KR101848655B1 - 골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 골다공증 예방 및 개선용 조성물, 이를 포함하는 의약품 및 건강기능식품에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로 설명하면, 천연재료인 돼지감자로부터 추출한 돼지감자 추출물의 파골세포 활성 억제를 통한 골다공증 예방 및/또는 개선용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 의약품 및 건강기능식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돼지감자 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로서, 상기 조성물은 파골 세포의 분화를 억제하는 효과, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 골의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합 효과를 나타내며, 골다공증 예방 및/또는 개선, 나아가 치료에 유용한 의약품 및 건강식품으로 널리 이용될 수 있는 발명에 관한 것이다.
골(bone)은 근육과 연합되어 있는 석회화된 결체조직으로서, 표면은 두껍고 단단한 석회화 조직으로 신체균형을 이루는 지주역할을 하며, 장기를 보호한다. 골의 안쪽은 골수조직으로 칼슘대사의 중심이 되는 부위이다. 골은 콜라겐(collagen), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin) 등 유기질(organic substance)과 칼슘, 인, 불소 등의 무기질(inorganic substance) 및 수분으로 구성되어 있다. 생체에서는 항상 골형성(bone formation)과 골흡수(bone resorption)가 일어나고 있다. 골형성은 소량의 부갑상선 호르몬이나 안드로겐, 에스트로겐, 불소, 인 등에 의하여 촉진되며, 골흡수는 물리적 감압, 무중력상태, 다량의 부갑상선 호르몬, 부신피질 스테로이드 등에 의하여 촉진된다. 따라서 골대사에는 이들 사이의 균형(balance)이 중요하다.
골다공증(osteoporosis)은 골흡수와 골형성의 균형이 무너져 발생하는 것으로 골형성보다 과다하게 골흡수가 진행되는데 기인한 질환으로, 골다공증은 골 조직의 석회가 감소되어 골의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지고, 증세가 진전됨에 따라 골이 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골조직은 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다.
골의 항상성은 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다.
그러나, 파골 세포의 지나친 활성이나 조골세포 활성의 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여, 골다공증(osteoporosis)과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골 세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골 세포의 활성을 억제하고 조골세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근 방법으로 인지되고 있다.
파골세포는 조혈모세포의 단핵구로부터 유래되는 세포로서, 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kB(Rank) ligand)에 의해 융합하여 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다(참조: Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003 May 15;423(6937):337-42). 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-kB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수할 수 있다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MAPK, 또는 NF-kB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다 (참조: Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30;305(2):211-4.). 특히, 파골세포의 생존 및 골 흡수 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달 분자로 밝혀진 ERK와 NF-kB에 의해 파골세포 분화에 특이적인 AP-1 또는 NFAT가 조절될 수 있다고 보고되어 있다. 따라서, RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.
골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다.
한편, 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14 ~ 18세에 가장 높고 노후에는 1 년에 약 1%씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.
이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다.
세계보건기구(World Health Organization, WHO)에 의하면 골다공증(osteoporosis)은 전신 골격계 질환으로서 골량 감소와 미세구조 이상 등의 특징을 가지며, 골질량과 골밀도가 낮아져 골절 위험이 높아지는 질환이다. 또한, 골은 일생 동안 변하는 장기로 1년마다 10% 정도 교체되고, 10년 후 인체의 모든 뼈는 새로운 뼈로 교체된다. 골밀도는 20대에서 30대까지 가장 높으며 그 이후로는 서서히 감소하여 여성의 경우 폐경 첫 5년간 급격하게 약해진다.
조혈모세포에서 생기는 파골세포 (osteoclast)에 의해 오래된 골 파괴 또는 흡수(resorption)가 이루어지며 이는 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다. 한편, 중간엽줄기 세포에서 생성된 조골세포 (osteoblast)는 새로운 골 형성을 이루어 골격을 재건하게 된다. 이러한 골 세포의 균형은 호르몬이나 화학요소 혼합물에 의해서 조절된다. 부갑상선 호르몬과 비타민 D는 골의 흡수를 자극하고 에스트로겐, 칼시토닌은 새로운 골을 형성하는 조골세포를 자극한다. 이들 조골의 속도와 파골의 속도가 동일해야 골의 항상성이 유지되는데 파골속도가 빨라지게 되면 골이 약해지게 되어 골절이 쉽게 일어나게 되는 것이다.
파골세포를 활성화시키는 중요한 씨토카인은 RANKL(Receptor activator of nuclear fractor-kB ligand)로서 조골세포 또는 활성화된 면역세포에서 생성된다. 생성된 RANKL은 파골세포 및 전구세포에 위치한 수용체(RANK)와 결합하여 파골세포의 형성과 활성을 촉진시킨다. 또한, RANKL에 대한 생체 내 길항제인 Osteoprotegerin (OPG)가 존재하고 있다. 결국, RANKL과 OPG의 균형에 의하여 파골세포의 형성과 활성이 조절되는 것이다. 그러나, 골 흡수를 자극하는 원인(에스트로겐 결핍, 부갑상선 호르몬 항진증 등)이 발생하게 되면 OPG와 RANKL의 균형이 깨지게 되어 파골세포가 활성화되어 골 흡수가 촉진되는 것이다. 활성화된 파골세포는 골 표면에 부착하여 강한 골 용해물질을 분비한다. 골 단백 용해제 중 하나인 카텝신(cathepsin) K가 파골세포 특이적으로 생성 분비되며, 풍부한 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor, Cal-R)와 TRAP이 존재하며 실제적으로 골 흡수 작용을 하는 산 생성이 활발하고, acting ring을 형성하여 골 기질을 흡수한다고 알려졌다. 따라서 이들의 억제를 통하여 골 흡수 억제 효과를 이끌어낼 수 있을 것이다. 골 흡수를 억제하기 위해 파골전구세포에서 파골세포로의 분화를 차단하는 분화 과정의 초기단계 저해와 분화된 파골세포의 사멸을 유도하여 골 흡수 과정을 저해하는 연구가 진행되고 있다. 골 흡수 억제제로는 칼슘, 비타민 D, 칼시토닌, 여성호르몬, 티볼론, 선택적 에스트로겐 수용체조절제 (selective estrogen receptor modulator, SERM), 비스포스포네이트 등이 이용되고 있다. 그러나 이들 치료법들은 비전형적 골절, 체중증가, 위장장애, 자궁내막암과 유방암 발병 및 하악골 괴사 등 일부 부작용이 보고되고 있다.
최근에는 골다공증과 산화스트레스와 연관성에 대한 연구가 진행되어 산화스트레스 증가와 골밀도 간에는 유의한 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 골다공증 여성의 경우 혈중 항산화제의 농도가 감소되고, 항산화 비타민 섭취로 인하여 골밀도를 증가시켰다고 보고하였다. 따라서 항산화 성분을 가진 유효 약용식물의 안전한 천연물 소재를 이용하여 골 손실의 최소화시켜 골밀도 증가를 통한 골다공증 예방 또는 치료 물질 발굴이 절실하게 요구된다.
본 발명의 목적은 부작용을 최소화시키면서 파골세포 활성의 억제를 통하여 골다공증 예방 및/또는 개선 효과를 극대화시킬 수 있도록 추출한 돼지감자 추출물, 이를 이용한 골다공증 예방 및 개선용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선제, 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 돼지감자 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 돼지감자 추출물은 돼지감자를 비열처리하여 추출한 비열처리 추출물이거나 또는 열처리하여 추출한 열처리 추출물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 추출물은 물 및 에탄올 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매를 사용하여 추출한 돼지감자 추출물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 돼지감자는 흰색 돼지감자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 골다공증 예방 및 개선용 조성물은 상기 돼지감자 추출물을 200 ~ 3,000 ㎍/㎖로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 비열처리 추출물은 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 주석산염 저항산성 인산분해효소(TRAP 효소) 활성이 52% ~ 65%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 비열처리 추출물은 500 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 60.0% ~ 87.0%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 비열처리 추출물은 물을 추출용매로 추출한 경우, 500 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 62.0% ~ 69.0%이고, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 52% ~ 58%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 열처리 추출물은 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 주석산염 저항산성 인산분해효소(TRAP 효소) 활성이 35% ~ 53%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 열처리 추출물은 500 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 50.0% ~ 60.0%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 열처리 추출물은 물을 추출용매로 추출한 경우, 500 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 52% ~ 58%이고, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 35% ~ 42%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 조성물이 비열처리 추출물을 포함하는 경우, 마우스 대식 세포주 RAW246.7 세포를 이용하여 RANKL(Receptor activator of nuclear fractor-kB ligand)에 의해 유도된 파골세포 생존율 측정시, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 92.0% ~ 102%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 조성물이 열처리 추출물을 포함하는 경우, 마우스 대식 세포주 RAW246.7 세포를 이용하여 RANKL(Receptor activator of nuclear fractor-kB ligand)에 의해 유도된 파골세포 생존율 측정시, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 86% ~ 97%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 열처리 추출물은 물을 추출용매로 추출한 경우, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 90% ~ 97%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 돼지감자 추출물은 비열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 함량이 60 ~ 350 mg GAE(gallic acid equivalent)이고, 총 플라보노이드 함량이 300 ~ 500 mg이며, 아스코르브산 함량이 50 ~ 150 mg일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 돼지감자 추출물은 열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 함량이 110 ~ 500 mg GAE(gallic acid equivalent)이고, 총 플라보노이드 함량이 430 ~ 600 mg이며, 아스코르브산 함량이 90 ~ 250 mg일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 열처리 추출물이 물을 추출용매로 추출한 경우, 열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 함량이 350 ~ 500 mg GAE(gallic acid equivalent)이고, 총 플라보노이드 함량이 500 ~ 600 mg이며, 아스코르브산 함량이 130 ~ 250 mg일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 열처리 추출물이 에탄올을 추출용매로 추출한 경우, 열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 함량이 110 ~ 200 mg GAE(gallic acid equivalent)이고, 총 플라보노이드 함량이 430 ~ 500 mg이며, 아스코르브산 함량이 90 ~ 130 mg일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 앞서 설명한 다양한 형태의 돼지감자 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 약제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 앞서 설명한 다양한 형태의 돼지감자 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명의 돼지감자 추출물을 포함하는 조성물은 총 페놀, 총 플라보노이드 및 아스코르브산을 높은 함량으로 포함하므로 항산화 효과가 우수할 뿐만 아니라지만, 부작용이 적으면서도 파골세포의 활성의 억제를 통한 골다공증 예방 및/또는 개선용 조성물, 이를 이용한 약제, 건강기능식품을 제공할 수 있다.
도 1은 실험예 2에서 실시한 DPPH 라디칼 소거능 평가 결과 그래프이다.
도 2는 실험예 2에서 실시한 ABTS 라디칼 소거능 평가 결과 그래프이다.
도 3은 실험예 3에서 실시한 환원력 평가 결과 그래프이다.
도 4 및 도 5는 실험예 4에서 실시한 TRAP활성 평가 그래프이다.
도 6은 실험예5에서 측정한 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 돼지감자 처리에 따른 TRAP 염색에 따른 광학현미경 이미지 측정 사진이다.
도 2는 실험예 2에서 실시한 ABTS 라디칼 소거능 평가 결과 그래프이다.
도 3은 실험예 3에서 실시한 환원력 평가 결과 그래프이다.
도 4 및 도 5는 실험예 4에서 실시한 TRAP활성 평가 그래프이다.
도 6은 실험예5에서 측정한 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 돼지감자 처리에 따른 TRAP 염색에 따른 광학현미경 이미지 측정 사진이다.
이하에서는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명을 한다.
돼지감자(Helianthus tuberosus L.)는 국화과 해바라기 속의 쌍떡잎 다년생 식물로 일명 돼지감자 혹은 뚱딴지로 불리며 다이어트에 좋고, 특히 성인병예방에 효과적인 것으로 알려지면서 최근 들어 주목 받고 있는 작물로 북아메리카 가 원산지이며, 우리나라의 기후조건에 맞아 전국 각지에 자생하고 있다. 돼지감자의 주된 성분은 프룩토오스(fructose) 중합체인 이눌린으로 이는 괴경 건물중량의 약 75%를 차지한다(Kim et al., 1993). 이눌린의 효능으로 변비개선, 장 질환예방, 혈청 콜레스테롤 감소, 혈중지질저하 및 혈당강하 등의 효능이 있는 것으로 보고 되었다(Carabin and Flamm. 1999).
따라서, 본 연구는 돼지감자 추출물의 항산화 활성과 in vitro 상 파골세포의 분화에 미치는 영향을 평가하여 골 질환 조절에 응용하기 위한 기초 연구 자료와 골다공증 예방, 개선 및 치료제로서의 가능성을 제시하고자 수행하였다.
본 발명의 골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물은 돼지감자를 비열처리 또는 열처리하여 추출한 비열처리추출물 또는 열처리추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 돼지감자는 일반적인 돼지감자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 흰색 돼지감자일 수 있다.
상기 돼지감자의 비열처리 추출물을 제조하는 방법을 설명하면 다음과 같다.
돼지감자를 직사광선을 피하여 그늘진 곳에서 2주 동안 자연건조하여 건조 시료를 준비하는 1단계; 상기 건조 시료를 분쇄한 분쇄물 및 추출용매를 혼합하여 혼합물을 제조하는 2단계; 상기 혼합물을 환류시켜서 추출물을 추출하는 3단계; 상기 추출물을 15℃ ~ 30℃로 냉각시킨 후, 여과하여 여과물을 얻는 4단계; 및 상기 여과물을 감압농축시킨 감압농축물을 제조하는 5단계;를 포함하는 공정을 수행하여 돼지감자 열처리 추출물을 제조할 수 있다.
또한, 상기 열처리 추출물을 제조하는 방법은 5단계 이후에 감압농축물을 동결 건조시키는 6단계;를 더 수행할 수도 있다.
또한, 상기 돼지감자의 열처리 추출물을 제조하는 방법을 설명하면, 자연건조된 돼지감자 시료를 95℃ ~ 120℃, 바람직하게는 95℃ ~ 105℃에서 10분 ~ 30분간 가온처리하여 준비하는 1단계; 상기 시료를 분쇄한 분쇄물 및 추출용매를 혼합하여 혼합물을 제조하는 2단계; 상기 혼합물을 환류시켜서 추출물을 추출하는 3단계; 상기 추출물을 15℃ ~ 30℃로 냉각시킨 후, 여과하여 여과물을 얻는 4단계; 및 상기 여과물을 감압농축시킨 감압농축물을 제조하는 5단계;를 포함하는 공정을 수행하여 돼지감자 열처리 추출물을 제조할 수 있다.
또한, 상기 열처리 추출물을 제조하는 방법은 5단계 이후에 감압농축물을 동결 건조시키는 6단계;를 더 수행할 수도 있다.
상기 비열처리 추출물 및 열처리 추출물을 제조하는 방법에 있어서, 2단계에서 상기 추출용매는 물 및 에탄올 중에서 선택된 1종 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 에탄올 수용액을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물을 추출용매로 사용할 수 있다. 그리고, 추출용매로서 에탄올 수용액은 에탄올 농도가 60% ~ 80%이 되도록 에탄올 수용액을 제조하여 사용하는 것이 추출 효과 면에서 유리하다.
그리고 2단계는 상기 분쇄물 및 추출용매를 1 : 2 ~ 4.5 부피비로, 바람직하게는 1 : 2.5 ~ 4.0 부피비로, 더욱 바람직하게는 1 : 2.8 ~ 3.5 부피비로 혼합하여 혼합물을 제조할 수 있고, 상기 추출용매가 2 부피비 미만이면 분쇄물과 추출용매의 혼합이 불완전하게 되어 유효성분의 추출이 충분하지 않을 수 있고, 4.5 부피비를 초과하면 일정 온도를 유지하며 추출을 하는 방법에 문제가 있을 수 있다.
상기 비열처리 추출물 및 열처리 추출물을 제조하는 방법에 있어서, 3단계의 환류는 80℃ ~ 95℃ 하에서, 바람직하게는 82℃ ~ 88℃ 하에서, 2.5 ~ 3.5시간씩 3번 ~ 5번 수행할 수 있다.
상기 비열처리 추출물 및 열처리 추출물을 제조하는 방법에 있어서, 5단계의 감압농축은 40℃ ~ 60℃ 하에서, 바람직하게는 40℃ ~ 50℃ 하에서 수행하는 것이 좋은데, 40℃ 미만에서 감압농축을 수행하면 농축의 시간이 장시간이 될 수 있는 문제가 있을 수 있고, 60℃를 초과하면 유효 성분의 변성이 있을 수 있는 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 조성물은 이러한 방법으로 제조한 돼지감자의 비열처리 추출물 및 열처리 추출물을 200 ~ 3,000 ㎍/㎖의 농도로, 바람직하게는 500 ~ 2,000 ㎍/㎖의 농도로, 더욱 바람직하게는 500 ~ 1,500 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 이때, 추출물의 농도가 200 ㎍/㎖ 미만이면 파골세포효소 활성 저하 효과가 미비하여 골다공증 효과를 볼 수 없을 수 있고, 3,000 ㎍/㎖의 농도를 초과하면 독성에 의한 세포 생존율을 저하시키는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내의 농도로 추출물을 포함하는 것이 좋다.
본 발명의 조성물이 상기 돼지감자 비열처리 추출물을 포함하는 경우, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 주석산염 저항산성 인산분해효소(TRAP 효소) 활성이 52% ~ 65%, 바람직하게는 52% ~ 58%일 수 있다. 그리고, 비열처리 추출물 농도가 500 ㎍/㎖일 때에는 TRAP 효소 활성이 60% ~ 87%, 바람직하게는 60% ~ 70%일 수 있다.
그리고, 상기 비열처리 추출물은 물을 추출용매로 추출한 경우, 500 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 60% ~ 70%이고, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 52% ~ 58%일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 상기 돼지감자 비열처리 추출물을 포함하는 경우, 마우스 대식 세포주 RAW246.7세포를 이용하여 RANKL(Receptor activator of nuclear fractor-kB ligand)에 의해 유도된 파골세포 생존율 측정시, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 92.0% ~ 102%일 수 있으며, 500㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 98% ~ 107%일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 상기 돼지감자 비열처리 추출물을 포함하는 경우, 비열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 60 ~ 350 mg GAE(gallic acid equivalent), 총 플라보노이드 300 ~ 500 mg 및 아스코르브산 50 ~ 150 mg을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 상기 돼지감자 열처리 추출물을 포함하는 경우, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 주석산염 저항산성 인산분해효소(TRAP 효소) 활성이 35% ~ 53%, 바람직하게는 35% ~ 42%일 수 있으며, 열처리 추출물이 500 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 50% ~ 60%, 바람직하게는 52% ~ 58%일 수 있다.
그리고, 상기 열처리 추출물은 물을 추출용매로 추출한 경우, 500 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 52% ~ 58%이고, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 35% ~ 42%일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 상기 돼지감자 열처리 추출물을 포함하는 경우, 마우스 대식 세포주 RAW246.7세포를 이용하여 RANKL에 의해 유도된 파골세포 생존율 측정시, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 86% ~ 97%일 수 있으며, 500㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 100% ~ 106%일 수 있다. 그리고, 열처리 추출물은 물을 추출용매로 추출한 경우, 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 90% ~ 97%일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 상기 돼지감자 열처리 추출물을 포함하는 경우, 열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 110 ~ 500 mg GAE (gallic acid equivalent), 총 플라보노이드 430 ~ 600 mg 및 90 ~ 250 mg을 포함할 수 있다.
좀 더 구체적으로는 상기 열처리 추출물이 물을 추출용매로 추출한 경우, 열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 함량 350 ~ 500 mg GAE, 총 플라보노이드 500 ~ 600 mg및 아스코르브산 130 ~ 250 mg을 포함할 수 있다. 그리고, 상기 열처리 추출물이 에탄올 수용액을 추출용매로 추출한 경우, 열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 함량이 110 ~ 200 mg GAE, 총 플라보노이드 430 ~ 500 mg 및 아스코르브산 90 ~ 130 mg을 포함할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 조성물은 총 페놀, 총 플라보노이드 및 아스코르빈산을 고함량으로 포함하는 바, 항산화 효과가 우수하면서도 TRAP 효소의 활성 즉, 파골세포 분화 활성 억제를 통한 골다공증 예방, 개선 효과가 우수하다.
이러한, 본 발명의 조성물을 이용하여 다양한 형태의 약제 및/또는 건강기능식품 제조가 가능하다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 자세하게 설명을 하겠다. 그러나, 본 발명의 권리범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이다.
[
실시예
]
준비예
: 돼지감자 시료 준비
충청남도 금산군일대에 식재된 자생 흰색 돼지감자를 2014년 11월에 채취하였으며, 절단한 후 직사광선을 피하여 그늘진 곳에서 2주 동안 자연 건조시켜서 돼지감자 시료를 준비하였다.
실시예
1 : 돼지감자 비열처리 추출물 제조
준비예에서 제조한 흰색 돼지감자 시료를 초음파 세척기(Branson, MO, USA)를 이용하여 불순물을 제거하였다.
다음으로 선별된 흰색 돼지감자 시료를 분쇄하여 추출용매로서 물을 돼지감자 시료의 3배 부피로 첨가하였다.
다음으로, 이를 85℃에서 3시간씩 3번 환류 추출한 후 실온(24℃ ~ 25℃)에서 냉각한 뒤 필터페이퍼(Filter paper, No. 4)를 이용하여 여과하고, 회전 감압농축기(Rotavapor RII, Buchi, Switzerland)로 45℃에서 감압농축한 후 추출물을 동결 건조하여 분말 형태로 초저온 냉동고에 보관하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 돼지감자 비열처리 열수 추출물(HT-D)로 한다.
실시예
2
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 돼지감자 비열처리 추출물을 제조하되, 추출용매로서, 물 대신 70% 농도의 에탄올 수용액을 사용하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 돼지감자 비열처리 에탄올 추출물(HT-E)로 한다.
실시예
3: 돼지감자 열처리 추출물 제조
준비예에서 제조한 건조된 흰색 돼지감자 시료를 100℃에서 20분간 가온처리한 후, 초음파 세척기(Branson, MO, USA)를 이용하여 불순물을 제거하였다.
다음으로 선별된 흰색 돼지감자 시료를 분쇄하여 추출용매로서 물을 돼지감자 시료의 3배 부피로 첨가하였다.
다음으로, 이를 85℃에서 3시간씩 3번 환류 추출한 후 실온(24℃ ~ 25℃)에서 냉각한 뒤 필터페이퍼(Filter paper, No. 4)를 이용하여 여과하고, 회전 감압농축기(Rotavapor RII, Buchi, Switzerland)로 45℃에서 감압농축한 후 추출물을 동결 건조하여 분말 형태로 초저온 냉동고에 보관하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 돼지감자 열처리 열수 추출물(HT-hD)로 한다.
실시예
4
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 돼지감자 열처리 추출물을 제조하되, 추출용매로서 물 대신 70% 에탄올 수용액을 사용하였다. 이상의 방법으로 추출한 시료를 돼지감자 열처리 에탄올 추출물(HT-hE)로 한다.
하기 실험예 1 ~ 5의 모든 실험군은 3개 이상 수행하였으며 정량적 결과는 GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 대조군에 대한 백분율로 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 모든 실험은 3번 이상 반복하여 동일한 실험결과로 사용하였다. 그리고, one-way analysis of variance (ANOVA), Dunnett's multiple comparison Test로 통계적 유의성을 분석하여 p<0.05 이하를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예
1 : 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 아스코르빈산 함량 측정
실시예 1, 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4의 냉동고에 보관된 비열처리 추출물 및 열처리 추출물의 건조물 각각 100 g에 함유된 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 아스코르빈산의 함량을 각각 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
이때, 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량 측정을 위한 폴리-시오칼토 시약(Folin-Ciocalteau reagent), 갈산(gallic acid), 아질산 나트륨(sodium nitrite), 카테킨(catechin), 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid), 아스코르빈산(ascorbic acid), Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 구입한 것을 사용하였다.
그리고, 총 폴리페놀은 갈산으로 정량하여 추출물 건조 함량 당 100g 기준으로 측정하였고, 총 플라보노이드 함량은 카테킨으로 정량하여 추출물 건조 함량 당 100g 기준으로 측정하였으며, 아스크로빈산 함량은 아스코르빈산으로 정량하여 추출물 건조 함량 당 100g 기준으로 측정하였다. 측정값은 mg 단위로 표기하였다.
| 구분 | 총 페놀 함량 (mg GAE1 )/100 g of dry mass) |
총 플라보노이드 함량 (mg CE2)/100 g of dry mass) |
아스코르빈산 함량 (mg/100 g of dry mass) |
수율 (%) |
| 실시예 1 (HT-D) |
297.96±3.05 | 460.89±1.82 | 129.28±6.31 | 59.91 |
| 실시예 2 (HT-E) |
65.80±0.94 | 343.58±7.34 | 53.46±0.84 | 27.7 |
| 실시예 3 (HT-hD) |
448.58±4.96 | 524.13±16.17 | 172.94±3.53 | 67.06 |
| 실시예 4 (HT-hE) |
139.01±1.18 | 472.52±15.95 | 108.83±1.22 | 40.02 |
| 1) GAE(gallic acid equivalent), 2) CE(catechin reagent) | ||||
상기 표 1의 측정 결과를 살펴보면, 실시예 1 및 실시예 3, 실시예 2 및 실시예 4를 각각 서로 비교해 보면, 비열처리 추출물 보다 열처리 추출물이 총 페놀, 총 플라보노이드 및 아스크로빈산 함량이 상대적으로 높은 결과를 보였다.
또한, 에탄올 수용액 보다 물을 추출용매로 사용한 추출물 내 총 페놀, 총 플라보노이드 및 아스크로빈산 함량이 상대적으로 높고, 수율이 높은 결과를 보였다.
실험예
2 :
DPPH
라디칼
소거능
및
ABTS
라디칼
소거능
평가
하기와 같은 방법으로 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 및 ABTS(2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) 라디칼 소거능을 평가하였고, 그 결과를 도 1 및 도 2에 각각 나타내었다.
(1)
DPPH
라디칼
소거능
평가 방법
DPPH는 비교적 안정한 자유 라디칼로서, 항산화 물질과 반응하면 산화성 자유 라디칼이 억제되어 안정한 형태로 전환되고 DPPH 라디칼 용액은 짙은 보라색에서 옅은 노란색을 띠게 되는데, 이러한 색 변화에 따라 흡광도를 통해 항산화능을 간접적으로 측정하였다.
좀 더 구체적으로 설명하면, DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 Samad(Samad et al., 2013)의 방법에 따라 실험하였다. 실시예 1 ~ 2 및 실시예 3 ~ 2의 추출물 각각을 증류수 1㎖로 희석하여, 하기 표 1과 같은 농도를 갖는 조성물을 제조하고, 표준(standard)용액으로 사용되는 BHT와 아스코르빈산(Ascorbic acid, 대조군)는 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ㎎/㎖ 농도로 각각 1㎖씩 제조하였다. 각각의 샘플 및 표준용액 80㎕에 DPPH(0.2 mM in methanol, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 용액 80㎕를 첨가한 후, 암실에서 30분간 반응시켰다.
다음으로 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용해 700㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 흡광도 측정 시 각 시료에 대한 흡광도 값과 용매에 대한 흡광도 값을 보정해 주었고, 이때 전자공여능은 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었으며, DPPH 라디칼 소거능 50%를 나타내는 농도 값인 IC50(Inhibition concentration)값으로 표시하였다(수학식 1 참조).
[수학식 1]
DPPH 라디칼 소거능(%) = {(대조군 흡광도 - 추출물 조성물 흡광도) / 대조군 흡광도} × 100
(2)
ABTS
라디칼
소거능
평가 방법
ABTS는 산화 유도제인 과황화칼륨(potassium persulfate)와 반응하여 청록색의 ABTS 양이온을 형성하고 항산화 물질의 전자공여능으로 인한 탈색반응을 하게 되며, 이러한 색 변화에 따라 흡광도를 통해 항산화능을 간접적으로 측정하였으며, 좀 더 구체적으로 설명하면, ABTS 라디칼 소거능은 Re 등의 방법(Re et al., 1999)을 변형하여 측정하였다.
7 mM ABTS 수용액(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 2.45 mM 과황화칼륨(potassium persulphate, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 혼합한 후, 안정화를 위해 암실 상태에서 실온에 12~16시간 반응시켜서 ABTS+ 용액을 제조하였다. 이 라디칼 형태는 실온에서 2일 정도만 안정한 상태를 유지한다.
상기 ABTS+ 용액을 0.01 M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 734㎚에서 흡광도 값이 0.70(± 0.02)이 되도록 희석하였다.
그리고, 실시예 1 ~ 2 및 실시예 3 ~ 2의 추출물 각각을 표준용액인 아스코르빈산(ascorbic acid)에 하기 표 1의 농도를 갖도록 0.25, 0.5, 1, 2, 4 ㎎/㎖로 용해한 용액 200㎕에 ABTS+용액 800㎕를 혼합한 후, 5분간 실온에서 정치한 후, 734㎚에서 흡광도를 측정하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 하기 수학식 2에 의거하여 구하였다.
[수학식 2]
ABTS 라디칼 소거능(%) = {(대조군 흡광도 - 추출물 조성물 흡광도) / 대조군 흡광도 } × 100
이때, DPPH, ABTS 및 과황화칼륨은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 구입한 것을 사용하였다.
| 구분 | 조성물의 농도 (단위: ㎍/㎖) |
|||
| 비열처리 + 물 | 비열처리 + 에탄올 수용액 |
열처리+ 물 | 열처리 + 에탄올 수용액 |
- |
| 실시예 1-1 | 실시예 2-1 | 실시예 3-1 | 실시예 4-1 | 0.25 |
| 실시예 1-2 | 실시예 2-2 | 실시예 3-2 | 실시예 4-2 | 0.5 |
| 실시예 1-3 | 실시예 2-3 | 실시예 3-3 | 실시예 4-3 | 1 |
| 실시예 1-4 | 실시예 2-4 | 실시예 3-4 | 실시예 4-4 | 2 |
| 실시예 1-5 | 실시예 2-5 | 실시예 3-5 | 실시예 4-5 | 4 |
도 1의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과를 살펴보면, 모든 실험군에서 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거능을 보였다.
그리고, 2㎍/㎖ 이하 농도에서는 비열처리 에탄올 수용액 추출물(실시예 2-1~실시예 2-4)이 DPPH 라디칼에 대한 높은 전자공여능을 보였고, 농도 증가에 따라서 최종적으로 열처리 추출물(실시예 3-5, 2-5)이 비열처리 추출물(실시예 1-5, 실시예 2-5) 보다 상대적으로 높게 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 2의 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과를 살펴보면, DPPH라디칼 소거능 측정과 마찬가지로 ABTS 라디칼 소거능 또한 농도 의존적인 소거능을 보였다.
1㎍/㎖ 이하의 농도에서는 물 추출물(실시예 1-1 ~ 1-3 및 실시예 3-1 ~ 1-3) 보다 에탄올 수용액 추출물(실시예 2-1 ~ 2-3 및 실시예 4-1 ~ 2-3)이 상대적으로 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보였으나, 2㎍/㎖ 이상의 농도부터는 모든 처리군에서 높은 ABTS 라디칼 소거능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예
3 : 금속이온 환원력 평가
Chung(Chung and Lee, 2003)의 방법을 변형하여 실험하였다. 0.2 M 인산나트륨 버퍼용액(sodium phosphate buffer, pH 6.6) 2.5 ml와 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide, 10 mg/mL) 2.5㎖를 상기 표 1과 같은 농도로 제조한 각각의 샘플과 표준용액인 BHT각각을 아스코르빈산 2.5㎖와 대조군 2.5㎖에 각각 혼합시킨 후 50에서 20분 동안 정치하였다.
반응이 끝난 혼합물을 각각 5㎖씩 새 튜브(tube)로 옮긴 뒤 TCA (trichloroacetic acid, 100 mg/mL) 용액 2.5㎖를 첨가하여 원심분리기(centrifuge) 에서 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다.
다음으로 분리한 상층액 5㎖에 증류수 5㎖와 FeCl3(0.1% w/v) 1㎖를 첨가한 후, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)로 700㎚에서 흡광도를 측정하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
이때, 모든 실험군은 3개 이상 수행하였으며 정량적 결과는 GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 대조군에 대한 백분율로 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 모든 실험은 3번 이상 반복하여 동일한 실험결과로 사용하였다. 그리고, one-way analysis of variance (ANOVA), Dunnett's multiple comparison Test로 통계적 유의성을 분석하여 p<0.05 이하를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 3의 실험결과를 살펴보면, 0.25 ~ 4 mg/ml에서 농도가 증가함에 따라 환원력이 증가하는 경향을 보이나 대조군로 사용된 물질인 아스코르빈산이나 BHT 보다는 낮은 흡광도를 보였다.
실험예
4 : 파골세포 생존율 측정 실험
상기 실시예 1 ~ 2 및 실시예 3 ~ 2의 냉동 건조 추출물 각각을 PBS (Dulbecco's, phosphate buffered saline, Daegu, Korea)에 하기 표 2와 같은 농도로 희석하여 골다공증 예방 및 개선용 조성물을 각각 제조한 후, 하기와 같은 방법으로 파골세포의 생존율을 측정하였다.
(1) 파골세포 배양
파골세포 분화 유도를 위한 마우스 대식 세포주 RAW264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA)로부터 구입하였으며, RAW264.7 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco-BRL사)와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, 100 U/㎖, 100 ㎍/㎖, Gibco-BRL사)이 포함된 DMEM 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Bremen, Germany)에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 5% CO2, 37 배양기(incubator)에서 계대 배양하였다.
(2) 파골세포 생존율 측정
상기 표 2의 농도를 갖는 추출물 각각의 RAW264.7 세포에 대한 생존 및 간접적 독성평가를 위하여 MTT assay를 시행하였다. 96-well plate에 1×104 cells/well 농도로 분주하여 DMEM에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신의 조건으로 24시간 동안 안정화시켰다.
다음으로, 파골세포 분화 유도를 위하여 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 α-MEM에 RANKL(50 ng/㎖, PeproTech EC사, London, England)을 첨가한 뒤, 하기 표 3의 농도를 갖도록 실시예 1 ~ 2 및 실시예 3 ~ 2의 추출물로 제조한 조성물로 배양 처리하였다. 그리고, 각 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 설정하였다.
배양 3일 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)용액 2 ㎎을 첨가하여 5% CO2, 37 배양기에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 생성된 포마잔 결정(formazan crystals)을 DMSO(dimetyl sulfoxide)로 용해하였다.
그리고, 이를 ELISA reader(BIO-RAD 450, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다.
| 구분 | 농도 (㎍/㎖) |
0 | 50 | 100 | 250 | 500 | 1,000 |
| 실시예 1 (HT-D) |
파골세포 생존율(%) |
100 ± 2.94 |
112.81 ± 1.96 |
116.36 ± 0.35 |
106.47 ± 2.26 |
102.6 ± 2.56 |
96.15 ± 3.74 |
| 실시예 2 (HT-E) |
파골세포 생존율(%) |
100 ± 1.91 |
99.87 ± 4.92 |
100.57 ± 0.91 |
107.31 ± 2.92 |
102.34 ± 0.96 |
97.97 ± 1.89 |
| 실시예 3 (HT-hD) |
파골세포 생존율(%) |
100 ±1 0.34 |
106.57 ± 0.46 |
110.70 ± 0.67 |
106.39 ± 0.61 |
103.03 ± 1.48 |
93.06 ± 2.11 |
| 실시예 4 (HT-hE) |
파골세포 생존율(%) |
100 ± 0.88 |
101.84 ± 2.40 |
111.61 ± 1.29 |
103.61 ± 2.45 |
104.87 ± 0.31 |
91.02 ± 3.14 |
상기 표 3 및 도 4의 그래프를 살펴보면, 마우스 대식 세포주 RAW264.7 세포를 이용하여 RANKL에 의해 유도된 파골세포 생존율이 돼지감자의 각 추출물 농도가 증가할 수록, 비열처리 추출물(HT-D, HT-E) 보다 열처리 추출물(HT-hD, HT-hE)의 파골세포의 생존율이 상대적으로 낮은 경향을 보였다.
실험예
5 : TRAP 효소 활성 측정 실험
파골세포 특이 지표인 TRAP 효소의 활성을 측정하기 위하여 TRAP solution assay를 Tintut 등 (2002)의 방법으로 수행하였다. TRAP 효소는 ATP와 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate)가 존재할 때 높은 활성을 가지고, 골 흡수작용시 분비가 증가되기 때문에 그 활성도 측정하여 파골세포 분화정도를 확인하는 데 이용할 수 있다.
하기 표 3의 농도를 갖도록 실시예 1 ~ 2 및 실시예 3 ~ 4의 추출물로 제조한 조성물로 처리한 3일된 세포와 분화제를 PBS로 수세 후 차가운 라이시스 버퍼(cold lysis buffer, 90 mM 구연산염, pH 4.8, 타르타르산나트륨 80 mM 함유한 0.1% Triton X-100)를 80 ㎕씩 분주하여 10분간 처리하고, 20 mM p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate, substrate solution)을 80 ㎕씩 첨가하여 5% CO2, 37 배양기에서 20분간 반응시켰다.
다음으로, 40 ㎕의 0.5 N NaOH로 반응을 중지시킨 다음, ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 4 및 도 4 ~ 도 5에 나타내었다.
| 구분 | 농도 (㎍/㎖) |
0 | 50 | 100 | 250 | 500 | 1,000 |
| 실시예 1 (HT-D) |
TRAP활성(%) | 100 ± 0.50 |
91.18 ± 0.49 |
89.74 ± 2.27 |
73.25 ± 4.86 |
65.73 ± 2.46 |
55.16 ± 1.91 |
| 실시예 2 (HT-E) |
TRAP활성(%) | 100 ± 2.41 |
98.46 ± 0.37 |
98.17 ± 0.90 |
91.08 ± 0.75 |
79.03 ± 2.41 |
59.53 ± 1.72 |
| 실시예 3 (HT-hD) |
TRAP활성(%) | 100 ± 0.86 |
88.27 ± 1.69 |
83.21 ± 1.36 |
73.21 ± 2.04 |
55.23 ± 0.70 |
38.83 ± 1.08 |
| 실시예 4 (HT-hE) |
TRAP활성(%) | 100 ± 4.49 |
96.97 ± 1.62 |
93.30 ± 2.70 |
85.51 ± 1.78 |
68.74 ± 2.76 |
52.67 ± 0.28 |
상기 표 4, 도 4 및 도 5를 살펴보면, 돼지감자의 모든 추출물에서 TRAP 활성도는 농도 의존적으로 대조군에 비하여 현저하게 낮은 활성도를 보이는 경향이 있었다. 세포 치사활성이 없는 1,000 ㎍/㎖ 에서 비열처리 물 추출(HT-D, 55.16%), 비열처리 에탄올 추출(HT-E, 59.53%), 열처리 물 추출(HT-hD, 38.83%), 열처리 에탄올 추출물(HT-hE, 52.67%)로서 열처리 물 추출물의 대조군에 비해 현저하게 감소된 파골세포 분화 활성을 보였다. 특히, 실시예 3의 열처리 물 추출물(HT-hD)의 경우, 실시예 1 ~ 2 및 실시예 4 보다 현저하게 낮은 TRAP 활성을 보여서, 가장 우수한 파골세포활성의 억제능을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실험예
6 : TRAP 염색을 통한
양성파골세포
분화 관찰
RAW264.7 세포로부터 유도 분화된 파골세포에서 시그마 TRAP 염색(tartate resistant acid phosphate, Sigma-Aldrich kit no. 387)을 통하여 성숙 파골세포의 형태를 광학현미경(CKX41, Olympus, Japan)으로 관찰하고, 디지털 영상카메라(DIXI 3000, China)로 이미지를 영상화하여 둥근 모양 형태의 파골세포(round-shaped osteoclast, ROC) 수를 관찰하였다.
실시예 5의 표 3에서 실시한 돼지감자 추출물 1,000 ㎍/㎖ 농도를 갖는 조성물 각각(실시예 1 ~ 4)으로 처리하여 3일간 배양한 후 TRAP 염색을 시행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 살펴보면, 대조군(control)에서 둥근 모양 형태 파골세포(ROC) 즉, 세포가 융합되면서 다핵의 성숙 파골세포가 형성되어 골 표면에 부착하여 골 흡수 작용을 하는 TRAP 양성 다핵형 파골세포가 뚜렷하게 관찰되었다.
그리고, 대조군과 비교할 때, 모든 돼지감자 추출물 처리군에서 현저하게 감소된 ROC와 융합되지 않은 단핵의 전파골세포와 불규칙 모양 형태 파골세포 (irregular shaped osteoclast, IOC)가 풍부하게 관찰되었다.
도 6의 양성파골세포 분화 관찰을 통해서 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화과정 중에 돼지감자 추출물의 농도에 의존적으로 파골세포 분화 억제에 직접적으로 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여, 본 발명이 제시하는 방법으로 추출한 돼지감자 추출물이 파골세포 활성의 억제를 통해서 골다공증 예방 및/또는 개선 효과를 갖을 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이러한 돼지감자 추출물을 이용하여 골다공증 예방 및/또는 개선용 의약품, 건강기능식품을 제공할 수 있음을 확인하였다.
Claims (10)
- 돼지감자 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 돼지감자 추출물은 돼지감자를 비열처리 또는 열처리하여 추출한 비열처리추출물 또는 열처리추출물이며,
파골세포의 활성 억제 및 항산화 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 추출은 물 및 에탄올 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매를 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는
골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 비열처리 추출물이 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 주석산염 저항산성 인산분해효소(TRAP 효소) 활성이 52% ~ 65%이고,
마우스 대식 세포주 RAW246.7세포를 이용하여 RANKL에 의해 유도된 파골세포 생존율 측정시, 상기 비열처리 추출물이 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 92.0% ~ 99.89%인 것을 특징으로 하는
골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 열처리 추출물이 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 35% ~ 53%이고,
마우스 대식 세포주 RAW246.7세포를 이용하여 RANKL에 의해 유도된 파골세포 생존율 측정시, 상기 열처리 추출물이 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 86% ~ 97%인 것을 특징으로 하는
골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 비열처리 추출물은
비열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 함량이 60 ~ 350 mg GAE(gallic acid equivalent)이고, 총 플라보노이드 함량이 300 ~ 500 mg이며, 아스코르브산 함량이 50 ~ 150 mg인 것을 특징으로 하는
골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 열처리 추출물은
열처리 추출물의 건조물 100 mg에 대하여, 총 페놀 함량이 130 ~ 480 mg GAE(gallic acid equivalent)이고, 총 플라보노이드 함량이 450 ~ 600 mg이며, 아스코르브산 함량이 100 ~ 200 mg인 것을 특징으로 하는
골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선제.
- 돼지감자 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 돼지감자 추출물은 돼지감자를 비열처리 또는 열처리하여 추출한 비열처리추출물 또는 열처리추출물이며,
파골세포의 활성 억제 및 항산화 효과를 갖는 것을 특징으로 하는
골다공증 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 제8항에 있어서,
상기 비열처리 추출물이 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 주석산염 저항산성 인산분해효소(TRAP 효소) 활성이 52% ~ 65%이고,
마우스 대식 세포주 RAW246.7 세포를 이용하여 RANKL에 의해 유도된 파골세포 생존율 측정시, 상기 비열처리 추출물이 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 92.0% ~ 99.89%인 것을 특징으로 하는
골다공증 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 제8항에 있어서,
상기 열처리 추출물이 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, TRAP 효소 활성이 35% ~ 53%이고,
마우스 대식 세포주 RAW246.7세포를 이용하여 RANKL에 의해 유도된 파골세포 생존율 측정시, 상기 열처리 추출물이 1,000 ㎍/㎖ 농도일 때, 파골세포 생존율이 86% ~ 97%인 것을 특징으로 하는
골다공증 예방 및 개선용 건강기능식품.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150156932A KR101848655B1 (ko) | 2015-11-09 | 2015-11-09 | 골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150156932A KR101848655B1 (ko) | 2015-11-09 | 2015-11-09 | 골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170054156A KR20170054156A (ko) | 2017-05-17 |
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ID=59048570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150156932A KR101848655B1 (ko) | 2015-11-09 | 2015-11-09 | 골다공증 예방 및 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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-
2015
- 2015-11-09 KR KR1020150156932A patent/KR101848655B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 네이버블로그. 다이어트차에 골다공증 예방까지 놀라운 돼지감자차 효능. 2015.10.06.* |
| 열처리에 의한 돼지감자의 항산화 활성. 한국약용작물학회 2010년도 심포지엄 및 추계학술발표회* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20170054156A (ko) | 2017-05-17 |
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