KR20200109499A - 진교 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연물인 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 포함하는 골 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서, 부작용을 최소화 하면서도 골 질환 개선 효과를 향상시킬 수 있는 조성물을 제공한다.

Description

진교 추출물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물{A COMPOSITION FOR PREVENTIION OR TREATMENT OF BONE DISEASE COMPRISING GENTIANAE MACROPHYLLAE RADIX}

본 발명은 진교 추출물을 포함하는 골 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다.

또한 뼈는 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.

따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 역동적, 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 되는데, 이를 골 재형성(bone remodeling)이라고 한다.

뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 그 기능을 유지하는데 필수적이다. 성인에서는 매년 골격의 약 10-30 %가 골흡수-골형성의 리모델링을 통하여 재형성된다.

뼈 재형성에는 크게 두 종류의 세포, 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)가 관여하며 서로 밀접한 연관성으로 골의 항상성이 유지된다.

예를 들어, 파골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand), 및 그의 미끼 수용체인 OPG(osteoprotegerin)과 같은 물질의 분비를 통해 골흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 조절함으로써 체내의 골 항상성을 유지한다.

즉, RANKL이 파골 전구세포 표면 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화되어 골흡수가 일어나며, OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제된다.

전구세포로부터 형성되는 파골세포는 오래된 뼈를 흡수 또는 파괴하며, 뼈에 축적된 소량의 칼슘을 혈류로 방출시켜 신체기능 유지에 사용한다.

상기 대사는 물리적 영향, 호르몬 체계 및 국소 인자에 의해 조절되는데, 여러 요인에 의해 골 흡수가 골 형성을 초과하여 골량이 한계 이하로 감소하게 되면 골조직의 손상을 동반한 각종 골질환이 발생한다.

이러한 골조직 손상을 동반한 질환의 치료와 관련하여 과거에는 주로 골 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사 이상만을 중심으로 연구가 진행되어 왔으며, 그 기전 규명에 있어서 진전을 보지 못하였다. 따라서, 파골세포 분화 억제 물질을 개발하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 한의학에서 주로 사용하는 한약재들은 발병 원인 및 증상이 복합적으로 나타나는 만성, 난치성 질환의 예방 및 치료에 있어 멀티 타겟 기전에 의해 보다 근본적인 치료제로서의 가능성이 대두되고 있다.

또한, 이러한 한약재를 원료로 사용하는 치료제의 경우 화학 약품 사용에 따라 발생할 수 있는 다양한 부작용을 최소화할 수 있기 때문에, 현존하는 의약품 성분의 대체 소재로 주목 받고 있다.

William J. et al., NATURE.,423, pp.337342, 2033

본 발명의 목적은 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일 측면은 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 “진교(Gentianae Macrophyllae Radix)”는 우리나라 전국 각지의 수풀 속의 음습한 땅에 자라는 미나리아재비과 동속근연식물의 다년생 초분식물의 뿌리를 일컫는 것이다. 일명 '진범' 또는 '오독도기'라고도 하며 가을에 채취하여 경엽, 수염뿌리를 제거하고 깨끗이 썰어서 햇볕에 말린 것을 약제로 사용되는 무독한 한방 생약이다.

한방에서는 예로부터 상기 동속근연 식물을 진통(鎭痛), 진경(鎭痙), 풍습비통(風濕痺痛), 관절염, 황저(黃疽) 및 소변불리(小便不利) 등의 치료에 사용하여 왔으며, 최근에는 상기 약효 이외에 혈압 강하, 각종 감염증에 대한 항균 작용, 진통 및 부신 피질 자극 호르몬 분비 증가에 의한 염증에도 약효가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 소염 효과를 이용하여 여드름 또는 염증 방지용 화장료의 성분으로 사용되고 있다.

상기 “추출물”은 용매와 추출재료를 특정 조건하에서 접촉시킴으로써 추출재료에 함유된 유효성분을 분리해낸 것으로, 상기 추출물은 진교에 대한 추출 공정에 의해 원료 내의 유효성분을 포함할 수 있다.

상기 진교 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 상기 진교 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 구체적으로는 물을 사용할 수 있다.

또한, 상기 추출 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 열수 추출을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 “골 질환”은 파골세포의 활성 억제를 통해 골량 증가가 필요 또는 요구되는, 상태 또는 질병을 의미하는 것으로 골다공증, 골 형성 부전증, 골연화증, 골량 감소증, 골절, 골 결손 및 골감소증으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으며, 구체적으로는 골다공증일 수 있으나, 파골세포 분화 촉진에 의해 발생하는 질환 또는 병태라면 특별히 제한되지 않는다.

상기 “골다공증(osteoporosis)”은 뼈의 강도가 약해져서 쉽게 골절되는 골격계 질환으로, 파골세포의 분화 촉진으로 골밀도가 감소하여 발생할 수 있으며, 상기 골다공증으로 인해 뼈나 골단판 또는 관절면의 연속성이 완전 혹은 불완전하게 소실된 상태인 “골절(fracture)”, 뼈의 일부나 전부가 손상된 “골 결손(bone defect)” 등의 골 질환이 쉽게 발생할 수 있다.

상기 “골 형성 부전증(osteogenesis imperfect)”은 특별한 원인이 없이도 뼈가 쉽게 부러지는 선천성 유전질환으로, 불완전 골형성증으로도 불린다. 상기 골 형성 부전증에 걸린 환자의 경우, 파골세포의 분화에 의해 골의 강도가 더욱 약해질 수 있으며, 이러한 경우 골다공증, 골절, 골 결손 및 골감소증 등과 같은 골 질환의 발병 가능성이 높아지게 된다.

상기 “골감소증(osteopenia)”은 뼈감소증으로도 불리며, 정상적인 골융해를 보상하기에 충분한 수준의 골합성이 이루어지지 않기 때문에 일어나는 골부피의 감소가 나타는 현상이다. 상기 골융해는 파골세포의 분화 촉진에 의해 발생할 수 있으며, 파골세포의 분화를 억제하는 경우 골융해의 수준을 낮출 수 있어 파골세포의 분화를 억제시키는 조성물을 골감소증의 예방 내지 치료에 사용할 수 있다.

상기 “예방”은 동물의 병리학적 세포의 발생 또는 세포의 손상, 소실의 정도의 감소를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 병리학적 세포의 발생 또는 파골세포 증식 등이 상기 골 질환의 예방 및 치료용 조성물을 사용 하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.

또한, 상기 “치료”는 골 질환의 하나 이상의 증상을 개선하거나, 증상의 진행을 저지하는 것을 의미하며, 통상적으로 사용되는 치료의 의미를 포괄할 수 있다.

상기 진교 추출물은 화학물질 등과 달리 천연물 유래의 물질을 그대로 이용하는 것이므로, 이의 섭취 내지 투여에 따른 치명적인 부작용의 발생을 최소화할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 진교 추출물은 세포 독성이 없음을 확인하였다(도 1).

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 진교 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 진교 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

상기 “분획물(fraction)”은 각종 구성성분 또는 혼합물로부터 각각의 성분 또는 특정의 그룹으로 분리하는 조작, 즉 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 등을 사용하여 분리된 각 성분 내지 그룹을 의미한다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.

상기 진교 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양이 대상체에 투여될 수 있다.

상기 “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료방법을 제공한다.

상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 진교 추출물은 파골세포의 분화를 억제할 수 있다.

상기 “파골세포의 분화”는 RANKL이 RANK 수용체와 결합되어 개시될 수 있다. 구체적으로, 상기 RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)와 같은 생물 분자가 활성화될 수 있다.

상기 TRAF 패밀리 멤버인 TRAF2, TRAF5, TRAF6는 파골세포의 분화에 필요한 NF-κB 및 AP-1(activator protein-1) 등의 전사인자를 활성화할 수 있다.

상기 RANKL 신호에 의해 활성화된 TRAF6는 PI3K, TAK1(transforming growth factor βkinase), Akt/PKB, 및 JNK, ERK, p38을 포함하는 MAPKs, NF-κB, c-Fos, Fra-1, CREB(cyclic-AMP-responsive-element-binding protein), NFATc1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1) 등을 활성화할 수 있다.

상기 경로에 의해 카텝신 K(cathepsin K), TRAP(tartrate-resistant acid phospatase), 칼시토닌 수용체 및 OSCAR(osteoclast-associated receptor) 등 파골세포-특이적 유전자들이 발현될 수 있다.

상기 진교 추출물은 파골세포의 ERK, JNK 및 p38의 인산화를 억제할 수 있고(도 3), c-Fos, NFATc1, TRAP, RANK, CTR 및 CTK의 단백질 내지 유전자의 발현을 억제할 수 있다(도 4).

본 발명의 다른 측면은 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 “개선”은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 “식품 조성물”은 육류, 스낵류, 낙농제품, 음료수 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적인 건강기능식품을 모두 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.

상기 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 상기 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미할 수 있다.

상기 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다.

상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다.

상기 건강기능식품은 골 질환 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품은 골 질환 개선을 목적으로, 전체 중량 대비 1.0 내지 10.0 중량%의 상기 조성물을 포함할 수 있다. 상기 조성물이 1.0 중량% 미만이면 골 질환 개선 효과가 충분히 구현되지 않을 수 있고 10.0 중량% 초과이면 제품 본연의 품질이 구현되지 않거나 비용 효율이 저하될 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 골 질환 개선을 목적으로 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조 및 가공될 수 있다.

구체적으로 상기 정제 형태의 건강기능식품은 진교 추출물 또는 이의 분획물, 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.

상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 가지 추출물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 진교 추출물 또는 이의 분획물, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다.

상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 솔비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

상기 환 형태의 건강기능식품은 진교 추출물 또는 이의 분획물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

상기 과립형태의 건강기능식품은 진교 추출물 또는 이의 분획물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다

또한, 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다.

본 발명은 천연물인 진교 추출물을 약학적 조성물 내지 식품 조성물의 성분으로 사용함으로써 부작용을 최소화하면서도 골 질환 개선 효과를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 진교 추출물(w-GH) 처리에 따른 세포 생존률을 측정한 결과이다.
도 2는 진교 추출물의 처리에 따른 파골세포의 분화능을 평가한 결과로, 구체적으로, 파골세포의 분화를 유도한 세포에 진교 추출물을 처리하였을 때의 (A) TRAP staining 및 Pit formation assay 결과, (B) 파골세포의 수, (C) TRAP 활성 및 (D) 총 면적 대비 pit 면적을 나타낸 결과이다.
도 3은 진교 추출물의 처리에 따른 파골세포의 분화 관련 단백질인 ERK, JNK 및 p38 인산화 정도를 웨스턴 블롯(western blot) 방법으로 측정(A) 후 수치화(B)한 결과이다.
도 4는 진교 추출물의 처리에 따른 파골세포의 분화 관련 단백질인 NF-κB의 위치를 웨스턴 블롯(western blot) 방법으로 측정(A) 후 수치화(B)한 결과이다.
도 5는 진교 추출물의 처리에 따른 파골세포의 분화 관련 단백질인 c-Fos 및 NFATc1의 발현량을 웨스턴 블롯(western blot) 방법으로 측정(A) 후 수치화(B)한 결과이다.
도 6은 진교 추출물의 처리에 따른 파골세포의 분화 관련 유전자(mRNA)인 c-Fos, NFATc1, TRAP, RANK, CTR 및 CTK의 발현량을 웨스턴 블롯(western blot) 방법으로 측정(A) 후 수치화(B)한 결과이다.

이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 서술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

제조예 1 : 진교 물 추출 방법

진교(대한민국, 옴니허브에서 구입) 300 g에 증류수 3 L를 첨가하여 2시간 동안 열수 추출하였다. 추출액을 거즈로 걸러낸 후, 여과지로 여과하고, 동결건조하여 분말화하였다. 수득된 진교 추출물(w-GM)은 94.4 g으로 수득율은 31.5 %이다.

상기 진교 추출물은 냉동 보관(-80 ℃)하였으며, 세포 배양시 사용한 작약은 0.22 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 사용하였다.

제조예 2 : 세포 배양

10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1%의 P/S(페니실린 및 스트렙토마이신)를 포함하는 α-MEM(Minimum Essential Medium Eagle-alpha modification) 배지에 RAW 264.7 세포를 분주하여 95 %의 습도, 37 ℃, 5 % CO₂의 조건에서 배양하였다.

실험예 1 : 세포 독성 분석

진교 추출물의 세포 독성 여부를 확인하기 위해 상기 제조예 1의 진교 추출물을 상기 제조예 2의 세포에 처리한 후 MTS assay를 이용하여 세포 증식을 측정하였다.

구체적으로, 상기 제조예 2의 세포 5000 개를 96-well plate에 분주한 후 24 시간 동안 안정화하였다. 안정화 후 배지를 버리고 각 배양액에 상기 진교 추출물을 62.5, 125 및 250 μg/ml 농도로 첨가한 뒤 24 시간 배양하였다. 그 후 MTS assay solution을 처리 후 ELISA 기기를 통해 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 독성 측정 결과는 시료의 흡광도를 대조군(진교 추출물 0 μg/mL, N)의 흡광도에 대한 백분율로 표시하였다(도 1).

도 1을 참조하면, 상기 농도 범위에서 진교 추출물의 세포 독성은 나타나지 않았다.

실험예 2 : 파골세포 분화능 평가

파골세포 분화능을 효과적으로 억제하는 경우 골다공증과 같은 골 질환 개선에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 실험예에서는 진교 추출물의 파골세포 분화능 억제 활성을 평가하기 위해 상기 제조예 2의 세포에 파골세포 분화 유도제인 RANKL과 상기 제조예 1의 진교 추출물을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도하고, TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색법을 이용하여 파골세포 분화능을 분석하였다.

구체적으로, 상기 제조예 2의 RAW 264.7 세포 5000 개를 96-well plate와 osteo assay strip well plate (Coring incorporated, New York, USA) 에 분주한 뒤, 24시간 안정화시켰다. 이후, 파골세포 분화 유도 인자인 RANKL(100 ng/ml)과 제조예 1의 진교 추출물(62.5, 125 및 250 μg/ml)이 첨가된 배양액으로 교환하여 5 일간 배양하였다. 배지는 2 일마다 동일한 배지로 교환하였다.

분화된 파골세포는 TRAP assay kit를 사용하여 염색하고, 배양액 내 TRAP의 활성도를 측정하였다. 염색된 세포가 붉은색이면서, 다핵 세포일 때 TRAP-양성 세포로 간주하였다.

osteo assay strip well plate 에 배양한 세포는 4 % NaClO를 사용하여 세포를 떼어낸 뒤, 현미경을 사용하여, TRAP 염색 plate 및 Pit Area 는 100 배율에서 각각 관찰하였다(도 2).

도 2A를 참조하면, 진교 추출물의 처리의 의해 붉은 다핵의 TRAP-positive 세포가 감소(TRAP Staining)하였고, 파골세포의 골 흡수능을 유의하게 억제(Pit formation assay)하였다.

또한, TRAP 염색된 파골세포의 수를 측정한 도 2B를 참조하면, 진교 추출물(62.5, 125 및 250 μg/ml)의 처리로 파골세포의 수가 유의하게 감소하였다(*P < 0.05, **P < 0.01).

더불어, 상기 세포를 배양한 배양액의 TRAP 활성도를 측정한 도 2C를 참조하면, 진교 추출물(62.5, 125 및 250 μg/ml)의 처리에 의해 TRAP 활성도가 유의하게 감소하였다.

파골세포의 분화를 통해 흡수된 osteo plate의 pit 면적을 측정한 도 2D를 참조하면, 진교 추출물(62.5, 125 및 250 μg/ml)의 처리에 의해 pit의 면적이 유의하게 감소하였다.

상기 결과는 진교 추출물이 파골세포의 분화능을 효과적으로 억제함을 시사한다.

실험예 3 : 파골세포 분화 관련 단백질의 발현 분석

진교 추출물이 파골세포 분화 과정에 미치는 영향을 확인하고자 단백질의 발현 활성을 평가하였다.

상기 제조예 2의 세포에 파골세포 분화 유도제인 RANKL과 상기 제조예 1의 진교 추출물을 처리하여 분화시킨 파골세포에 RIPA buffer(50 mM Tris.Cl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% Na.deoxycholate, 0.1% SDS, protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail)를 이용하여 전체 단백질을 추출하였다.

이 때, 상기 진교 추출물의 농도를 250 μg/ml로 하여 5, 15 및 30분간 단백질을 추출하여 p-ERK, T-ERK, p-JNK, T-JNK, p-p38 및 T-p38을 검출하였다.

또한, 상기 진교 추출물의 농도를 62.5, 125 및 250 μg/ml로 처리하여 1일 동안 배양한 후 단백질을 추출하여 c-Fos 및 NFATc1을 검출하였다.

핵 단백질과 세포질 단백질 분리는 NE-PER kit를 사용하였으며, 상기 핵 단백질은 NF-κB 및 Lamin을 검출하는데 사용하였다.

단백질은 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하였으며, 동량의 단백질(30 μg)은 10 내지 15 %의 SDS-PAGE에 전기 영동한 뒤, nitrocellulose transfer에 흡착시켰다. 이후, 1 % BSA에 녹인 1차 항체(p-ERK, T-ERK, p-JNK, T-JNK, p-p38, T-p38, c-Fos, NFATc1, NF-κB, Lamin 및 Actin)를 24 시간 동안 4 ℃에서 반응시켰다. 그 후 blocking buffer에 1 : 10000로 희석시킨 2차 항체(peroxidase-conjugated anti-IgG)를 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 TBS-T로 10 분간 6 번씩 세척한 뒤, Enhanced chemiluminescence(ECL)용액(Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA)을 이용하여 단백질 발현 양을 조사하였다(도 3 내지 도 5).

도 3A 및 도 3B를 참조하면, 15 분간 진교 추출물을 처리하였을 때 분화된 파골세포의 ERK, JNK 및 p38의 인산화를 유의하게 억제하였다.

도 4A 및 도4B를 참조하면, 5 및 15 분간 진교 추출물을 처리하였을 때 분화된 파골세포에서 NF-κB가 핵 안으로 translocation하는 것을 유의하게 억제하였다.

도 5A 및 도 5B를 참조하면, 진교 추출물을 125 및 250 μg/ml로 처리하였을 때 c-Fos 및 NFATc1의 단백질 발현을 유의하게 억제하였다.

실험예 4 : 파골세포 분화 관련 mRNA 발현 분석

진교 추출물이 파골세포 분화 과정에 미치는 영향을 확인하고자 mRNA 활성을 평가하였다.

구체적으로, 상기 제조예 2의 세포에 파골세포 유도인자인 RANKL(100 ng/ml)와 진교 추출물(62.5, 125 및 250 μg/ml)을 처리하여 4 일 동안 배양하여 파골세포를 수득하였다. 상기 파골세포의 총 RNA는 TRIzol을 사용하여 분리하였다.

추출한 2 μg 의 RNA를 제조의 지시에 따라 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA(complementary DNA)로 합성하였다. 합성한 cDNA는 KAPA PCR kit(Kapa Biosystems)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다.

GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 이용하여 mRNA 농도를 표준화(normalization)하였다.

Image J software(Ver. 1.46, National Institutes of Health)를 사용하여 각 band density의 데이터 분석을 진행하였으며, 실험에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다(도 6).

구분	Sequence		서열번호
c-Fos	Forward	5'-ATG GGC TCT CCT GTC AAC AC-3'	1
	Reverse	5'-GGC TGC CAA AAT AAA CTC CA-3'	2
NFATc1	Forward	5'-TGC TCC TCC TCC TGC TGC TC-3'	3
	Reverse	5'-CGT CTT CCA CCT CCA CGT CG-3'	4
TRAP	Forward	5'-ACT TCC CCA GCC CTT ACT ACC G-3'	5
	Reverse	5'-TCA GCA CAT AGC CCA CAC CG-3'	6
RANK	Forward	5'-CTC TCA GGA CAA TGC AGT GCT GA-3'	7
	Reverse	5'-ATC CAG GTC ACA CAT TCC AGC A-3'	8
CTR	Forward	5'-TGC ATT CCC GGG ATA CAC AG-3'	9
	Reverse	5'-AGG AAC GCA GAC TTC ACT GG-3'	10
CTK	Forward	5'-AGG CGG CTA TAT GAC CAC TG-3'	11
	Reverse	5'-CCG AGC CAA GAG AGC ATA TC-3'	12
GAPDH	Forward	5’-ACT TTG TCA AGC TCA TTT CC-3'	13
	Reverse	5’-TGC AGC GAA CTT TAT TGA TG-3'	14

도 6A 및 도 6B를 참조하면, 250 μg/ml의 진교 추출물을 처리한 경우, c-Fos, NFATc1, TRAP, RANK, CTR 및 CTK의 mRNA 발현을 유의하게 억제하였다.상기 결과는 진교 추출물이 파골세포 분화 관련 단백질 및 유전자의 발현을 효과적으로 억제하여 골다공증 등의 골질환 치료 효과가 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kyung Hee University <120> A COMPOSITION FOR PREVENTIION OR TREATMENT OF BONE DISEASE COMPRISING GENTIANAE MACROPHYLLAE RADIX <130> SKH19P-0008-KR <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Fos sense primer <400> 1 atgggctctc ctgtcaacac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Fos antisense primer <400> 2 ggctgccaaa ataaactcca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 sense primer <400> 3 tgctcctcct cctgctgctc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 antisense primer <400> 4 cgtcttccac ctccacgtcg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP sense primer <400> 5 acttccccag cccttactac cg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP antisense primer <400> 6 tcagcacata gcccacaccg 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANK sense primer <400> 7 ctctcaggac aatgcagtgc tga 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANK antisense primer <400> 8 atccaggtca cacattccag ca 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTR sense primer <400> 9 tgcattcccg ggatacacag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTR antisense primer <400> 10 aggaacgcag acttcactgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTK sense primer <400> 11 aggcggctat atgaccactg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTK antisense primer <400> 12 ccgagccaag agagcatatc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 13 actttgtcaa gctcatttcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 14 tgcagcgaac tttattgatg 20

Claims (8)

1. 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 에탄올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 골 질환은 골다공증, 골 형성 부전증, 골연화증, 골량 감소증, 골절, 골 결손 및 골감소증으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   파골세포의 분화를 억제하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   RANK 신호 경로(RANK signaling pathway)를 억제하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   ERK, JNK 및 p38의 인산화를 억제하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 제5항에 있어서,
   c-Fos, NFATc1, TRAP, RANK, CTR 및 CTK의 발현을 억제하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 진교(Gentianae Macrophyllae Radix) 추출물을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

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