KR101681466B1 - 청밀 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 청밀 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀 추출물을 유효성분으로 함유하여 페놀 함량, 플라보노이드 함량 및 활성산소 흡수능(ORAC)을 향상시키고; 인간 대장암 세포 및 인간 자궁경부암 세포에 대하여 항증식 활성을 보인다.

Description

청밀 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물 및 건강기능식품{Pharmaceutical compositions and functional food for antioxidizing or anti-cancer comprising extract of immature green wheat}

본 발명은 페놀 함량, 플라보노이드 함량 및 활성산소 흡수능(ORAC)이 향상되고 인간 대장암 세포 및 인간 자궁경부암 세포에 대하여 항증식 활성을 보이는 청밀 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

밀(Triticum aestivum L.)은 인간에 의해 소비되는 주요 곡물 중 하나이며(Van, Maeda, Miyatake & Morita, 2009), UN 식량농업기구(FOA)에 따르면 2012년 현재 전세계적으로 687백만톤 이상 소비되어 전체 곡물 소비량의 약 30%를 차지한다.

상기 밀은 에너지원으로 간주되지만, 식이성 섬유, 비타민 및 생리활성 등을 함유하는 항산화 화합물의 훌륭한 재료이다(Pomerznz, 1972; Cai, Choi, Lee, Park & Baik, 2014).

종래에, 밀에서 페놀 함량 및 항산화 능력을 조사하기 위하여 연구가 진행되었으며(Verma, Hucl & Chibbar, 2008; Okarter, Liu, Sorrells & Liu, 2010; Adom & Liu, 2002), 밀의 항산화 능력이 쌀 또는 귀리보다 높은 것을 밝혔다.

또한, 종래에는 항산화 활성이 높은 51 밀 품종의 밀기울에서 결합 및 총 페놀 함량에 관계를 기술하였다.

상기 밀에서 발견된 식물 화학물질로는 페롤산(ferulic acid), p-쿠마린산(p-coumaric acid), 바닐산(vanillic acid) 및 카페인산(caffeic acid)이 있으며, 이러한 생리활성 물질은 전자 공여성에 의해 활성 산소를 중화시켜 줄이거나 단백질, DNA 및 지질에 대한 산화적 손상을 최소화하는 점에서 항산화 특성을 나타낸다.

세포 또는 세포 구성 요소에 대한 산화적 감소는 산화 스트레스에 의해 발생될 수 있는 암 및 심혈관 질환과 같은 질병을 억제할 수 있다.

한편, 한국에서 밀은 장마철인 6월에 수확하는데, 수확시즌 동안에 자주 내리는 비 때문에 밀의 품질을 쉽게 제어하지 못하여 한국에서 밀의 자급률은 2%이내로 저조하다.

이에, 미성숙 밀을 식품 재료로 사용할 수 있다면, 한국에서 생산되는 밀의 자급율을 향상시킬 수 있다.

따라서, 부작용 없이 식용으로 사용할 수 있으며 밀의 자급율을 높일 수 있도록 품질에 제어를 받지 않는 미성숙된 밀로부터 유효성분을 추출하여 보다 효과적인 항산화 활성 및 항증식 활성을 갖는 약학 조성물 및 건강기능식품이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제1363029호 대한민국 등록특허 제0639833호

본 발명의 목적은 미성숙한 밀의 추출물을 유효성분으로 함유하여 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 밀 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물은 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀의 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

상기 출수기 후 28 내지 36일에 수확한 밀은 90 내지 130 ℃의 스팀으로 20 내지 50초 동안 처리된 밀일 수 있다.

상기 밀 추출물은 출수기 후 28 내지 36일에 수확한 밀을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것일 수 있다.

상기 추출물은 출수기 후 28 내지 36일에 수확한 밀과, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 1 : 8 내지 25의 중량비로 혼합하여 추출하는 것일 수 있다.

상기 혼합용매는 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올일 수 있다.

상기 밀 추출물은 총 페놀 함량이 4.6 내지 5.5 mgGAE/g이며, 총 플라보노이드 함량이 3.0 내지 5.0 mgCE/g이고, 활성산소 흡수능이 53 내지 75 uM TE/g일 수 있다.

상기 밀 추출물은 인간 대장암 세포 및 인간 자궁경부암 세포에서 항암활성을 가질 수 있는데, 상기 인간 대장암 세포로는 HT-29 세포 또는 카코-2 세포를 들 수 있으며, 상기 인간 자궁경부암 세포로는 헬라세포를 들 수 있다.

상기 인간 대장암 세포인 HT-29 세포에서 EC₅₀ 값은 30 내지 80 mg/mL, Caco-2 세포에서 EC₅₀ 값은 90 내지 150 mg/mL이며, 상기 인간 자궁경부암 세포인 HeLa 세포에서 EC₅₀ 값은 20 내지 60 mg/mL일 수 있다.

또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항산화 또는 항암활성용 건강기능식품은 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀의 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 및 바로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀의 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 토코페놀의 함량은 낮지만 페놀 및 폴라보노이드의 함량이 높으므로 우수한 항산화 활성을 가지며; 인간 대장암 세포 및 인간 자궁경부암 세포의 증식을 억제하므로 우수한 항암 활성을 갖는다.

또한, 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀의 추출물을 유효성분으로 함유한 본 발명의 항산화 또는 항암활성 조성물은 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 추출된 추출물의 자유 페놀(FPE), 결합 페놀(BPE) 및 총 페놀(TPE)의 ORAC 값을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 추출된 추출물에 대한 (A) Caco-2 세포, (B) HT-29 세포 및 (C) HeLa 세포의 항증식 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 추출된 추출물에 대한 Caco-2 세포, HT-29 세포 및 HeLa 세포의 항증식 활성의 EC₅₀값을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 및 비교예에 따라 제조된 추출물의 페놀 함량, 플라보노이드 함량, 토코페놀 함량, 항산화 활성 및 항증식 활성이 로딩된 플롯이다.

본 발명은 페놀 함량, 플라보노이드 함량 및 활성산소 흡수능(ORAC)을 향상시키고; 인간 대장암 세포 및 인간 자궁경부암 세포에 대하여 항증식 활성을 보이는 청밀 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

상기 청밀은 일반적으로 출수기(出穗期) 후 45일에 수확하는 성숙된 밀과 달리, 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀, 예컨대 등숙(熟) 전에 수확한 밀로서, 그린 색상을 나타내는 미성숙한 밀이다. 상기 출수기의 출수는 개화하기 전에 이삭이 나온 때를 의미하며, 상기 이삭은 1개라도 나오면 그때부터 출수기 후 1일이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물 및 건강기능식품은 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀(이하, 청밀이라고 함) 추출물을 유효성분으로 포함한다.

상기 청밀 추출물을 제조하기 위해서는 먼저, 정선(도정 전에 가공하는 과정)하여 이물질이 제거된 청밀을 수분함량이 12 내지 15%가 되도록 오븐에서 재정선 후 분말화한다. 상기 청밀의 수분함량이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 분말화하기 어려울 뿐만 아니라 약학 조성물로 이용하기에 효능이 저하될 수 있다.

또한, 상기 청밀은 효소활성을 억제하기 위하여 90 내지 130 ℃의 스팀으로 20 내지 50초 동안 처리될 수 있다.

다음으로, 상기 제조된 청밀 분말(및/또는 스팀처리된 청밀 분말)과 추출용매를 1 : 8 내지 25, 바람직하게는 1 : 10 내지 60의 중량비로 혼합하여 60 내지 90 ℃에서 10 내지 60분씩 2 내지 6회 추출하여 추출물을 제조한다.

상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 혼합용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올로 추출된 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물이 항산화 또는 항암활성이 바람직하게 작용한다.

상기 추출시 청밀 분말(및/또는 스팀처리된 청밀 분말)과, 추출용매의 중량비를 벗어나는 경우에는 추출물에 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀)의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.

상기와 같이 제조된 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물은 추출물 자체로 이용하거나 사용이 편리하도록 분말화하여 이용할 수 있다. 상기 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물을 분말화하는 방법은 추출물을 감압 농축하여 부피를 줄인 후 동결건조기로 동결건조하여 분말화한다.

본 발명의 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물은 총 페놀 함량이 4.6 내지 5.5 mgGAE/g이며, 총 플라보노이드 함량이 3.0 내지 5.0 mgCE/g이고, 활성산수 흡수능이 53 내지 75 uM TE/g인 것으로서, 항산화 활성이 우수하다.

또한, 본 발명의 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물은 인간 대장암 세포 및 인간 자궁경부암 세포에서 우수한 항증식 활성을 보인다. 구체적으로, 인간 대장암 세포로는 HT-29 세포 또는 카코-2 세포(Caco-2 cells)를 들 수 있으며, 상기 인간 대장암 세포 HT-29 세포에서 EC₅₀ 값은 30 내지 80 mg/mL이며 Caco-2 세포에서 EC₅₀ 값은 90 내지 150 mg/mL 이다. 또한, 인간 자궁경부암 세포로는 헬라 세포(HeLa cells)를 들 수 있으며, 상기 자궁경부암 세포에서 EC₅₀ 값은 20 내지 60 mg/mL이다.

본 발명의 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물은 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물을 약학 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 12 중량% 포함한다.

상기 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물은 다양한 경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물을 유효성분으로 함유한 항산화 또는 항암활성을 가지는 약학 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중, 질환의 중증도에 따라 달라지나, 본 발명의 약학 조성물은 환자의 무게 1 kg 당 300 mg 이하, 바람직하게는 100 내지 200 mg을 1일 1-4회 투여하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항암활성용 건강기능식품은 건강기능식품 총 중량을 기준으로 청밀(및/또는 스팀처리된 청밀) 추출물을 0.0001 내지 10 중량%로 함유한다.

상기 건강기능식품은 일상식사에서 부족할 수 있는 영양소를 보충하거나 인체에 유용한 기능성 원료를 보충할 목적으로 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 및 바로 이루어진 군 중에서 선택되어 1회 섭취가 용이하게 제조 및 가동된 것이다.

또한, 상기 건강기능식품은 제형에 따라 포도당, 구연산, 액상 올리고당, 옥수수 시럽(corn syrup), 대두 레시틴, 버터, 식물성 경화류, 탈지우유, 설탕, 마가린, 식염, 전분, 밀가루, 물엿, 맥아당, 중조 및 당 에스테르 등의 통상적으로 사용되는 성분들을 이용하여 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1. 청밀 추출물(IW)

전라북도에서 자란 하드 밀 품종(Triticum aestivum L. cv. Keumkang)으로서, 출수기 후 35일에 수확한 미성숙 밀(청밀)이다(2014년 재배). 상기 청밀을 건조 오븐(HK-D0100F,, Hwaseong-si, Korea)기로 수분함량이 14%가 되도록 건조시킨 후 건조된 알맹이를 분말화하였다. 상기 제조된 분말과 80% 에탄올을 1 : 20의 중량비로 혼합하여 80 ℃에서 추출물을 수득하여 청밀 추출물을 제조하였다.

실시예 2. 스팀처리된 청밀 추출물(SIW)

상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 청밀을 90 ℃의 스팀으로 30초 동안 처리한 것일 이용하여 스팀처리된 청밀 추출물을 얻었다.

비교예 1. 밀 추출물(MW)

상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 출수기 후 45일에 수확한 성숙 밀(일반밀)을 이용하여 밀 추출물을 얻었다.

<시험예>

실험은 비타민 E 함량의 측정을 제외하고 3번 반복하였으며, 비타민 E 함량은 중복 분석하고 모든 데이터는 평균±표준편차로 보고된다.

분산 분석(ANOVA)은 통계분석 시스템 소프트웨어 9.2(SAS Institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 실시예 및 비교예에서 제조된 추출물 사이의 차이를 결정하기 위하여 수행된다. 상기 추출물 간의 차이가 발견된 경우, 시료간 차이를 비교하기 위해 Student Newan-Keul's(SNK)에의해 수행하였다. 피어슨 상관 분석 및 주성분 분석(PCA)은 XLSTAT 통계 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.

시험예 1. 페놀 화합물의 추출

1-1 자유 페놀 화합물의 추출(free phenolic compound, mgGAE/g): 상기 실시예 및 비교예에서 제조된 추출물을 원심분리한 후 상등액을 제거하고 다시 한번 더 추출하여 상득액을 수득하였다. 추출하여 얻은 상등액을 45 ℃에서 감압 농축하여 부피를 줄이고 최종 5 mL가 되도록 산성 메탄올(methanol/HCl, 80:20, v/v)로 재용해(reconstitute)하여 측정하였다.

1-2 결합 페놀 화합물의 추출(bound phenolic compound, mgGAE/g): 상기 자유 페놀 함량에서 추출한 잔류물을 혼합기(SK-600, Lab. Companion, Seoul, Korea)로 상온에서 1시간 동안 혼합하여 6 M 수산화나트륨으로 분해시킨 후 상기 혼합물을 염산으로 중화시키고 지질을 제거하기 위하여 헥산으로 추출한다. 헥산으로 지질을 세척한 후, 혼합물을 30분 동안 85 ℃에서 염산으로 가수분해한 다음 에틸아세테이트로 5번 추출하였다. 에틸 아세테이트 분획물은 45 ℃에서 용매를 감압증류하고 최종 10 ml가 되도록 산성 메탄올(methanol/HCl, 80:20, v/v)로 재용해시켰다.

1-3 총 페놀 함량(total phenolic compound, mgGAE/g): 실시예 및 비교예에서 제조된 자유 및 결합 페놀 화합물 추출물 100 uL를 폴린-시오칼투(Folin-Ciocalteu, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)시약으로 산화시키고, 반응물을 20% 탄산나트륨(Junsei Chemicals, Tokyo, Japan)으로 중화시켰다. 빛을 차단한 후 상온에서 2시간 반응 후, 흡광도는 분광광도계(double beam spectrophotometer U-2900, Hitachi High-Tech, Tokyo, Japan)를 사용하여 765 nm에서 측정되었다. 갈산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)은 스탠다드로 사용되었다. 총 페놀 함량은 자유 및 결합 페놀 함량의 합으로 계산되었다.

구분	실시예 1	실시예 2	비교예 1
자유 페놀 함량(mgGAE/g)	1.44±0.08	1.31±0.01	1.21±0.17
결합 페놀 함량(mgGAE/g)	3.88±0.05	3.38±0.07	3.24±0.01
총 페놀 함량(mgGAE/g)	5.32±0.10	4.69±0.09	4.46±0.16

위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 2에 따라 제조된 추출물은 비교예 1의 추출물에 비하여 자유, 결합 및 총 페놀 함량이 높은 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1의 추출물이 자유, 결합 및 총 페놀 함량이 다른 추출물에 비하여 전부 높은 것을 확인하였다.

또한, 모든 추출물에서 결합 페놀의 함량이 자유 페놀의 함량에 비하여 높았다.

상기 페놀 화합물은 항산화 활성에 기여하는 물질 중 하나이다.

시험예 2. 플라보노이드 화합물의 함량 측정

총 플라보노이드 함량(total flavonoids compound, mgCE/g): 실시예 및 비교예에 따라 제조된 자유 및 결합 페놀 화합물 추출물 250 uL를 1.25 mL 증류수로 희석된 후 5% 아질산 나트륨(Wako Chemical, Richmond, VA, USA) 70 uL을 첨가하여 6분 동안 방치하였다. 또한, 10% 알루미늄 클로라이드(Junsei chemical, Tokyo, Japan) 150 uL을 첨가하고 5분 동안 방치시킨 후 1N 수산화 나트륨 0.5 mL을 첨가하여 혼합하였다. 흡광도는 분광광도계(double beam spectrophotometer U-2900, Hitachi High-Tech, Tokyo, Japan)를 사용하여 510 nm에서 즉시 측정되었다. 스탠다드로 (+)-카테킨 수화물(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 사용되었다. 총 플라보노이드 함량은 자유 및 결합 플라보노이드 함량의 합으로 계산되었다.

구분	실시예 1	실시예 2	비교예 1
자유 플라보노이드 함량(mgCE/g)	0.22±0.01	0.16±0.02	0.18±0.01
결합 플라보노이드 함량(mgCE/g)	4.51±0.04	3.55±0.20	2.16±0.09
총 플라보노이드 함량(mgCE/g)	4.73±0.04	3.70±0.21	2.34±0.09

위 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 2에 따라 제조된 추출물은 비교예 1의 추출물에 비하여 자유, 결합 및 총 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1의 추출물이 자유, 결합 및 총 플라보노이드 함량이 다른 추출물에 비하여 전부 높은 것을 확인하였다.

또한, 모든 추출물에서 결합 플라보노이드의 함량이 자유 플라보노이드의 함량에 비하여 높았다.

상기 시험예 1 및 2에 따라 실시예 1의 추출물이 다른 추출물에 비하여 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인하였다.

시험예 3. 토코페롤 화합물의 함량 측정

실시예 및 비교예에서 제조된 추출물 0.5 g을 바이알에 넣은 후 0.02 M 부틸화 하이드록시 톨루엔(BHT, Supelco, Bellefonete, PA, USA)과 무수 에타놀릭 1M KOH 5 mL을 첨가하여 30분 동안 100 ℃의 가열 블록(TECHE DB-3D, Barloworld Scientific Ltd, London, UK)에 넣어 비누화를 수행하였다. 상기 비누화 후, 바이알을 어두운 곳에 두고 25분 동안 상온에서 냉각시킨 다음 5 mL 포화 연화나트륨 수용액 및 10 mL 석유 에테르(petroleum ether)를 첨가하여 5분 동안 잘 혼합한 후 10분 동안 어두운 곳에 방치하였다. 그 후 상기 석유 에테르를 제거하고, 40 ℃에서 Turbo-vap evaporator®LV(Caliper Life Science, Hopkinton, MA, USA)을 이용하여 농축하고, 농축물은 0.02 M BHT와 메탄올-이소프로판올(1:1 부피비)이 혼합된 용액을 이용하여 최종 30 mL가 되도록 재용해한 다음 아세트산으로 pH 5.85로 조절하였다. 마지막으로, 추출물 용액을 u-HPLC (LaChromUltra L-2000 U series apparatus, Hitachi-High Technologies Corp., Tokyo, Japan)분석하기 위해 작은 바이알에 0.2 um 실린지 필터로 여과하였다.

상기 컬럼은 LaChromUltra C18 (입자크기 2 m, 2 mm id, 50 mm 길이; Hitachi-High Technologies Corp., Tokyo, Japan)이며, 비타민 E는 여기파장 298 nm 및 발광파장 325 nm에서 u-HPLC 분속 검출기(L-2485U fluorescence detector)로 측정되었다. u-HPLC의 이동상은 용매 A로 증류수-메탄올 용액(5:95, v/v) 및 용매 B로 순수한 메탄올을 이용하였다.

구분	실시예 1	실시예 2	비교예 1
α 토코페놀 함량(mg/100g)	0.82±0.01	0.57±0.02	0.09±0.00
γ 토코페놀 함량(mg/100g)	0.17±0.01	0.15±0.00	0.16±0.02
총 토코페놀 함량(mg/100g)	0.99±0.00	0.71±0.02	1.06±0.02

위 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 2에 따라 제조된 추출물은 상기 페놀 함량 및 폴라보노이드 함량과는 달리, 비교예 1의 추출물에 비하여 α,γ, 총 토코페놀의 함량이 낮은 것을 확인하였다.

시험예 4. 활성산소 흡수능(ORAC)

96-well micro plate에 75 mM 인산 버퍼 (pH 7.4)에 녹인 200 uL의 형광을 띠는 용액 (fluorescein solution)과 20 uL의 측정시료 (청밀, 스팀처리된 청밀 및 밀의 자유 및 결합 추출물)를 넣고 20 uL의 79.6 uM 퍼옥실 라디칼 생성 시약 (AAPH)을 잘 혼합한 다음 형광분석기인 Spectra Max i3 (분자 디바이스, Sunyvale, CA, USA)를 이용해 37 ℃에서 형광의 강도를 측정하였다(excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 520 nm). 형광의 강도는 1분 간격으로 측정하였으며, 최종결과는 시료의 형광값과 공시험값의 형광값 간의 넓이 차이로 계산한다. 비타민 E 수용성 유도체인 Trolox를 표준물질로 사용하여 모든 결과는 Trolox 당량 (TE, Trolox equivalents)으로 환산하여 나타내었다.

도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 추출된 추출물의 자유 페놀(FPE), 결합 페놀(BPE) 및 총 페놀(TPE)의 ORAC 값을 나타낸 그래프이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 결합 페놀 화합물의 ORAC 값은 실시예 1의 추출물(66 uM TE/g)이 가장 높으며, 실시예 2의 추출물(57.47 uM TE/g) 및 비교예 1의 추출물(50.29 uM TE/g) 순으로 높은 것을 확인하였다(p<0.001).

이에 따라, 높은 페놀 함량을 보이는 추출물은 높은 ORAC 값을 보이는 것을 확인하였으며, 총 페놀 함량은 직접 항산화 활성과 관련되어 총 페놀 함량이 항산화 활성과 관련성이 높다는 것을 증명하였다. 또한, 결합 페놀 화합물의 ORAC 값은 총 페놀 함량(r=0.941)과 높은 관련성을 보인다(표 4).

시험예 6. 암세포의 항증식 활성

실시예 및 비교예에 따라 제조된 추출물을 45 ℃에서 감압증류하여 증발시킨 다음 디에틸설폭시드(DMSO)로 재용해하였다.

인간 대장암 세포(HT-29 and Caco-2) 및 인간 자궁경부암 세포(HeLa)를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, USA)에서 구입하였다. 상기 HT-29(ATCCHTB-38TM), Caco-2(ATCCHTB-37TM) 및 HeLa(ATCCCCL-2TM) 세포는 각각 McCoy's 5A(Welgene, Daegu, Korea), MEM(Welgene, Daegu, Korea) 및 DMEM(Hyclone Laboratories Inc., South Logan, Utah, USA)에서 배양하였다. 상기 세포를 10% 또는 20%의 소태아혈청(FBS)로 보충하고 5% CO₂로 가습된 배양기를 이용하여 37 ℃에서 성장시켰다.

실시예 및 비교예 추출물의 암세포의 항증식성 효과를 MTT(2-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)분석에 의해 결정하였다. 간단히, 각 셀(1.0 x 10⁴/well)을 96-웰 플레이트에 접종한 후 12시간 방치한 후 미디어를 바꾸고 세포를 96시간 동안 다양한 농도의 추출물(0, 20, 40, 60, 80, 100 mg/mL)로 처리하였다. 배양 96시간 후, 세포증식은 MTT 세포 증식 분석 키트 (Roche Ltd., Mannheim, Germany)를 사용하여 570-655 nm 파장에서 스펙트라 Max i3 플레이트리더(Sunnyvale, CA, USA)로 측정된다.

도 2는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 추출된 추출물에 대한 (A) Caco-2 세포, (B) HT-29 세포 및 (C) HeLa 세포의 항증식 활성을 나타낸 그래프이다. 또한, 도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 추출된 추출물에 대한 Caco-2 세포, HT-29 세포 및 HeLa 세포의 항증식 활성의 EC₅₀값을 나타낸 그래프이다.

도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 및 비교예에 따라 제조된 세 추출물 모두 Caco-2 세포, HT-29 세포 및 HeLa 세포의 성장에 대한 억제효과를 보이는 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1의 추출물은 다른 추출물에 비하여 Caco-2 세포, HT-29 세포 및 HeLa 세포에 대하여 상대적으로 낮은 증식활성을 보였다.

실시예 1, 실시예 2 및 비교예 2의 추출물 순으로 높은 항증식 활성을 보이는 것을 확인하였다. 즉, 실시예 1의 추출물이 가장 우수한 항증식 활성을 보이는 것을 확인하였다.

낮은 EC₅₀ 값은 높은 암세포의 항증식을 나타내는 평균 유효량(EC₅₀)으로서, 실시예 및 비교예에 따라 제조된 추출물에 의한 상대적인 세포 증식의 결과이다(도 3).

실시예 1의 추출물(31.39 mg/mL in HeLa 세포; 39.41 mg/mL in HT-29 세포)은 실시예 2의 추출물(45.21 mg/mL in HeLa 세포; 54.72 mg/mL in HT-29 세포) 및 비교예 1의 추출물(56.03 mg/mL in HeLa 세포; 73.65 mg/mL in HT-29 세포)에 이어 낮은 EC₅₀ 값을 나타내는 것으로서, 헬라세포(HeLa cells)와 HT-29 세포에 대해 높은 증식 억제활성을 보이는 것을 확인하였다.

반면, 카코-2 세포(Caco-2 cells)에서 실시예 1 및 2 추출물의 EC₅₀ 값은 항증식 활성이 낮은 다른 것보다 높으므로 카코-2 세포에 대해 낮은 증식 억제활성을 보이는 것을 확인하였다.

높은 항산화 활성을 가진 물질은 암예방 효과가 있다고 알려져 있으며, 상기와 같이 실시예 1 및 2의 추출물은 높은 항산화 및 항증식 활성을 가지는 것을 확인하였다.

시험예 7. 페놀 함량, 플라보노이드 함량, 토코페롤 함량, 항산화 활성 및 항증식 활성의 관계 측정

실시예 및 비교예에 따라 제조된 세 개의 추출물에서 페놀 함량, 플라보노이드 함량, 토코페롤 함량, 항산화 활성 및 항증식 활성 사이의 상관 계수(r)는 하기 [표 4]에 요약되었다.

위 표 4에 나타낸 바와 같이, 총 페놀 함량 및 총 ORAC 값(r = 0.940) 사이 및 총 플라보노이드 및 ORAC 값(r = 0.936) 사이의 높은 상관관계를 확인하였다. 높은 페놀 및 플라보노이드 함량이 가르치는 양의 상관관계는 실시예 및 비교예의 각 추출물이 항산화 활성에 크게 기여했다는 것을 나타낸다.

그러나, 총 ORAC 값 및 총 토코페롤 사이의 상관관계는 낮았다(r=-0.146).

또한, HT-29, Caco-2 및 HeLa 세포 증식 억제에 효과적인 총 페놀/플라보노이드 사이의 관계도 및 평균 유효량(EC₅₀)을 조사하였다.

높은 상관관계는 HT-29, Caco-2 및 HeLa 세포의 증식과 총 페놀 함량(r = 0.924 in Caco-2 세포; r = -0.907 in HT-29 세포; r = -0.845 in HeLa 세포), 총 플라보노이드 함량(r = -0.962 in Caco-2 세포; r= -0.992 in HT-29 세포; r = -0.876 in HeLa 세포) 및 총 ORAC 값(r = -0.752 in Caco-2 세포; r= -0.958 in HT-29 세포; r = -0.864 in HeLa 세포)의 항증식 활성 사이에서 발견된다.

높은 페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성은 HT-29, Caco-2 및 HeLa 세포에서 높은 항증식 활성에 관련이 있다.

도 4는 실시예 및 비교예에 따라 제조된 추출물의 페놀 함량, 플라보노이드 함량, 토코페놀 함량, 항산화 활성 및 항증식 활성이 로딩된 플롯이다.

도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 및 비교예에 따라 제조된 추출물의 PCA(principal component analysis) 로딩 플롯 및 페놀 함량, 플라보노이드 함량, 토코페놀 함량, 항산화 활성 및 항증식 활성을 나타내었다.

주성분 1(F1)(x-축) 및 주성분 2(F2)(y 축)는 각각 67.33% 및 21.88%를 차지하였다. 상기 F1에 양으로 로드된 비교예 1의 추출물 벡터는 상대적으로 낮은 항증식 활성을 나타내는 HT-29, Caco-2 및 HeLa 세포에서 EC₅₀ 값과 유사하였다.

반면, F1에 음으로 로드된 실시예 1의 추출물은 자유 페놀 함량, 결합 페놀 함량, 총 페놀 함량, 결합 플라보노이드 함량 및 총 플라보노이드 함량과, 항산화 활성(자유 ORAC 값, 결합 ORAC 값 및 총 ORAC 값)과 더 관련이 있다.

전반적으로, PCA 플롯은 HT-29, CACO-2 및 HeLa 세포의 낮은 EC₅₀ 값이 높은 항산화 활성(자유 ORAC 값, 결합 ORAC 값 및 총 ORAC 값), 결합 플라보노이드, 총 플라보노이드, 자유 페놀, 결합 페놀 및 총 페놀 함량과 관련이 있다.

결론적으로, 실시예 1 및 2의 추출물이 비교예 1의 추출물에 비하여 더 많은 폴리페놀, 플라보노이드 및 우수한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 인간 대장 암세포(HT-29 및 Caco-2 세포) 및 자궁 경부암 세포(HeLa 세포)의 증식을 억제하였다.

하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1에서 얻은 청밀 추출물 500 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1에서 얻은 청밀 추출물 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1에서 얻은 청밀 추출물 200 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1에서 얻은 청밀 추출물 600 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1에서 얻은 청밀 추출물 4 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 과립제의 제조

실시예 1에서 얻은 청밀 추출물 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2

비타민 C 10 mg

비오틴 10

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 기능성 음료의 제조

실시예 1에서 얻은 청밀 추출물 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (16)

1. 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 출수기 후 28 내지 36일에 수확한 밀은 90 내지 130 ℃의 스팀으로 20 내지 50초 동안 처리된 밀인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 밀 추출물은 출수기 후 28 내지 36일에 수확한 밀을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 추출물은 출수기 후 30 내지 36일에 수확한 밀과, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 1 : 8 내지 25의 중량비로 혼합하여 추출하는 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 혼합용매는 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 밀 추출물은 총 페놀 함량이 4.6 내지 5.5 mgGAE/g인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 밀 추출물은 총 플라보노이드 함량이 3.0 내지 5.0 mgCE/g인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 밀 추출물은 활성산소 흡수능이 53 내지 75 uM TE/g인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 밀 추출물은 인간 대장암 세포 및 인간 자궁경부암 세포에서 항암활성을 가지는 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 인간 대장암 세포 HT-29 세포 또는 카코-2 세포인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
11. 제9항에 있어서, 상기 인간 자궁경부암 세포는 헬라세포인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
12. 제9항에 있어서, 상기 인간 대장암 세포에서 EC₅₀ 값은 30 내지 80 mg/mL인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
13. 제9항에 있어서, 상기 인간 자궁경부암 세포에서 EC₅₀ 값은 20 내지 60 mg/mL인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
14. 출수기(出穗期) 후 28 내지 36일에 수확한 밀의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 대장암 또는 자궁경부암 개선용 건강기능식품.
15. 제14항에 있어서, 상기 건강기능식품은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 및 바로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
16. 삭제

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