KR20200064775A - 작약 추출물을 포함하는 골절 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 작약(Paeonia lactiflora Pallas) 추출물을 포함하는 골절 예방, 개선 및 치료용 조성물을 제공한다.

Description

작약 추출물을 포함하는 골절 예방, 개선 또는 치료용 조성물{COMPOSIOTION FOR PREVENTION, IMPROVEMENT OR TREATMENT OF FRACTURE INCLUDING PAEONIA LACTIFLORA PALLAS}

본 발명은 작약(Paeonia lactiflora Pallas) 추출물을 포함하는 약학적 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다.

또한 뼈는 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.

따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 역동적, 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 되는데, 이를 골 재형성(bone remodeling)이라고 한다.

뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 그 기능을 유지하는데 필수적이다. 성인에서는 매년 골격의 약 10-30 %가 골흡수-골형성의 리모델링을 통하여 재형성된다.

뼈 재형성에는 크게 두 종류의 세포, 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)가 관여하며 서로 밀접한 연관성으로 골의 항상성이 유지된다.

예를 들어, 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand), 및 그의 미끼 수용체인 OPG(osteoprotegerin)과 같은 물질의 분비를 통해 골흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내의 골 항상성을 유지한다.

즉, RANKL이 파골 전구세포 표면 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화되어 골흡수가 일어나며, OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제된다.

전구세포로부터 형성되는 파골세포는 오래된 뼈를 흡수 또는 파괴하며, 뼈에 축적된 소량의 칼슘을 혈류로 방출시켜 신체기능 유지에 사용한다.

상기 대사는 물리적 영향, 호르몬 체계 및 국소 인자에 의해 조절되는데, 여러 요인에 의해 골 흡수가 골 형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하게 되면 골조직의 손상을 동반한 각종 골질환이 발생한다.

이러한 골조직 손상을 동반한 질환의 치료와 관련하여 과거에는 주로 골 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사 이상만을 중심으로 연구가 진행되어 왔으며, 그 기전 규명에 있어서 진전을 보지 못하였다. 따라서, 파골세포 분화 억제 물질을 개발하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 한의학에서 주로 사용하는 한약재들은 발병 원인 및 증상이 복합적으로 나타나는 만성, 난치성 질환의 예방 및 치료에 있어 멀티 타겟 기전에 의해 보다 근본적인 치료제로서의 가능성이 대두되고 있다.

또한, 이러한 한약재를 원료로 사용하는 치료제의 경우 화학 약품 사용에 따라 발생할 수 있는 다양한 부작용을 최소화할 수 있기 때문에, 현존하는 의약품 성분의 대체 소재로 주목 받고 있다.

William J. et al., NATURE.,423, pp.337342, 2033

본 발명의 목적은 작약(Paeonia lactiflora Pallas) 추출물을 포함하는 골절 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 작약 추출물을 포함하는 골절 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 작약(Paeonia lactiflora Pallas) 추출물을 포함하는 골절 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 “작약(Paeonia lactiflora Pallas)”은 미나리재비과(Ranuclaceae) 작약속(Paeonia)에 속하는 약용식물로서, 진경, 진통, 수렴완화약으로 근육의 경련, 두통, 복통, 이질 세균성감염 및 지한, 조경 등에 유효하다.

최근 발견한 약리 효과는 혈관 확장 작용 (Y. Zang. The effects of nifedipine, diltiazam, and Paeonia lactiflora Pall. on atherogenesis in rabbits. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 19(2), 100 (1991)), 동맥경화 억제 효과, 혈압상승효과, 항산화효과, 항암효과 (H. J. Kim, et. al. Cytotoxic and antimutagenic stibenes from seeds of Paeonia lactiflora. Arch Pham Res.25(3), 293(2002).)등이 있는 것으로 밝혀져 있다.

그러나, 작약의 골절 질환의 개선 효과 또는 관련한 작용 기전이나 효능은 현재까지 알려진 바 없으며, 본 발명자들은 상기 작약 추출물의 조골세포 분화 촉진 활성 효과를 규명하고자 하였다.

본 발명에서 상기 “추출물”은 용매와 추출재료를 특정 조건하에서 접촉시킴으로써 추출재료에 함유된 유효성분을 분리해낸 것으로, 상기 추출물은 작약에 대한 추출 공정에 의해 원료 내의 유효성분을 포함할 수 있다.

상기 작약 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 상기 작약 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 구체적으로는 에탄올을 사용할 수 있다.

또한, 상기 추출 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 “골절”은 과도한 충격이나 힘으로 인하여 뼈나 연골의 연속성이 끊어진 상태를 의미한다. 골절의 치료는 염증기, 복원기, 재형성기, 치유단계를 거치게 되는데, 골 유합을 촉진시켜주는 건강기능식품 및 한약은 골절의 치유 단계에 따라 효과적인 약물 선정이 가능하다.

대부분의 골 대사성 질환(골다공증, 관절염, 골괴사, 골석화증 등)은 파골세포가 질병의 주요원인이다. 이전에 발표된 논문을 참고하면 (Boyce BF. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone diseases, 2012, Eur J Clin Invest.), 다양한 원인을 통한 파골세포의 활성은 골다공증, 관절염 그리고 골괴사를 유도하며, 파골세포의 퇴화는 골석화증을 야기함을 알 수 있다.

하지만 이와는 반대로, 골절의 치료는 다른 대사성 골 질환들과 다르게 조골세포의 활성이 매우 중요하다. 이전 발표된 논문을 참고하면 (Frederic Shapiro, Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts, 2008, European Cells and Materials), 골절의 치료는 1) 간엽줄기세포간부터 분화를 거쳐 조골세포로의 분화를 통한 골 신생과 2) 골 표면에 활성화된 조골세포의 활성이 골절 치료에 가장 중요한 역할을 한다.

이러한 이유로 조골세포의 활성을 유도하는 작약 추출물은, 기존 골대사성 치료제들과 다르게 특이적으로 골절 치료에 가능성이 있음을 판단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 조골세포의 분화를 유도시킨 MC3T3-E1 세포에 작약 추출물을 처리하는 경우 조골세포의 분화가 촉진됨을 확인하였다(도 2).

구체적으로, 상기 MC3T3-E1 세포에 작약 추출물을 처리한 경우 조골세포 분화의 특이 지표로 알려진 ALP(alkaline phosphatase) 및 BSP(bone siaoprotein)의 발현이 상향 조절되었다(도 3).

나아가, 상기 MC3T3-E1 세포에 작약 추출물을 처리하였을 때, 조골세포의 분화 기전인 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 발현이 증진되었음을 확인하였다(도 4).

한편, 작약 추출물은 파골세포 분화 유도 모델인 RAW 264.7 세포에서 파골세포 분화 억제 활성이 낮은 것을 확인하였다(도 5).

그러나, 본 발명의 일 실시예인 골절 동물 모델 분석에서 작약 추출물의 처리에 의해 골절 부위의 회복이 개선됨을 확인하였다(도 6).

상기 결과는 본 발명의 작약 추출물이 파골세포 분화 억제 활성은 낮으나, 조골세포의 분화 촉진 활성이 높아, 골 유합 또는 뼈 재생 촉진 활성이 우수한 골절 예방, 개선 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.

본 발명에서 상기 “예방”은 동물의 병리학적 세포의 발생 또는 세포의 손상, 소실의 정도의 감소를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 병리학적 세포의 발생 또는 파골세포 증식 등이 상기 골절 질환 예방 및 치료용 조성물을 사용하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.

또한, 상기 “치료”는 골절 질환의 하나 이상의 증상을 개선하거나, 증상의 진행을 저지하는 것을 의미하며, 통상적으로 사용되는 치료의 의미를 포괄할 수 있다.

본 발명의 “약학적 조성물”은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 작약 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 작약 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “분획물(fraction)”은 각종 구성성분 또는 혼합물로부터 각각의 성분 또는 특정의 그룹으로 분리하는 조작, 즉 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 등을 사용하여 분리된 각 성분 내지 그룹을 의미한다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.

상기 작약 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양이 대상체에 투여될 수 있다.

상기 “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 “개선”은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 “식품 조성물”은 육류, 스낵류, 낙농제품, 음료수 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적인 건강기능식품을 모두 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.

상기 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 상기 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미할 수 있다.

상기 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다.

상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다.

상기 건강기능식품은 골절 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품은 골절 질환 개선을 목적으로, 전체 중량 대비 1.0 내지 10.0 중량%의 상기 조성물을 포함할 수 있다. 상기 조성물이 1.0 중량% 미만이면 골절 질환 개선 효과가 충분히 구현되지 않을 수 있고 10.0 중량% 초과이면 제품 본연의 품질이 구현되지 않거나 비용 효율이 저하될 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 골절 질환 개선을 목적으로 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조 및 가공될 수 있다.

구체적으로 상기 정제 형태의 건강기능식품은 작약 추출물 또는 이의 분획물, 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.

상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 가지 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 작약 추출물 또는 이의 분획물, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다.

상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 솔비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

상기 환 형태의 건강기능식품은 작약 추출물 또는 이의 분획물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

상기 과립형태의 건강기능식품은 작약 추출물 또는 이의 분획물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다

또한, 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 약학적 조성물 내지 식품 조성물의 일 성분으로 천연 한약재인 작약 추출물을 사용함으로써 부작용을 최소화하면서도 골절 질환 개선 효과를 향상시킬 수 있다.

또한, 상기 작약 추출물은 파골세포의 분화를 억제시키지 않고 조골세포의 분화만을 촉진시키므로, 골 유합 또는 뼈 재생 촉진 활성을 이용해 골절 예방 및 치료에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 작약 추출물(PP) 처리에 따른 세포 생존률을 측정한 결과이다.
도 2는 작약 추출물 처리 농도에 따른 조골세포 분화능을 Alizarin S 염색법을 이용하여 평가한 결과이다.
도 3은 작약 추출물의 처리 농도에 따른 ALP(alkaline phosphatase)(A 및 B), BSP(bone siaoprotein)(A 및 C) 및 OCN(osteocalcin)(A 및 D)의 mRNA 발현량을 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(Real-time quantitative PCR)으로 측정한 결과이다.
도 4는 작약 추출물의 처리 시간에 따른 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 발현에 미치는 영향을 BCA 분석법을 이용하여 측정한 결과이다.
도 5는 작약 추출물의 처리 농도에 따른 파골세포 분화능을 TRAP 염색법을 이용하여 평가한 결과이다.
도 6은 골절 동물 모델에서 작약 추출물의 처리에 따른 골절 부위 회복 정도를 micro-CT를 촬용하여 평가한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1 : 작약 에탄올 추출 방법

작약(경북 영천, 대한민국, 옴니허브에서 구입)을 작약 500 g을 100 % 에탄올 3000 mL를 첨가하여 1 주일간 침지 추출하였다. 추출물은 여과지(Whatman, No 2)로 여과하였고 여과액은 감압농축과 동결건조하여 분말화하였다. 건조된 작약 추출물(Ethanol extract of Paeonia lactiflora Pallas, PP)은 29.53 g이었으며, 수득율은 5.91 %이다. 작약 추출물은 냉장 보관하여 사용하였으며, 세포 배양시 사용한 작약은 0.22 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 사용하였다.

제조예 2 : 세포 배양

10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1 %의 P/S(페니실린 및 스트렙토마이신)를 포함하는 α-MEM(Minimum Essential Medium Eagle-alpha modification) 배지에 MC3T3-E1 세포를 분주하여 95 %의 습도, 37 ℃, 5 % CO₂의 조건에서 배양하였다.

실험예 1 : 세포독성 분석

작약 추출물의 세포독성을 알아보기 위해 상기 제조예 1의 작약 추출물을 상기 제조예 2의 세포에 처리한 후 MTT assay를 이용하여 세포 증식을 측정하였다.

구체적으로, 상기 세포를 24시간 동안 안정화 후 배양액에 작약 추출물 20, 40, 60 및 80 μg/mL을 각각 처리한 후 동일한 조건의 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.

배양된 세포들은 MTT assay solution 처리 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 독성 측정 결과는 시료의 흡광도를 대조군(작약 추출물 0 μg/mL)의 흡광도에 대한 백분율로 표시하였다.

측정 결과, 작약 추출물 20, 40, 60 및 80 μg/mL을 처리하였을 때 세포 독성이 나타나지 않았다(도 1).

실험예 2 : 조골세포 분화능 평가

작약 추출물이 조골세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 상기 제조예 2 의 세포에 조골세포 분화 유도제인 ascorbic acid(25 ug/ml)과 β-glycerophosphate(10 mM)을 처리하여 조골세포 분화를 유도하고, Alizarin S 염색법을 이용해 조골세포의 분화능을 분석하였다.

상기 유도제에 의해 조골세포의 분화능이 높아지면 세포 내 칼슘 침착이 더 증가하게 되며, 상기 칼슘 침착의 정도는 Alizarin S 염색법을 통해 확인할 수 있다.

구체적으로, 상기 제조예 2의 MC3T3-E1 세포에 25 μg/mL의 ascorbic acid 및 10 mM의 β-glycerophosphate를 처리하고 작약 추출물 0, 5, 10 및 20 μg/mL을 각각 처리한 후 21일 동안 배양하였다. 분화가 끝난 세포는 80% Et-OH로 10 분 동안 고정하였다. 그 후 Alizarin red S 용액으로 10 분동안 염색하고, DPBS 로 수세하였다. 칼슘이 침착된 정도는 plate 를 직접 사진 촬영하여 정도를 비교하였다(도 2).

아무것도 처리하지 않은 군을 정상군으로 설정하였다.

도 2를 참조하면, 정상군의 경우 Alizarin S 로 염색되는 것이 없었으며, 유도제만 처리한 대조군에서는 분화된 조골세포가 붉은색으로 염색되었다.

유도제 및 작약 추출물을 함께 처리한 실험군에서는 칼슘 침착 정도가 작약 추출물을 처리하지 않은 경우보다 더 증가하였으며, 특히, 유도제와 함께 10 μg/mL의 작약 추출물을 처리한 실험군에서 조골세포가 가장 많이 칼슘 침착을 일으켰다.

실험예 3 : ALP, BSP 및 OCN 발현 활성 평가

작약 추출물이 조골세포 분화의 특이 지표로 알려진 ALP(alkaline phosphatase), BSP(bone siaoprotein) 및 OCN(osteocalcin)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(Real-time quantitative PCR)을 통해 분석하였다(도 3).

구체적으로, 상기 제조예 2의 MC3T3-E1 세포에 조골세포 분화 유도제인 25 μg/mL의 ascorbic acid (A.A) 및 10 mM의 β-glycerophosphate (BGP)를 처리하고 작약 추출물 0, 2.5, 5, 10 및 20 μg/mL을 각각 처리한 후 4 일 동안 배양하였다.

아무것도 처리하지 않은 군을 정상군으로 설정하였다.

배양된 세포에 Trizol 용액(Invitrogen, USA)을 처리하여 전체 RNA(total RNA)를 추출하였다.

추출한 2 μg 의 RNA를 제조의 지시에 따라 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA(complementary DNA)로 합성하였다. 합성한 cDNA는 KAPA PCR kit(Kapa Biosystems)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다.

GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 이용하여 mRNA 농도를 표준화(normalization)하였다.

Image J software(Ver. 1.46, National Institutes of Health)를 사용하여 각 band density의 데이터 분석을 진행하였으며, 실험에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

구분	서열		서열번호
ALP	Forward	5' CGGGACTGGTACTCGGATAA 3'	1
	Reverse	5' TGAGATCCAGGCCATCTAGC 3'	2
BSP	Forward	5' AAAGTGAAGGAAAGCGACGA 3'	3
	Reverse	5' GTTCCTTCTGCACCTGCTTC 3'	4
OCN	Forward	5' CTTGGTGCACACCTAGCAGA 3'	5
	Reverse	5' TTCTGTTTCCTCCCTGCTGT 3'	6
GAPDH	Forward	5' ACTTTGTCAAGCTCATTTCC 3'	7
	Reverse	5' TGCAGCGAACTTTATTGATG 3'	8

도 3을 참조하면, 정상군에 비해 대조군에서 조골세포 관련 유전자가 유의하게 증가하였다(A).

작약을 처리한 실험군의 경우 대조군과 비교하여 ALP의 발현이 증가하였고, 특히 10 μg/ml의 농도로 처리한 실험군에서는 유의한 증가를 나타내었다(B, p<0.05).

BSP는 작약을 처리한 실험군의 경우 대조군과 비교하여 유전자의 발현이 증가하였고, 특히 20 μg/ml의 농도로 처리한 실험군에서는 유의한 증가를 나타내었다(C, p<0.05).

OCN는 작약을 처리한 실험군의 경우 대조군과 비교해 큰 변화를 주지 않았다(D).

실험예 4 : 조골세포 내 MAPK 발현 분석

작약 추출물이 조골세포 분화 기전인 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 발현에 미치는 영향을 BCA 분석법을 이용하여 분석하였다.

구체적으로, 상기 제조예 2의 MC3T3-E1 세포에 20 μg/mL의 작약을 5, 15 및 30 분 동안 처리한 후, 세포에 RIPA buffer를 분주한 후 scraper로 긁어내고 ice에서 30 분 동안 반응시켰다.

그 후 13200 rpm 에서 20 분 동안 원심 분리를 진행하여 전체 단백질을 추출했다. 추출한 단백질은 BCA assay를 통해 정량하여, 각각의 시료를 30 μg으로 통일한 뒤, 100 V로 10 % polyacrylamide/SDS gel에서 전기영동 시키고, nitrocellulose transfer membrane에 이동시켰다.

Membrane은 5 % skim milk와 0.5 %의 Tween-20(sigma aldrich, MO, USA)를 녹인 TBST에 넣은 뒤 1 시간 동안 반응시켜 비 특이 단백질이 붙는 것을 방지하였다.

그 후 p-ERK, t-ERK, p-JNK, t-JNK, p-p38 및 t-p38을 각각 반응시켰다. 그 후 1차 항체 기원에 맞게, 2차 항체를 반응시켰다. 그 후 암실에서 membrane에 ECL solution(Santacruz, California USA)을 이용하여 기질 반응을 통하여 발색시켜, X-ray 필름에 현상하였다(도 4).

도 4를 참조하면, 작약 추출물의 처리에 의해 P-ERK및 P-JNK의 발현이 향상되었고, 특히 작약 추출물을5 분 처리시 정상군에 비해 P-ERK및 P-JNK의 발현이 현저하게 증가하였다.

또한, P-p38의 발현은 작약 추출물을 5 및 15 분 처리한 경우 현저하게 증가하였다.

실험예 5 : 파골세포 분화능 평가

작약은 파골세포의 분화능을 효과적으로 억제할 수 있으므로 골 질환 개선 등에 효과가 있음이 알려져 있다.

본 실험예에서는 본 발명의 작약 추출물이 실제로 파골세포의 분화능을 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포에 파골세포 분화 유도제인 RANKL을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도하고, TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색법을 이용하여 파골세포 분화능을 분석하였다.

구체적으로, 96-well plate에 RAW 264.7 세포를 분주한뒤, 100 ng/mL 의 RANKL을 첨가한 배양액으로 파골세포 분화를 유도하였다. 그와 동시에 작약 추출물을 1, 3, 6, 12, 25, 50 및 100 μg/mL의 농도로 첨가하고, 2일 마다 동일한 배지로 교환하면서 5일 동안 배양하였다.

분화가 끝난 세포는 4 % formalin solution으로 10 분 동안 고정하였다. 그 후 TRAP kit로 1 시간 동안 염색하고, DPBS로 수세하였다. 염색된 세포가 붉은색이면서, 다핵 세포일 때 TRAP-양성 세포로 간주하였다(도 5).

도 5를 참조하면, 작약 추출물의 처리에도 불구하고 파골세포의 분화가 억제되지 않았고, 오히려 파골세포의 분화 활성이 증가하였다.

상기 결과는 본 발명의 작약 추출물은 파골세포의 분화를 억제하지 못하지만 조골세포의 분화를 현저하게 증가시킴으로써, 우수한 골 유합 및 뼈 재생 촉진 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.

실험예 6 : 골절 동물 모델 분석

작약 추출물이 골절 회복에 미치는 영향을 알아보기 위해, 골절을 유발한 SD-rat(코아텍에서 분양)에 작약 추출물을 처리한 후 골절 치료의 경과를 우측 대퇴골의 micro-CT로 분석하였다.

구체적으로, 수컷 8주령 SD-rat은 1 주일간 적응 기간을 가졌다. 그 후 isoflurane으로 흡입 마취시킨 뒤 아래 우측 대퇴골의 중앙부를 전기톱을 사용하여 절단하였고, 무릎 쪽으로 wire를 삽입하여 절단한 넙다리뼈(femur)를 고정하였다.

이후 무작위로 군을 나눈 후 3일간 항생제를 투여하고, 1 주일간 상처가 회복기를 주었다. 다음 군으로 분류하여 실험을 진행하였다. 실험 동물은 각 8마리씩 하기의 4 군으로 나누었다.

1) 비 대퇴골 절제 대조군(Normal),

2) 대퇴골 절제 유발군 (control),

3) 대퇴골 절제 후 50 mg/kg 농도의 작약 투약군 (PP-L),

4) 대퇴골 절제 후 100 mg/kg 농도의 작약 투약군(PP-H)

각군은 1 ml의 시료를 매일 경구투여 하여, 4 주간 사육하였다. 실험 기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매주 일정한 시간에 측정하였다. 희생 후 적출한 넙다리뼈는 micro-CT(Skyscan) 기기를 사용하여 골절 부위와 대퇴골 전면을 촬영하였다(도 6).

도 6을 참조하면, 작약 추출물을 투여한 SD-rat의 가골(callus)의 밀도와 크기가 증가하였다.

또한, 대퇴골 정면 사진을 확인하면, 골절 부위의 회복이 작약 추출물의 처리에 의해 현저하게 개선되었다.

상기 결과는 작약 추출물이 조골세포의 분화와 관련된 유전자의 발현을 촉진하여 우수한 조골세포 분화 촉진 활성을 가지고, 골 유합 내지 뼈 재생을 효과적으로 촉진시키므로 골절 등의 질환을 효과적으로 완화 또는 개선시킬 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kyung Hee University <120> COMPOSIOTION FOR PREVENTION, IMPROVEMENT OR TREATMENT OF FRACTURE INCLUDING PAEONIA LACTIFLORA PALLAS <130> SKH18P-0092-KR <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP sense primer <400> 1 cgggactggt actcggataa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP antisense primer <400> 2 tgagatccag gccatctagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP sense primer <400> 3 aaagtgaagg aaagcgacga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP antisense primer <400> 4 gttccttctg cacctgcttc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN sense primer <400> 5 cttggtgcac acctagcaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN antisense primer <400> 6 ttctgtttcc tccctgctgt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 7 actttgtcaa gctcatttcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 8 tgcagcgaac tttattgatg 20

Claims (8)

1. 작약(Paeonia lactiflora Pallas) 추출물을 포함하는 골절 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 에탄올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 골절 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 추출물은 에탄올을 추출 용매로 하여 추출된 골절 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   조골세포의 분화를 촉진하는 골절 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   ALP(alkaline phosphatase) 및 BSP(bone siaoprotein)의 발현을 상향 조절하는 골절 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   골 유합 또는 뼈 재생을 촉진하는 골절 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 작약 추출물을 포함하는 골절 예방 또는 개선용 식품 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   조골세포 분화 촉진으로 인한 골 유합 또는 뼈 재생 촉진 효과를 나타내는 골절 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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