent.
  • a main object of the present invention is to provide a composition for preventing hair loss or promoting hair growth, containing the ALA extract excellent in hair loss prevention or hair growth promoting effect.
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss or promoting hair growth using the extract of Amra as an active ingredient.
  • the extract can be extracted with any solvent conventionally used, preferably characterized in that extracted with water, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof.
  • the extract may be extracted by any extraction method used in the prior art, and preferably may be extracted by dipping in the solvent for 2 to 4 hours.
  • an extraction method using an extraction solvent conventional extraction methods of plants, for example, hot water extraction, reflux angle extraction, ultrasonic extraction, supercritical extraction and the like can be used.
  • the extract may be an ethanol extract, but is not limited thereto.
  • the extraction method is not particularly limited and includes, for example, hot water extraction, steam extraction, ultrasonic extraction and reflux extraction.
  • the drying step after concentration includes spray drying, hot air drying, freeze drying, vacuum drying, vacuum drying, foam drying, high frequency drying, infrared drying, and the like.
  • the extract is characterized in that it is used as a material of the functional tea bag by concentrating and powdering.
  • the term 'functional tea bag tea' of the present invention is a tea (Tea) which has enhanced specific functions such as digestive function improvement, skin soothing effect, bronchial improvement, and the like, specifically, tea leaves or leaves that have undergone a differential or cotton, nylon sieve. Enhanced specific features in the back pocket It is called a car.
  • the tea powder was concentrated and powdered by strengthening the hair loss prevention or hair growth promoting function.
  • the extract is characterized in that it is used as a material of functional shampoos and treatments.
  • the result of confirming in vivo experiments to confirm the wool capacity of the Amla extract of the present invention the Amla extract showed an excellent or similar level of wool capacity compared to the positive control, skin tissue
  • the number of hair follicles increased similarly to the positive control.
  • the enzyme activity is increased when the Amra extract is treated.
  • the extract of Amla was confirmed to increase the expression of hair growth factor.
  • Amra extract is suitable as an antioxidant that helps the blood circulation of the scalp and reduces the free radicals that destroy proteins, thereby reducing DHT, the main cause of hair loss.
  • the Amla extract of the present invention does not exhibit cytotoxicity and is safe as a teabag tea material and a cosmetic material.
  • the extract is characterized in that it comprises 0.01 to 40% by weight relative to the total weight of the composition. This was set in the weight range in consideration of stabilization of each palatability and product formulation when developing from functional tea bag tea products to functional shampoos and treatment products. Out of weight range for shampoos and treatments ⁇ If exceeded, the formulation may not stabilize and formulation may not be possible.
  • the composition containing Amra extract of the present invention is safe because it does not exhibit cytotoxicity, has an excellent antioxidant effect, increases enzyme expression and hair growth factor expression, which helps hair formation, hair growth in vivo. Since it promotes, hair loss improvement or hair growth promoting effect is excellent can be used as a tea bag tea composition or functional hair products for hair loss improvement or hair growth promotion.
  • FIG. 1 is a view showing the results of measuring the antioxidant capacity (DPPH) of the extracts of Fig. 2 is a view showing the results of measuring the antioxidant capacity (SOD) of the extracts.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of measuring the dermal papilla cell proliferation capacity of the extract.
  • 4 is a diagram illustrating a method of deriving a K value using Photoshop.
  • 5 is a view showing the results of measuring the wool capacity in vivo (0 day).
  • 6 is a view showing the results of measuring the wool capacity in vivo (7 days).
  • 7 is a view showing the results of measuring the wool capacity in vivo (10 days).
  • 8 is a view showing the results of measuring the wool capacity in vivo (14 days).
  • 9 is a view showing the results of measuring the wool capacity in vivo (21 days).
  • 10 is a diagram showing the results of the visual evaluation of wool ability. It is a figure which shows the result about the evaluation of K value of the woolen ability.
  • 12 is a diagram showing the results of evaluation of the wool ability in the tissue of the skin.
  • FIG. 13 is a view showing the result of counting the number of hair follicles of the skin tissue.
  • Fig. 15 shows the result of measuring Y-GT enzyme activity.
  • FIG. 16 shows the results of measuring changes in VEGF, a hair growth factor.
  • FIG. 17 shows the results of measuring changes in IGF-1, a hair growth factor.
  • FIG. Fig. 18 shows the results of measuring changes in TGF- ⁇ ⁇ , the hair growth factor.
  • DPPH 2,2-diphenyl-l-pycryl-hydrazyl
  • Equation 1 As a result, as shown in Figure 1, in the extract of the present invention showed a concentration-dependent antioxidant capacity. All of the extracts 500 / zg / mL (Amlar constant; 72 ⁇ 2.6%, Amla alcohol; 75.3 ⁇ 0.5%) showed antioxidant effects similar to vitamin C 50 ⁇ . Amra ethanol extract showed a high antioxidant effect of low concentration of l (g / mL at 66 ⁇ 1.5%, about 60%. Also, the measurement of superoxide showed the reaction of converting H2O2 in the presence of superoxide trapping activity. The SOlXsuperoxide dismutase activity was measured using the principle of lowering the oxidation rate of catalyzed pyrogallol.
  • SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Rockville'USA) was used for the test, and the hop intensity measurement was performed using an ELISA reader. Specifically, first dilute the sample at concentrations of 10 / ig / mL, 50 / g / mL, 100 zg / mL, 500 ⁇ g / mL, and dispense 20 ⁇ to 96 well plates, and then apply 200 WST working solution. ⁇ And enzyme working solution was added to 20 f incubation for 20 minutes at 37 ° C and absorbance was measured at 450nm. 500 / g / mL trolox was used as a positive control. The resulting value was calculated through the following Equation 2, and the result is shown in FIG. 2. 1U
  • HFDPC Human follicle dermal cells
  • the dorsal hair of 6-week-old mice whose hair growth cycle was at rest was shaved with animalclipper (Panasonic ER1431p, Japan), and the remaining hair was removed secondarily with a hair removal cream beat (veet, Reckitt Benckiser, France).
  • the test drug was applied for 3 weeks after 3 days of second epilation.
  • the skin tissue is excised into fine sections under ice cubes, weighed in a certain amount, and 4 times as much phosphatebuifersolution (PBS) as the skin tissue is applied.
  • the homogenate was made by using a homogenizer. Thereafter, alkaline phosphatase (ALP) and ⁇ -glutamyl transpeptidase ⁇ and centrifuged 20 min at 12,000rpm at 4 ° C using a centrifuge the homogenate using an automatic biochemical analyzer and the supernatant were analyzed for GT). The results are shown in FIGS. 14 and 15.
  • ALP enzymes are known as angiogenesis indicators of hair growth, and induce hair action by nourishing capillaries. ALP enzymes show high activity during the hair growth phase and greatly decrease during the resting phase. As a result of measuring the ALP enzyme in the skin tissue, 10 days after application of the test substance, compared with the negative control group (33 ⁇ 13 U / L), the modern control minoxidil (155.25 ⁇ 32.84 U / L), sigma minoxidil (156.8 ⁇ 7.6 U / L) shows a significant increase.
  • the test drug showed a significant increase compared to the negative control at the Amra constant (119.67 ⁇ 46.6 U / L), and compared to the negative control (91 ⁇ 22.2U / L) at 21 days after application of the test substance, the Amra constant (132.33 ⁇ 4.16 U / L). L) showed a significant increase.
  • yGT is involved in oxidative stress in vivo, glutathione metabolism and uptake and secretion of amino acids and peptides through cell membranes, and is highly expressed in proliferating and dividing cells. .
  • the positive control group Hyundai drug minoxidil (37.25 ⁇ 13.86 U / L) and sigma minoxidil (39.67 ⁇ 9.87 U / L), were significantly increased compared to the negative control group (2.75 ⁇ 1.25 U / L).
  • the Amra constant (12.5 ⁇ 2.12 U / L) was significantly increased compared to the negative control.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • IGF insulin like growth factor
  • beta KTGF- ⁇ transforming growth factor beta KTGF- ⁇
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • IGF insulin like growth factor
  • Transforming growth factor beta UTGF- ⁇ is a factor that inhibits hair growth during the hair growth phase.
  • TGF- ⁇ mRNA shows a amra integer, amra jujeongeun high antioxidant activity of the present invention was, to increase the growth rate of dermal papilla cells significantly.
  • the wool ability was significantly higher, and the wool capacity was similar to that of 3% sigma minoxidil, which was used as a positive control group in gross and histological (follicular number) evaluation of Amura alcohol.
  • These hair capacities are thought to shorten the time of hair regrowth in the hair growth cycle by ALP, ⁇ -GT, a substance that affects hair growth in C57BL / 6J, and VEGF involved in angiogenesis in skin tissue.

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Abstract

본 발명은 암라 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본원발명 암라 추출물을 함유하는 조성물은 세포독성을 나타내지 않아 안전하며, 항산화 효과가 우수하며, 모발 형성에 도움을 주는 효소활성 및 모발성장인자 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 in vivo에서 발모를 촉진하므로, 탈모 개선 또는 발모촉진 효과가 우수하여 탈모개선 또는 발모촉진용 티백차 조성물 또는 기능성 헤어 제품으로 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
암라추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 【기술분야】
본 발명은 대한민국 산업통상자원부 지원 하에 과제번호 R0004737에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 전남지역사업평가단， 연구사업명은 "경제협력권산업육성사업" ， 연구과제명은 "천연식물성 (암라， 히비스커스 등) 복합추출물을 활용한 탈모개선 해어 케어 제품 개발" , 주관기관은 농업회사법인 (주)다미안， 연구기간은 2015. 10.01 ~ 2018.09.30이다. 본 발명은 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것으로， 더욱 구체적으로 암라 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
현대사회로 가면서 탈모환자가급격히 증가하고 있으며， 그에 대한 관심과 고민도 점점 더 심화되고 있다. 우리 몸의 두피에 있는 머리카락은 매일 0.3mm씩 자라 1년에 총 15cm가자라며， 전체의 85% 정도가성장하고 나머지 15%는 성장을 멈추는 것으로 알려져 있다. 빠지는 머리카락은 주로 성장을 멈춘 머리카락인데， 탈모는 빠지는 대상이 되는 성장을 멈춘 머리카락의 비율이 늘어남을 의미한다. 정상의 경우， 머리카락은 하루에 80~100개가 빠지지만， 그렇지 않은 경우 100개 이상이 빠지며， 모모세포의 힘이 약해지면서 성장기가 짧아지고 다음 성장기까지의 기간이 길어지면서 자라난 모발조차 제대로 성장하지 못하는 것을 의미한다.
탈모증 (脫毛症， Baldness)란, 신체의 털， 특히 머리카락이 부족한 상태를 말한다. 탈모의 가장 큰 원인으로는 유전적인 소인과 남성호르몬， 그리고 노화현상으로 알려져 있고, 그 밖에 혈액순환장애， 과다한 스트레스, 영양불균형, 지루성 피부염, 모발 관리제품의 잘못된 사용이나 과다한 염색 탈색 등의 미용관리도 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 유전적인 소인이 있는 사람의 모낭에서 테스토스테론이 5- a reductase에 의해 5- α dihydrotestosterone(DHT)으로 되며， 이에 의해 모낭세포의 단백 합성이 지연되어 휴지기 모낭의 비율이 증가하며 나이가 들면서 탈모가 진행된다. 국소적으로 두피의 전두부 및 두정부의 모발이 연모로 변하여 점차 가늘어지고 길이가 짧아지며 모낭이 소형화되면서 미만성으로 소실되어 가는 것을 특징으로 한다.
탈모에 대한 치료는 경구복용법， 국소도포， 모발이식술을 이용하고 있으며 FDA의 허가를 취득한 약물로 Minoxidi l과 Finasteride가 있다. Minoxidi l은 고혈압 치료를 위한 혈관 확장제로 개발되었으나 부작용으로 다모증이 보고되면서 발모제로 개발되었다. 내복약으로 사용되는 Finasteride는 5- α reductase type Π의 활성을 억제함으로써 안드로젠의 중간 대사체인 dihydrotestosterone(DHT)의 농도를 낮추는 기전을 통하여 남성형 탈모의 치료에 이용되고 있다. 그러나 Minoxidi l과 Finasteride의 효능은 사람마다 일률적이지 않고， 부작용들이 보고되고 있다. 현재 탈모증에 대한 치료는 완벽하지 않으며， 효과적이고 안전한 치료법에 대한 수요는 줄지 않고 있다. 따라서 한약재를 이용한 효과적인 탈모 예방 및 치료 물질의 개발을 통한 차별화 된 연구가 필요한실정이다.
암라 (Amla)는 필렘블린 (phyl lembi ln) , 갈릭산 (gal l ie acid) , 지아틴 (zeat in) , 비타민 C 등의 다양한 영양소가 함유되어 있으며 특히, 오렌지의 20배, 사과의 160배에 해당하는 천연 비타민 C를 함유 하고 있다.
이에， 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과， 본원발명의 암라 추출물의 경우, 우수한 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다.
【발명의 상세한설명】
【기술적 과제】
따라서, 본 발명의 주된 목적은 탈모방지 또는 발모촉진 효과가 우수한 암라추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 한 양태에 따르면， 본 발명은 암라 추출물을 유효성분으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물을 제공한다.
현대사회로 가면서 탈모환자가 급격히 증가하면서 그에 대한 치료방법 또한 다양해지고 있다. 하지만， 완벽한 탈모증 치료방법에 대한 개발은 여전히 미미한 실정이다. 이에， 본 발명자들은 한약재를 이용한 효과적인 탈모 예방 및 치료물질을 연구하던 중， 암라 추출물이 탈모방지 및 발모촉진 효과가 우수하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 있어서, 추출물은 종래에 사용되어진 어떠한 용매로도 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 흔합용매로 추출한 것을 특징으로 한다.
또한， 상기 추출물은 종래에 사용되어진 어떠한 추출방법으로 추출할 수 있으며， 바람직하게는 암라를 용매에 2 내지 4시간 동안 침적하여 추출할 수 있다. 추출용매를 이용한 추출방법으로는 통상적인 식물의 추출방법 예를들면， 열수 추출， 환류넁각 추출， 초음파 추출， 초임계 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에서， 상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있으나， 이에 제한되지 않는다. 추출하는 유기용매에 따라 약재의 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이날 수 있으므로， 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고 예를 들어 열수 추출， 넁침 추출， 초음파 추출 및 환류 추출 등이 있다. 추출액을 농축할 경우에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 분무건조， 열풍건조， 동결건조, 진공건조， 감압건조， 포말건조， 고주파건조， 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축 분말화하여 기능성 티백차의 소재로사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 용어 '기능성 티백차' 란， 소화기능개선， 피부진정효과, 기관지개선 등의 특정 기능이 강화된 차 (Tea)로서, 구체적으로는， 차잎 내지 분차를 거친 목면이나 여지， 나일론 체 등의 주머니에 넣은 특정 기능이 강화된 차를 일컫는다. 본 발명에서는 탈모방지 또는 발모촉진 기능이 강화된 암라를 농축 및 분말화하여 티백화하였다.
본 발명에 있어서， 상기 추출물은 기능성 샴푸 및 트리트먼트의 소재로 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실험예에 따르면， 본 발명의 암라 추출물의 양모능을 확인하기 위하여 in vivo 실험을 통해 확인한 결과， 암라 추출물은 양성 대조군에 비해 양모능이 우수하거나 유사한 수준의 효과를 나타내었으며， 피부의 조직학적 변화에서도 모낭수가 양성 대조군과 유사하게 증가한 것을 확인하였다. 또한, 모발형성에 도움을 주는 효소 활성도를 측정한 결과， 암라 추출물을 처리할 경우 효소활성이 증가되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 암라 추출물은 모발성장인자의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 더욱이， 두피의 혈액순환을 돕고 단백질을 파괴하는 활성산소를 줄여줘 탈모의 주원인인 DHT를 감소하는데 큰 효과를 주는 항산화물질로서 암라 추출물이 적합하다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때， 본원발명의 암라 추출물이 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다 (실험예 1 내지 6 참조) .
또한， 본 발명의 암라추출물은 세포독성을 나타내지 않아 티백차 소재 및 화장품 소재로 안전하다.
본 발명에 있어서， 상기 추출물은 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 40중량 %로 포함되는 것을 특징으로 한다. 이는 기능성 티백차 제품부터 기능성 샴푸 및 트리트먼트 제품으로 개발시 각각의 기호도 및 제품 제형의 안정화를 고려하여 중량범위를 설정하였다. 샴푸 및 트리트먼트의 경우 중량범위 외 ^ 초과시 제형이 안정화되지 못하고 제형형성이 불가 할 수 있다.
【유리한 효과】
이상 설명한 바와 같이， 본원발명 암라 추출물을 함유하는 조성물은 세포독성을 나타내지 않아 안전하며， 항산화 효과가 우수하며, 모발 형성에 도움을 주는 효소 활성 및 모발성장인자 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 in vivo에서 발모를 촉진하므로， 탈모 개선 또는 발모촉진 효과가 우수하여 탈모개선 또는 발모촉진용 티백차 조성물 또는 기능성 헤어제품으로 이용될 수 있다.
【도면의 간단한설명】
도 1은 암라추출물의 항산화능 (DPPH)을 측정한 결과를 나타내는 도면이다 도 2는 암라추출물의 항산화능 (SOD)을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3은 암라 추출물의 모유두 세포 증식능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 포토샵을 이용하여 K값을 도출하는 방법을 나타내는 도면이다. 도 5는 in vivo에서 양모능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다 (0 day) . 도 6은 in vivo에서 양모능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다 (7 day) . 도 7은 in vivo에서 양모능을 측정한 결과를 나타내는도면이다 (10 day) . 도 8은 in vivo에서 양모능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다 (14 day) . 도 9은 in vivo에서 양모능을 측정한 결과를 나타내는 도면이다 (21 day) . 도 10은 양모능의 육안평가에 대한 결과를 나타내는 도면이다. 도 11은 양모능의 K값 평가에 대한 결과를 나타내는 도면이다. 도 12는 피부의 조직에서 양모능을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 피부조직의 모낭수를 개수한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 ALP 효소 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 Y ?GT효소 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 모발성장인자인 VEGF 변화를 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 17은 모발성장인자인 IGF-1 변화를 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 18은 모발성장인자인 TGF-β Ι 변화를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. 실시예 1 : 암라정수추출물의 제조
본 실험에서 사용된 암라는 인도에서 수입한 제품으로 건조된 원재료를 이용하였다. 분쇄하지 않은 원료 10kg에 정수 80L를 첨가한 후, 95°C에서 1차 3시간， 2차 3시간으로 추출하였다. 이후， 60°C에서 25 brix가 될 때까지 농축하였 실시예 2: 암라주정 추출물의 제조
암라 주정 추출물 또한 인도에서 수입한 제품으로 분쇄하지 않은 원료 10kg에 주정 80L를 첨가한 후， 95°C에서 1차 3시간， 2차 3시간으로 추출하였다. 이후， 60°C에서 25 brix가 될 때까지 농축하였다. 실험예 1 : 항산화능측정
암라 추출물의 항산화능을 평가하기 위하여 DPPH(2,2-diphenyl-l-pycryl- hydrazyl ) 및 Superoxide를 측정하였다.
DPPH(2,2-diphenyl-l- pycryl-hydrazyl )는 매우 안정한 수용성 free radical로 520nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색의 화합물이며 항산화물질과 만나게 되면 radical이 소거되면서 DPPH의 고유색인 보라색이 엷어지는 특성이 있기 때문에 이 색차를 비색 정량하여 radical 소거능을 측정하였다. 구체적으로， DPPH를 MeOH에 녹여 DPPH 용액을 제조한 후， 준비된 DPPH 용액에 암라 시료 (암라 시료는 추출 농축 후 동결건조기 (일신바이오베이스， FDS850)를 활용하여 24시간 동안 동결건조를 수행하고 분말화하였으며, 이에 대한수율은 표 1에 나타내었다. ) 을 1 : 1로 섞은후 차광, 실온에서 30분간 방치 하였다가 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한， 양성 대조군으로는 50 μ Μ ascorbic acid를 사용하였다. 결과 값은 하기 식 1를 통해 산출하였으며， 그 결과는 도 1에 나타내었다.
【표 11 동결 건조전
물질명 동결 건조후분말 (g) 수을 (%)
용액 (m L)
암라정수 300 61 .6 19.3 암라주정 300 47.4 1 5.8
[식 1 ]
Figure imgf000011_0001
그 결과， 도 1 에서 나타나는 바와 같이， 본 발명의 암라 추출물에서 농도 의존적인 항산화능을 나타내었다. 모든 추출물 500 /zg/mL (암라 정수; 72±2.6%， 암라 주정; 75.3± 0.5%) 에서 양성대조군인 Vitamin C 50μΜ 와 유사한 항산화효과를 보였다. 암라 주정 추출물은 저농도인 l( g/mL 에서 66± 1.5%로 약 60%의 높은 항산화효과를 나타내었다. 또한， Superoxide 의 측정은 Superoxide 가포착활성이 있는 물질이 존재 시 H2O2 로 전환시키는 반웅을 촉매하는 pyrogallol 의 산화속도가 낮아지는 원리를 이용하여 SOlXsuperoxide dismutase) 활성을 측정하였다. 시험에는 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Rockville'USA)를 사용하였으며， 홉광도 측정은 ELISA reader 를 이용하였다. 구체적으로는， 먼저 시료를 10 /ig/mL, 50 /g/mL, 100 zg/mL, 500 ^g/mL 의 농도별로 희석하여 96 well plate 에 20 ^씩 분주한후, WST working solution을 200 ^와 enzyme working solution 을 20 f 를 넣고 37°C에서 20 분간 incubation 한 후 450nm 에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 500 / g/mL trolox 를 사용하였다. 결과 값은 하기 식 2 를 통해 산출하였으며, 그 결과는 도 2 에 나타내었다. 1U
[식 2]
Supero)dd radical scavenging ra^o ^)=(l- /B) 100
養^ .纖¾ ¾^|¾,： W 그 결과， 도 2 에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 암라 추출물에서 항산화능이 농도 의존적으로 증가하였으며 음성 대조군 대비 유의적 차이를 보였다. 그 증 가장 높은 항산화능을 나타낸 100 / g/mL 암라 정수 (64.9± 0.3), 암라주정 (65.5士 0.6)에서 양성 대조군인 500 /½/mL trolox(33.7± 0.7«¾) 와 SOD 활성 비교 시 2배 이상의 항산화효과를 나타내는 것을 확인하였다. 실험예 2: 모유두세포증식능확인
인간 모유두 세포 [Human follicle dermal cell, (HFDPC) ]를 이용하였다. 구체적으로， 세포는 96-well 플레이트 (96— well plates)에 1χ 104 의 세포수로 24 시간 배양 후 96-well 플레이트는 회석된 화합물을 포함하는 배지를 첨가하여 1 일 동안 배양한후， MTT 시약을 활용하여 세포 증식능을 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
MTT assay를 통한모유두세포 증식능 측정 결과， 도 3에 나타나는 바와 같이, 양성대조군으로 사용한 minoxidil 과 암라 정수， 주정 추출물은 500 ^g/mL을 제외한모든농도에서 세포 증식능이 증가하였으며 유의적 차이를 보였다. 암라 정수， 주정 추출물 500 /^g/mL의 경우에서는 세포 독성이 나타났다. 양성 대조군인 minoxidil 1 g/mL 에서 세포가 1.3 배 증가하였으며 암라 정수， 주정 추출물 100 j«g/mL 에서 minoxidil l g/mL 과 마찬가지로 세포증식능이 1.3배 증가하는 것을 확인하였다. 실험예 3: C57BL/6J마우스의 성장기 모낭유도 평가
모발성장주기가 휴지기인 6 주령의 마우스의 등쪽 털을 animalclipper (Panasonic ER1431p, Japan)로 깎아내고, 제모크림 비트 (veet, Reckitt Benckiser, France)로 나머지 털을 2 차에 거쳐 제거하였다. 시험약물은 2 차 제모 3일 후부터 3주간도포하였다.
구체적으로， 시험약물의 도포는 마우스를 ethyl ether 마취하고 시험대에 테이프로 고정시킨 후 수행하였다. 마우스가 시험물질을 핥아먹지 못하도록 도포 후 5분간고정상태 유지하도록 하였다. 양모의 육안적 평가를 위해 0， 7， 10, 14， 21 일에 ethyl ether 마취 후 각 개체 및 그룹 간 사진촬영을 진행하였으며, 판정기준은 양모정도에 따라 0-19% (-)， 20-39%(±), 40-59% (+ ), 60-79% (+ + ), 0-100% (+ + + )로 평가하였다. 또한， 양모에 대한 수치화된 결과를 얻기 위해 포토샵 프로그램을 이용하여 이미지의 검정색을 나타내는 K 값을 도출하였다. 포토샵을 이용설정한 눈금선에 마우스의 등부분을 위치하게 하여 K값을 데이터화하였다 (도 4). 그 결과를 도 5 내지 도 11에 나타내었다.
양모에 대한 데이터를 수치화하기 위해 총 7 인아 참여하여 양모 정도를 0 ~ 4점으로 평가하였다. 21일째 모든 시험약물 그룹은 음성대조군보다높은 양모 효과를 나타내며， 특히 암라 정수 도포 그룹에서 양성대조군으로 사용한 미녹시딜과 유사한 양모효과를 나타냄을 확인하였다 (도 5 내지 10 참조). 1 또한, 양모의 정도를 명암 (어두운 정도 / 검정색)， K 값으로 확인한 결과 7 일째 암라 주정 (19.2± 3.4)이 음성대조군 대비 유의적 증가를 나타내었다. 10 일째는 모든 시험약물에서 음성 대조군 (8.9± 1.3) 대비 모두 유의적 증가를 나타내었으나 특히 암라주정 (52± 4.8)이 시그마의 미녹시딜 (50.3± 4.6)과 유사한 정도의 양모능을 나타내었다. 14 일째부터는 시그마 미녹시딜 (73.8± 2.4)과 암라주정 (76.3± 1.6)이 유사한 정도의 양모능을 나타내었으며， 시험 종료인 21 일째는 암라 정수 (75.3± 1.1), 암라 주정 (78.1± 1.1)에서 시그마 미녹시딜 (74.1± 1.3) 과 유사한 양모능을 나타내는 것을 확인하였다 (도 11 참조). 실험예 4: 조직학적 관찰
동물 시험 개시 10， 21 일 후, 고정한 피부조직을 hematoxylinandeosin(H&E) 염색한 후 100 배율에서 광학현미경으로 5mm2 면적에 대한모낭수를 계수하였으며， 그 결과는 도 12 및 도 13에 나타내었다. 피부조직의 모낭수를 개수한 결과， 모든 시험약물에서 시간 경과에 따라 조직 모낭수가 증가되는 것을 확인하였다. 또한， 21 일째 모든 시험약물의 조직 모낭수는 음성대조군 (42士 11)과 비교 했을때 유의적 차이를 보였다. 시그마 미녹시딜 조직 모낭수 (120.4± 15.5)는 3 배， 현대약품 미녹시딜 (76.2± 8.4)과 암라주정 (90.5± 11.3)에서 2배의 모낭이 관찰되었다. 실험예 5: 피부조직의 효소 활성도측정
피부조직을 절취하여 빙넁하에서 미세절편으로 만들고， 그 중 일정량을 칭량한 후， 피부조직의 4 배량의 인산완충용액 (phosphatebuifersolution, PBS)을 가하여 파쇄기 (homogenizer)를 이용하여 균질액을 만들었다. 이 후， 균질액을 원심분리기를 이용하여 4°C에서 12,000rpm으로 20분간원심분리하여 상층액을 자동생화학 분석기를 이용하여 alkaline phosphatase(ALP)및 γ-glutamyl transpeptidase^— GT)를 분석하였다. 그 결과를 도 14 및 15에 나타내었다.
ALP 효소는 모발성장의 혈관형성 지표로 알려져 있으며， 모세혈관으로 영양을 공급함으로써 양모작용을 유도한다. ALP 효소는 모발 성장기 동안은 높은 활성을 나타내고， 휴지기에서는 크게 감소한다. 이러한 피부조직내 ALP 효소를 측정한 결과， 시험물질 도포 10 일 후 음성 대조군 (33± 13 U/L) 대비， 양성대조군인 현대약품 미녹시딜 (155.25± 32.84 U/L), 시그마 미녹시딜 (156.8士 7.6 U/L)은 유의적 증가를 나타냄. 시험약물은 암라 정수 (119.67±46.6 U/L)에서 음성 대조군 대비 유의적 증가를 나타내었으며， 시험물질 도포 21 일 후 음성 대조군 (91± 22.2U/L) 대비， 암라 정수 (132.33± 4.16 U/L)에서 유의적 증가를 나타내었다.
yGT 는 생체 내 산화적 스트레스와 glutathione 대사 및 세포막을 통한 아미노산과 펩타이드 흡수 및 분비에 관여하며， 증식과 분열이 활발한 세포내에서 많이 발현되고， 모발 성장기 동안은 높은 활성을 나타내고， 휴지기에서는 크게 감소한다. 실험 결과， 시험물질 도포 10 일 후 음성 대조군 (2.75± 1.25 U/L) 대비， 양성대조군인 현대약품 미녹시딜 (37.25± 13.86 U/L), 시그마 미녹시딜 (39.67±9.87 U/L)은 유의적 증가를 나타내었고， 암라정수 (12.5±2.12 U/L)에서 음성대조군 대비 유의적 증가를 나타났다. 시험물질 도포 21 일 후 음성 대조군 (12.3± 2.88 U/L)대비， 현대약품 미녹시딜 (24.67士 5.03 U/L), 암라 정수 (23.5士 5.5 U/L)에서 유의적 증가를 나타내었다. 실험예 6: 피부조직 내 모발성장인자측정
피부조직 내 모발성장인자인 Vascular endothelial growth factor(VEGF), insulin like growth factor(IGF)-l 및 Transforming growth factor beta KTGF- βΐ)을 측정하였다. 구체적으로, 마우스 피부 조직을 eszy-Blue™ Total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Korea)로 mRNA 를 추출 후， TaqMan RNA-to-Ct™ 1— Step Kit 를 사용하여 추출물과 primer (insulin like growth factorl(IGF-l), transforming growth factor beta KTGF-βΙ) 및 vascular endothelial growth factor(VEGF)를 흔합하고 StepOne 기계에서 48 °C에서 15 분， 95 °C에서 10 분 1 회， 95 °C에서 15 초， 60 1C에서 1 분으로 40 회 반복하여 threshold cycle 값을 측정하였다. 그 결과는 도 16 및 도 18 에 나타내었다.
Vascular endothelial growth factor (VEGF)는휴지기에 신생혈관 생성을 촉진하여 새로운 모발의 성장기로 유도하여 두피 및 모낭 세포분열에 관여하는 함으로써 대표적인 양모관련 인자이다. 21 일째 피부조직 내 VEGF mRNA 을 측정한 결과, 음성대조군 그룹 (1.00±0.06)과 비교하였을 때 시그마 미녹시딜 (2.57±0.15)과 암라 주정 (4.5±0.69)에서 발현이 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다 (도 16 참조). 또한, 피부에 존재하는 모발성장 인자인 insulin like growth factor(IGF)- 1 은 모발의 기능적인 활동을 촉진시켜 모낭의 세포사를 저해시킨다. 21 일째 피부조직 내 IGF-1 mRNA 을 측정한 결과， 그룹간의 유의적 변화는 관찰되지 않았다 (도 17 참조).
Transforming growth factor beta UTGF-βΙ)은 모발의 성장기 시기에서 모발성장을 방해는 인자이다. 21일째 피부조직 내 TGF-βΙ mRNA을 측정한 결 과， 그룹간의 유의적 변화는 관찰되지 않았다 (도 18 참조). 결론적으로， 본원발명의 암라 정수， 암라 주정은 높은 항산화 효과를 나타내며， 모유두 세포의 증식률을 유의적으로 '증가시켰다. 또한, 양모능이 유의적으로 높게 나타났으며， 특히 암라 주정의 육안적， 조직학적 (모낭수) 평가에서 양성대조군으로 사용한 3% 시그마 미녹시딜과 유사한 정도의 양모능을 나타내었다. 이러한 양모능은 C57BL/6J에서 모발이 성장에 영향을 주는 물질인 ALP, γ-GT 및 피부조직 내 혈관신생에 관여하는 VEGF에 의해 모발성장 주기에서 모발 재성장의 시간을 단축시키는 것으로 사료된다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1]
암라추출물을 유효성분으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 암라추출물은 물， 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 흔합용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
【청구항 3]
제 1 항에 있어서， 상기 추출물은 농축 분말화하여 기능성 티백차의 소재로 사용되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용조성물.
【청구항 4]
제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 기능성 삼푸 또는 트리트먼트의 소재로 사용되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
【청구항 5】
제 4항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 30중량 ¾로 포함되는 것을 특징으로 하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
PCT/KR2017/008104 2016-07-29 2017-07-27 암라 추출물을 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물 WO2018021847A1 (ko)

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