KR102160627B1 - 헛개나무 가지 추출물을 함유하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헛개나무 가지 추출물을 함유하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 헛개나무 가지 추출물은 천연물로부터 유래하여 독성이 적을 뿐만 아니라, 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써, 과도한 골 재흡수를 억제하여 궁극적으로 골다공증을 비롯한 골 손실에 의한 골 질환의 새로운 예방 및 치료제로서 사용될 수 있다.

Description

헛개나무 가지 추출물을 함유하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating bone disease comprising extracts of branches of Hovenia dulcis Thunb}

본 발명은 헛개나무 가지 추출물을 함유하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

인체의 골조직은 조골세포에 의한 골 재형성(Bone formation)과 파골세포에 의한 골 재흡수(Bone resorption) 과정과 같은 골의 리모델링(Bone remodeling)이 평생동안 끊임없이 반복되어 이루어진 역동적인 기관이다. 골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이와 같은 기능을 하는 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포, 파골세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 이들 중 파골세포는 조혈모세포로부터 유래한 세포로서 노화된 골의 흡수를 담당하며, 조골세포는 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 세포로서 골 형성에 주된 역할을 담당한다.

이 중 파골세포는 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포가 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수하는 역할을 한다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MAPK, 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다(Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30, 305, 211-4). 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.

골 질환의 대표적인 예인 골다공증은 골의 재흡수와 재형성 사이의 균형이 깨어져서 골 재흡수 속도가 빨라짐에 따라 골의 칼슘이 빠져 일어나게 되는 골소실로 인한 골절에 의해 급격히 초래되는 질병이다. 따라서 골다공증 치료제를 개발하기 위한 통상적인 실험방법은 일차적으로 파골세포의 활성을 억제시키거나, 조골세포의 활성을 증가시키는 물질을 선택한 후, 인간에서 나타나는 골다공증과 유사한 증상을 보이는 동물을 사용하여 골량이 얼마만큼 회복되고, 골강도가 얼마만큼 회복되었는지 정도로 약효를 평가한다.

골다공증의 원인은 다양하게 생각할 수 있지만, 가장 많은 것이 나이가 드는 것(노화) 또는 여성의 폐경 후의 호르몬 불균형이기 때문에, 현재의 치료는 주로 에스트로겐, 비타민 D나 칼시토닌의 투여가 행해지고 있다. 그러나, 호르몬의 투여는 암(특히, 유방암, 자궁암 등)을 유발할 위험이 있어 안전한 치료 방법이라고는 할 수 없다. 또한, 제2세대 치료제로서, 비스포스포네이트의 투여도 행해지고 있지만, 투여를 중단하면 리바운드가 발생하는 문제점을 가지고 있다. 이들 중 어느 쪽의 방법도 골다공증의 진행을 지연시킬 수는 있어도 일단 감소한 골을 재생시키기는 어려운 단점 역시 가지고 있다.

한편, 골 질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요한 바, 이에 대한 치료제로 크게 골흡수 억제제와 골형성 자극제가 있다. 이들 중 골 형성 자극제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 골 형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않으므로 임상적으로 널리 사용되기 위해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다. 뿐만 아니라, 골 형성을 자극하기 위한 제제로서 조골세포를 활성화시키기 위한 촉진제 및 파골세포의 골 흡수를 억제하기 위한 억제제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 천연물로부터 유래하여 독성이 적고, 파골세포의 분화를 억제할 수 있는 화합물을 찾고자 예의 노력한 결과, 헛개나무 부위 가운데, 헛개나무의 가지부위를 추출한 추출물이 다른 부위의 추출물에 비하여 파골세포의 분화를 현저하게 억제함으로써 골다공증의 예방 및 치료제로 사용될 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 헛개나무 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 헛개나무 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 헛개나무 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 식물 추출물 제조에 있어 식물의 각 부위마다 추출물의 활성이 상이할 수 있음에 기초하여, 헛개나무의 가지, 줄기, 잎, 열매 등 여러 부위 가운데 헛개나무의 가지 부위의 추출물이 세포독성 없이 다른 부위의 추출물에 비하여 TRAP 활성을 현저하게 억제함을 확인함으로써 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하고, 나아가 파골세포의 활성 증가에 의한 골다공증과 같은 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 최초로 규명하였다.

구체적으로, 본 발명의 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 헛개나무 가지 추출물을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "헛개나무(Hovenia dulcis)"는 한국, 일본, 중국 등지에 분포하는 갈매나무과 낙엽활엽교목이다. 최근 헛개나무의 약효에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 간, 대장, 위, 신장에 좋고, 특히 『본초강목』,『당본초』 등에는 음주 후 해독에 신효하다는 기록이 있다. 또한, 헛개나무는 알콜성 간염, 지방간, 간경화 등의 간질환과 갈증 해소에 효능이 있으며, 헛개나무의 활성화학물질이 숙취 해소와 구취 제거 및 변비에 효과를 보이는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 "헛개나무 가지 추출물"은 헛개나무의 줄기로부터 파생한 헛개나무의 가지를 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 총칭하는 것으로, 상기 헛개나무 가지 추출물은 헛개나무 가지 분쇄물을 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 희석액 또는 농축액, 또는 추출액의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함할 수 있다. 또한 상기 헛개나무 가지 추출물은 천연, 잡종, 변종식물의 가지로부터 추출될 수 있다. 본 발명에서 추출하는 헛개나무의 가지는 헛개나무의 원줄기로부터 파생한지 1년 이내의 어린가지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 추출 방법에 있어서, 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 온침 추출, 가압 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

헛개나무 가지 추출물을 수득함에 있어, 바람직하게는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용할 수 있으며, 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 적절한 유기용매를 선택하여 사용할 수 있다.

상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있다.

추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다.

농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 또는 적외선건조 등을 포함한다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 추출물은 추가의 분획 공정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 추출물을 증류수에 현탁시켜 비극성 유기용매, 예를 들어, 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득하도록 하고, 이를 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 헛개나무 가지 추출물이 헛개나무의 다른 부위의 추출물에 비하여 파골세포의 분화 표지마커로 알려져 있는 TRAP의 발현을 효과적으로 억제함을 밝혀냄으로써 골 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 골 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 본 발명의 조성물에 의해 골 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "골 질환"은 골밀도가 감소되어 일어나는 모든 질환을 포함하며, 구체적으로는 골다공증, 골연화증, 골감소증, 골위축, 골관절염 등을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 골다공증일 수 있다. 골다공증의 증상인 골밀도의 감소는 뼈(bone)내의 파골세포와 조골세포의 불균형에 의한 결과로서, 과도한 파골세포의 생성은 골다공증과 같은 골밀도를 감소시키는 질병을 유도한다.

상기 골다공증은 예컨대, 여성에서의 폐경에 따른 골다공증, 노인성 골다공증 및 난소 적출술에 따른 골다공증 등의 원발성 골다공증; 글루티코르티코이드 유발성 골다공증, 갑상선 기능 항진성 골다공증 고정 유발성 골다공증, 헤파린 유발성 골다공증, 면역 억제 유발성 골다공증, 신부전에 따른 골다공증, 염증성 골다공증, 쿠싱 증후군에 따른 골다공증 및 류마티스성 골다공증 등의 이차성 골다공증; 등과 같은 골 질환 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 표지 마커로 알려져 있는 c-Fos, NFATc1, DC-STAMP, c-src, cathepsin K, oscar 또는 TRAP의 발현을 효과적으로 억제함으로써 골 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 "파골세포(osteoclast)"란, 대식 세포 전구체(macrophage precursor)로부터 파생되는 세포로서 파골세포 전구 세포들은 대식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL) 등에 의해 파골세포로 분화되며 융합을 통해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성한다. 파골세포는 αvβ3 인테그린(integrin) 등을 통해 골(bone)에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apoptosis)를 일으킨다.

본 발명의 실시예에서는 파골세포로 분화한 마우스 단핵구 세포에 본 발명의 조성물을 투여한 후, 파골세포 분화 표지 인자인 TRAP(tarrate-resistant acid phosphate) 염색을 실시한 결과, 헛개나무의 다른 부위의 추출물에 비하여 현저하게 TRAP 활성을 농도 의존적으로 저해시키는 것을 확인하였다(도 1a, 도 1b, 도 2a 및 도 2b). 이와 같이 본 발명의 조성물은 TRAP 활성 억제를 통해 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로, 파골세포의 활성 증가에 의한 골다공증과 같은 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 헛개나무 가지 추출물을 포함하는 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 헛개나무 가지 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 100 중량%로, 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 약학적 조성물을 골 질환의 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 골 질환의 의심 개체는 골 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 헛개나무 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 골 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 골 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 골 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 방법은 헛개나무 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 300 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 헛개나무 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는, 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 헛개나무 가지 추출물을 골 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 포함시킬 수 있다.

상기 헛개나무 가지 추출물 및 골 질환 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "개선"은 상기 조성물을 이용하여 골 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물을 포함할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 헛개나무 가지 추출물은 천연물로부터 유래하여 독성이 적을 뿐만 아니라, 헛개나무의 다른 부위의 추출물에 비하여 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써, 과도한 골 재흡수를 억제하여 궁극적으로 골다공증을 비롯한 골 손실에 의한 골 질환의 새로운 예방 및 치료제로서 사용될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 헛개나무의 부위별 추출물의 농도에 따른 파골세포 형성 억제효과를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 헛개나무의 부위별 추출물의 농도에 따른 TRAP 활성 억제효과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 헛개나무의 부위별 추출물의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 도이다.
도 4는 헛개나무 가지 추출물을 투여한 마우스의 (A) 체중, (B) 비장의 무게, (C) 흉선의 무게 및 (D) 자궁의 무게의 변화를 나타낸 도이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었으며(n=5), ^*는 OVX 군 대비 p<0.05, ^**는 p<0.01을 의미한다.
도 5는 채취한 혈액의 혈청으로부터 생화학적 마커를 측정한 결과로서, 헛개나무 가지 추출물의 혼합물의 마커 발현 정도를 나타낸 도이다. (A)는 무기인산, (B)는 ALP(Alkaline phosphatase), (C)는 칼슘, (D)는 TCHO(Total cholesterol)에 관한 도이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었으며(n=3~5), ^*는 OVX 군 대비 p<0.05, ^**는 p<0.01을 의미한다.
도 6은 채취한 혈액의 혈청으로부터 생화학적 마커를 측정한 결과로서, 헛개나무 가지 추출물의 혼합물의 마커 발현 정도를 나타낸 도이다. (A)는 estradiol, (B)는 TRAP에 대한 도이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었으며(n=3~5), ^*는 OVX 군 대비 p<0.05, ^**는 p<0.01을 의미한다.
도 7은 헛개나무 가지 추출물을 투여한 마우스의 비장에서의 CD4, CD8, 및 흉선에서의 CD4, CD8의 발현 정도를 나타낸 도이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었으며(n=3), ^*는 OVX 군 대비 p<0.05, ^**는 p<0.01을 의미한다.
도 8은 헛개나무 가지 추출물을 투여한 마우스의 경골과 대퇴골의 형태학적인 특성을 나타낸 결과로서, bone volume/tissue volume(BV/TV), bone surface/tissue volume(BS/TV), bone surface/Bone volume(BS/BV), SMI, trabecular bone pattern factor(Tb.Pf), trabecular thickness(Tb.Th), trabecular number (Tb.N) 및 trabecular separation (Tb.Sp)의 값을 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었으며(n=5), ^*는 OVX 군(대퇴골) 대비 p<0.05, ^**는 p<0.01, ^***는 p<0.001을 의미하고, ^#는 SHAM 군(대퇴골) 대비 p<0.05, ^##는 p<0.01, ^###는 p<0.001을 의미한다. 또한, ^†는 OVX 군(경골) 대비 p<0.05, ^††는 p<0.01, ^†††는 p<0.001을 의미하고, ^O는 SHAM 군(경골) 대비 p<0.05, ^OO는 p<0.01, ^OOO는 p<0.001을 의미한다.
도 9는 헛개나무 가지 추출물을 투여한 마우스의 경골과 대퇴골을 CT촬영하여 3D 사진으로 전환한 사진이다.
도 10은 헛개나무 가지 추출물을 투여한 마우스의 경골 및 대퇴골 부위를 H&E 염색, TRAP 염색 및 Masson's trichrome 염색을 실시한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 헛개나무의 부위별 추출물의 제조

헛개나무의 어린가지 부위를 채취하여 1.500 kg을 전자저울을 이용하여 칭량하여, 8.1 L의 정제수를 첨가하여 100℃까지 물을 끓여 4시간 동안 추출물을 추출하였다. 추출이 완료된 후 여과기를 통하여 여과한 후 저장탱크로 여과액을 이송하였고, 저장탱크의 온도를 50℃까지 올린 후, 40 Brix 이상이 되도록 고형분에 압력을 가하였고, 0.08 내지 0.09 MPa에서 진공농축하였다. 진공농축 후 성상이나 향미를 확인하여 문제없이 농축되었는지 확인하였다.

가지를 제외한 나머지 부위(헛개나무의 잎, 열매, 줄기, 줄기-수피, 줄기-심재)의 추출물(99.9% 메탄올 추출물)에 대하여는 하기 표 1와 같이 한국생명공학연구원 한국식물추출물은행(Korea Plant Extract Bank)으로부터 구입하여 사용하였다.

[표 1]

실시예 2: 난소절제 골 질환 동물모델 제조

실험동물은 오리엔트 바이오(한국, 전라북도, 익산)에서 특정병원체부재(specific pathogen free) C3H/HeN 8주령 생쥐를 공급받아 실험동물 사육실에서 폴리카보네이트 사육상자(18×20cm)당 4개체의 밀도를 유지하며 사육하였다. 이들 생쥐는 1∼2주일간 온도 21±2℃, 습도 55±10%의 환경에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 낮과 밤의 주기를 12시간씩 조절하면서 가능한 스트레스를 받지 않도록 사육하여, 생후 8∼9주의 생쥐를 실험에 사용하였다.

마취제로서 zoletil(버박 코리아)과 Rumpun(바이엘 코리아 주식회사)를 일정한 비율로 혼합하여 사용하였으며, 상기 마취제를 일정한 비율로 혼합하여 복강주사로 전신마취 후 상기 생쥐의 등 중앙부분을 약 1cm 절개하였다. 다른 장기에 손상이 가해지지 않도록 주의하여 자궁을 따라 난소를 확인하여 봉합용 실로 난소를 결찰한 뒤 양측의 난소를 모두 절제하였다. 난소 절제 후 각 장기를 복강 내로 재위치시킨 뒤 봉합용 실로 봉합하였다. 난소절제술의 성공여부는 정해진 기간 동안 시료가 투여된 후 자궁주변의 혈관의 발달과 자궁의 크기 및 무게의 측정여부를 통해서 확인할 수 있다.

난소가 절제되지 않은 SHAM군과, 난소가 절제된 마우스에 물을 투여하는 OVX군, 헛개나무 가지 추출물을 투여대상 마우스에 대하여 각각 100mg/kg 및 300mg/kg으로 투여하는 투여군(HD100, HD300)으로 설정하며, 실험군당 개체 수는 시험 결과의 통계적 유의성을 평가할 수 있는 개체수로서 5마리로 설정하였다. 투여기간은 골 질환 치료제는 장기간 복용해야 하는 특성이 있으므로, 동물모델에서도 이러한 특성이 충분히 반영될 수 있도록 6주간 투여하였다.

실험예 1: 헛개나무의 부위별 추출물의 TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 염색 및 활성도 분석

5주령 생쥐의 넙다리뼈와 정강뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/㎖)가 포함된 α-minimum essential medium(α-MEM)배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 M-CSF (30 ng/㎖)와 RANKL (10 ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 상기 실시예 1에서 제조한 헛개나무 부위별 추출물을 농도별(1, 3, 10 μg/ml)로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포는 파골세포로 간주하였다.

다핵 파골세포는 3.7% 포르말린으로 고정하고 10분간 0.1% Triton X-100으로 세포막의 투과성이 높아지면 TRAP 용액의 처리에 의해 붉게 염색된다. 붉게 염색된 파골세포는 3개 이상의 핵을 갖는 것만 파골세포로 인정하였다. TRAP 활성도를 측정하기 위하여, TRAP이 염색된 파골세포에 3mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich)가 함유된 TRAP 완충용액(100mM sodium citrate pH 5.0, 50mM sodium tartrate)을 처리하여 37℃에서 5분간 반응시키고 반응된 상층액을 새로운 플레이트에 옮긴 후 0.1 N NaOH를 동량으로 첨가해 405 nm에서 흡광도를 확인하였다.

그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타나듯이 헛개나무 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비하여, 실시예 1의 헛개나무의 가지, 줄기(수피), 잎 추출물을 투여하였을 때 농도의존적으로 파골세포의 형성이 억제되는 경향이 있음을 확인하였다. 특히 그 중에서도 헛개나무 가지 추출물을 투여한 군에서 파골세포의 형성이 현저하게 억제되었음을 확인하였다.

또한, 도 2a 및 도 2b에서도 나타나듯이, 실시예 1의 헛개나무 부위별 추출물 가운데 헛개나무 가지 추출물만이 3 및 10 μg/ml 농도로 처리한 세포에서 TRAP 활성도를 현저히 억제하였음을 확인하였다.

상기와 같이 헛개나무 가지 추출물이 다른 부위의 추출물에 비하여 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로 골다공증과 같은 골 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

실험예 2: 헛개나무의 부위별 추출물의 세포독성 분석

포식세포는 1×10⁴/well의 밀도로 96-well plate에서, 상기 실시예 1에서 제조한 헛개나무의 부위별 추출물을 농도별로 M-CSF (30 ng/㎖)와 함께 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 후, CCK 용액 50 ㎕를 각각의 well에 첨가하고 4시간 배양 후 ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.

그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타나듯이, 다른 부위 추출물과 마찬가지로 헛개나무 가지 추출물을 농도별로 처리하여도 세포 생존률이 감소하지 않아 세포독성이 없는 것을 확인하였다.

실험예 3: 몸무게, 장기무게(비장, 흉선, 자궁) 및 뼈(경골, 대퇴골)의 무게와 길이 측정

상기 실시예 1에서 제조한 헛개나무 가지 추출물을 투여량(100mg/kg, 300mg/kg)을 달리하여 6주간의 투여가 끝난 후 다음 날 마우스가 희생되지 않는 상태로 전자저울을 이용하여 몸무게를 측정하였으며, 이후 경추탈골하여 희생 후 장기의 무게를 측정하였다. 경골과 대퇴골의 경우 왼쪽과 오른쪽 모두 적출하였으며 길이는 vernier calipers를 사용하여 측정하였고, 무게는 저울을 사용하여 측정하였다.

그 결과, (1) SHAM군에 비해 OVX군에서 몸무게가 증가하였으나, HD100 투여군 및 HD300 투여군에서는 몸무게의 증가를 억제함으로써 SHAM군과 유사한 몸무게를 가짐을 확인하였다(도 3의 A). (2) 흉선의 무게 또한 추출물 투여군에서 SHAM군 및 OVX군에 비해 감소되었음을 확인하였고, 투여량이 많을수록 흉선의 무게가 더욱 감소하는 경향을 보였다(도 3의 C). (3) 비장의 경우, HD300 투여군에서 비장 무게의 증가가 유의적으로 억제되었음을 확인하였다(도 3의 B). (4) 자궁의 경우, SHAM군에 비해 OVX군에서는 무게가 현저히 감소하였고, 추출물의 투여군에서 자궁의 무게가 유의적으로 증가되었음을 확인하였고, 추출물의 투여량이 많아질수록 자궁의 무게가 증가하는 경향을 보임을 확인하였다(도 3의 D). 이는 골다공증 모델이 성공적으로 유도가 되었는지 판단할 수 있는 중요한 요소가 되며, 난소가 제거된 경우 자궁의 무게가 감소한다는 것이 많은 논문에 보고된 바 있다. (5) 경골과 대퇴골의 무게와 길이는 SHAM군과 OVX군 간에 큰 차이가 없지만 추출물 투여군에서 경골의 무게가 증가된 것을 확인하였다(표 2).

[표 2]

실험예 4: 생화학적 분석

생화학적 분석을 위하여, 에테르를 이용하여 마우스를 마취한 후 Microheamatocrit capillary tube를 사용하여 안와채혈을 하고, 원심분리하여 Serum을 분리하고 Serum으로부터 Alkaline phosphatase(ALP), Calcium(Ca), Ionrganic phosphorus(IP), Total cholesterol(TCHO)은 측정슬라이드(Fujifilm, Japan)를 사용하여 automatic analyzer(Fuji Dri-Chem, Fuji, Japan)로 측정하였다.

그 결과, (1) 무기인산의 경우, OVX군에 비해 추출물 투여군에서 증가됨을 확인하였다(도 5의 A). (2) ALP의 경우, 추출물 투여군에서 발현이 억제된 것을 확인하였고(도 5의 B), (3) 칼슘의 경우, SHAM군에 비해 OVX군에서 약간 증가하는 패턴을 보였으며, 추출물 투여군에서 이를 감소시킨 것을 확인하였다(도 5의 C). (4) TCHO는 SHAM군에 비해 OVX군에서 증가하였으나, 추출물을 투여한 군에서는 이를 유의하게 억제함을 확인하였다(도 5의 D). 따라서 이는 헛개나무 가지 추출물이 칼슘 또는 ALP 등이 혈청으로 방출되는 것을 억제하는 활성이 있음을 암시한다.

실험예 5: Estradiol(E2)과 tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 측정

Serum으로부터 Estradiol(E2)과 Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 측정은 Estradiol ELISA kit(Calbiotech, San Diego, CA, USA)와 TRAP ELISA kit(Uscn Life Science, Wuhan, P.R. China) 제품을 사용하여 각각의 측정방법 준하여 실험을 실시하였다.

그 결과, 골다공증 치료제로 알려진 estradiol에 대하여 헛개나무 가지 추출물이 투여된 모든 군에서 농도(투여량)의존적으로 증가시킨 것을 확인하였다(도 6의 A). 한편, TRAP는 OVX군에서 증가하였으나, 헛개나무 추출물이 투여된 모든 군에서 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다(도 6의 B).

실험예 6: 면역세포의 population 측정

난소가 제거된 골다공증 유도 모델에서 헛개나무 가지 추출물이 림프구의 조절을 통해서 골 소실(bone loss)을 억제할 수 있는지 실험하기 위해서, 비장세포와 흉선을 적출하여 단일세포로 만든 후에 세포를 수거하여 anti-CD16/CD32(FcγⅢ/ⅡReceptor) mAb로 4℃에서 30분 동안 blocking하고 washing용액(1% FBS, 0.1% NaN₂/PBS)으로 세척하였다. 그리고 FITC Rat Anti-Mouse CD4, PE Rat Anti-Mouse CD8a, PE Hamster Anti mouse CD11C, FITC Anti-Mouse CD19(BD Pharmigen 사)를 이용하여 염색한 후, FACS cantoⅡ flow cytometer(BD Biosciences) 장비를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 비장에서 CD4 및 CD8, 흉선에서 CD4 및 CD8세포 모두 OVX군에서 증가되었고, 헛개나무 가지 추출물을 투여하였을 때 이를 농도 의존적으로 억제시킨 것을 확인하였다(도 7). 이는 CD4, CD8과 같은 T세포가 파골세포 분화를 촉진하는 사이토카인을 분비하는 것으로 알려져 있음을 고려할 때, 헛개나무 가지 추출물이 T세포의 발현을 억제함으로써 파골작용을 억제하고, 이를 통하여 골다공증으로의 진행을 막을 수 있음을 시사한다.

실험예 7: 경골과 대퇴골의 소주골의 형태학적 분석(Micro CT 촬영)

Micro CT 촬영을 위해서 경골과 대퇴골을 70% EtOH에 보관하였다. Skyscan1172 분석장비를 이용하여 촬영 후 골다공증의 형태학적 분석요소인 BV/TV, BS/BV, BS/TV, trabecular thickness/separation/number/pattern factor(Tb.Th, Tb.Sp, Tb.N, Tb.Pf), structure model index (SMI)를 측정하였다. 경골근위부와 대퇴골원위부분의 성장판이 사라지는 부분부터 150장의 slice 중 매 5번째의 slice를 선택하여 분석하였다.

그 결과, (1) bone volume/tissue volume(BV/TV)는 bone volume density를 측정한 것으로서 SHAM군에 비해 OVX군에서 감소하였으나, 헛개나무 가지 추출물 투여군에서 농도의존적으로 증가시킨 것을 확인하였다. (2) bone surface/tissue volume(BS/TV) 또한 상기 BV/TV와 유사한 패턴을 보였으며, (3) trabecular number (Tb.N) 및 trabecular thickness(Tb.Th)은 소주골의 숫자 및 두께를 각각 측정한 요소로서 마찬가지로 SHAM군에 비해 OVX군에서 감소되었고, 헛개나무 추출물을 투여한 군에서 증가된 것을 확인하였다(도 8).

(4) bone surface/Bone volume(BS/BV)는 상기 데이터들과는 반대의 형태로 SHAM군보다 OVX군에서 증가하였으며, 특히 경골에의 HD300 투여군에서 유의적으로 감소시켰음을 확인하였다. (5) SMI 또한 SHAM군보다 OVX군에서 증가하였으며, 헛개나무 가지 추출물의 투여군에서 유의적으로 감소된 것을 확인하였다. (6) trabecular bone pattern factor(Tb.Pf)는 뼈의 오목과 볼록함의 정도를 측정하는 요소로서, SHAM군에 비해 증가된 OVX군에 비하여 헛개나무 가지 추출물 투여군 모두에서 유의적으로 감소하였음을 확인하였다. (7) trabecular separation (Tb.Sp)는 소주골의 간격을 측정하는 요소로서, 특히 대퇴골에의 헛개나무 가지 추출물의 투여군에서 유의적으로 감소하였음을 확인하였다(도 8).

경골과 대퇴골의 micro CT 촬영한 slice를 3D 사진으로 전환하는 프로그램을 사용하여 전환한 결과를 경골의 근위부와 대퇴골의 원위부의 성장판이 사라지는 부분부터 사진으로 나타내었다. SHAM군에 비해서 OVX군에서는 피지골과 소주골이 많이 소실된 것을 확인할 수 있었고, 경골과 대퇴골 모두 헛개나무 가지 추출물을 투여하였을 때 피지골과 소주골이 증가되는 양상을 볼 수 있었다(도 9).

실험예 8: 경골과 대퇴골의 조직학적 분석

4% paraformaldehyde를 이용하여 고정하고, 10% EDTA로 탈회한 후 건조과정을 거치고, 파라핀으로 포매하여 5μm두께로 절단하여 Hematoxylin and eosin(H&E)으로 염색하였으며, TRAP 염색은 225μM Naphthol AS-MX phosphate(Sigma-Aldrich), 0.84% N,N-dimethylformamide(Sigma-Aldrich), 1.33mM Fast Red Violet LB Salt(Sigma-Aldrich), 50mM sodium acetate, 1% methyl green을 사용하였다.

조직학적인 분석을 통해서 대퇴골 및 경골에 대하여 뼈의 소주골의 숫자, 간격, 두께 그리고 뼈를 파괴하는 파골세포의 발현 등을 확인한 결과, 성장판 부분에 세포들이 많이 밀집되어 있는 것을 확인하였고, 소주골의 경우, SHAM군보다 OVX군에서 숫자와 두께 등이 감소되는 경향을 보이고, 소주골의 간격이 증가된 것을 볼 수 있다. 하지만 헛개나무 가지 추출물의 투여군에서 소주골의 숫자가 증가된 것을 확인하였다(도 10).

TRAP 염색을 실시하여 활성화된 파골세포(뼈파괴세포)를 확인하였다. OVX군에서 TRAP이 더 많이 발현되었으며. 헛개나무 가지 추출물 투여군에서 감소되는 경향을 보였다(도 10).

Masson's trichrome 염색법에 따르면 세포의 핵은 검정색, 근육조직은 붉은색, 콜라겐은 파란색으로 염색이 되는데, 뼈조직의 경우 콜라겐이 약 90%이상을 차지하므로 뼈조직이 파란색으로 염색이 된 것을 확인할 수 있다. 헛개나무 가지 추출물 투여군이 OVX군에 비하여 파란색 부분이 더 많은 것으로 보아, 뼈조직이 증가하였음을 시사한다(도 10).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 헛개나무(Hovenia dulcis) 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증(osteoporosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 헛개나무 가지 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인, 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 골다공증의 예방 또는 치료는 파골세포의 분화를 억제하는 것에 의한 것인, 약학적 조성물.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 헛개나무(Hovenia dulcis) 가지 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증(osteoporosis)의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 헛개나무 가지 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인, 건강기능식품 조성물.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 골다공증(osteoporosis)의 예방 또는 치료는 파골세포의 분화를 억제하는 것에 의한 것인, 건강기능식품 조성물.
   
9. 삭제
10. 삭제

Images