KR101749974B1 - 흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 파골 세포의 분화를 억제하는 효과, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 골의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타내며, 골다공증 예방 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강식품으로 널리 이용될 수 있는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 골의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타낸다. 특히, 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 30 ~ 150 ㎍/㎖인 경우 세포독성은 나타내지 않으면서도 파골세포의 분화 활성을 현저하게 억제시키는 효과를 나타내어, 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품 또는 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 파골 세포의 분화를 억제하는 효과, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 골의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타내며, 골다공증 예방 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강식품으로 널리 이용될 수 있는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
골(bone)은 근육과 연합되어 있는 석회화된 결체조직으로서, 표면은 두껍고 단단한 석회화 조직으로 신체균형을 이루는 지주역할을 하며, 장기를 보호한다. 골의 안쪽은 골수조직으로 칼슘대사의 중심이 되는 부위이다. 골은 콜라겐(collagen), 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin) 등 유기질(organic substance)과 칼슘, 인, 불소 등의 무기질(inorganic substance) 및 수분으로 구성되어 있다. 생체에서는 항상 골형성(bone formation)과 골흡수(bone resorption)가 일어나고 있다. 골형성은 소량의 부갑상선 호르몬이나 안드로겐, 에스트로겐, 불소, 인 등에 의하여 촉진되며, 골흡수는 물리적 감압, 무중력상태, 다량의 부갑상선 호르몬, 부신피질 스테로이드 등에 의하여 촉진된다. 따라서 골대사에는 이들 사이의 균형(balance)이 중요하다.
골다공증(osteoporosis)은 골흡수와 골형성의 균형이 무너져 발생하는 것으로 골형성보다 과다하게 골흡수가 진행되는데 기인한 질환으로, 골다공증은 골 조직의 석회가 감소되어 골의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지고, 증세가 진전됨에 따라 골이 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골조직은 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다.
골의 항상성은 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다.
그러나, 파골 세포의 지나친 활성이나 조골세포 활성의 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여, 골다공증(osteoporosis)과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골 세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골 세포의 활성을 억제하고 조골세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근 방법으로 인지되고 있다.
파골세포는 조혈모세포의 단핵구로부터 유래되는 세포로서, 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 융합하여 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다(참조: Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003 May 15;423(6937):337-42). 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase),
MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수할 수 있다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜
MAPK, 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다 (참조: Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30;305(2):211-4.). 특히, 파골세포의 생존 및 골 흡수 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달 분자로 밝혀진 ERK와 NF-κB에 의해 파골세포 분화에 특이적인 AP-1 또는 NFAT가 조절될 수 있다고 보고되어 있다. 따라서, RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.
골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다.
한편 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14 ~ 18세에 가장 높고 노후에는 1 년에 약 1 %씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30 세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.
이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다.
세계보건기구(World Health Organization, WHO)에 의하면 골다공증(osteoporosis)은 전신 골격계 질환으로서 골량 감소와 미세구조 이상 등의 특징을 가지며, 골질량과 골밀도가 낮아져 골절 위험이 높아지는 질환이다. 또한, 골은 일생 동안 변하는 장기로 1년마다 10% 정도 교체되고, 10년 후 인체의 모든 뼈는 새로운 뼈로 교체된다. 골밀도는 20대에서 30대까지 가장 높으며 그 이후로는 서서히 감소하여 여성의 경우 폐경 첫 5년간 급격하게 약해진다.
조혈모세포에서 생기는 파골세포 (osteoclast)에 의해 오래된 골 파괴 또는 흡수(resorption)가 이루어지며 이는 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다. 한편 중간엽줄기 세포에서 생성된 조골세포 (osteoblast)는 새로운 골 형성을 이루어 골격을 재건하게 된다. 이러한 골 세포의 균형은 호르몬이나 화학요소 혼합물에 의해서 조절된다. 부갑상선 호르몬과 비타민 D는 골의 흡수를 자극하고 에스트로겐, 칼시토닌은 새로운 골을 형성하는 조골세포를 자극한다. 이들 조골의 속도와 파골의 속도가 동일해야 골의 항상성이 유지되는데 파골속도가 빨라지게 되면 골이 약해지게 되어 골절이 쉽게 일어나게 되는 것이다.
파골세포를 활성화시키는 중요한 씨토카인은 Receptor activator of nuclear fractor-κB ligand (RANKL)로서 조골세포 또는 활성화된 면역세포에서 생성된다. 생성된 RANKL은 파골세포 및 전구세포에 위치한 수용체 (RANK)와 결합하여 파골세포의 형성과 활성을 촉진시킨다. 또한 RANKL에 대한 생체 내 길항제인 Osteoprotegerin (OPG)가 존재하고 있다. 결국, RANKL과 OPG의 균형에 의하여 파골세포의 형성과 활성이 조절되는 것이다. 그러나, 골 흡수를 자극하는 원인 (에스트로겐 결핍, 부갑상선 호르몬 항진증 등)이 발생하게 되면 OPG와 RANKL의 균형이 깨지게 되어 파골세포가 활성화되어 골 흡수가 촉진되는 것이다. 활성화된 파골세포는 골 표면에 부착하여 강한 골 용해물질을 분비한다. 골 단백 용해제 중 하나인 카텝신 (cathepsin) K가 파골세포 특이적으로 생성 분비되며, 풍부한 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor, Cal-R)와 TRAP이 존재하며 실제적으로 골 흡수 작용을 하는 산 생성이 활발하고, acting ring을 형성하여 골 기질을 흡수한다고 알려졌다. 따라서 이들의 억제를 통하여 골 흡수 억제 효과를 이끌어낼 수 있을 것이다. 골 흡수를 억제하기 위해 파골전구세포에서 파골세포로의 분화를 차단하는 분화 과정의 초기단계 저해와 분화된 파골세포의 사멸을 유도하여 골 흡수 과정을 저해하는 연구가 진행되고 있다. 골 흡수 억제제로는 칼슘, 비타민 D, 칼시토닌, 여성호르몬, 티볼론, 선택적 에스트로겐 수용체조절제 (selective estrogen receptor modulator, SERM), 비스포스포네이트 등이 이용되어 지고 있다. 그러나 이들 치료법들은 비전형적 골절, 체중증가, 위장장애, 자궁내막암과 유방암 발병 및 하악골 괴사 등 일부 부작용이 보고되고 있다.
최근에는 골다공증과 산화스트레스와 연관성에 대한 연구가 진행되어 산화스트레스 증가와 골밀도 간에는 유의한 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 골다공증 여성의 경우 혈중 항산화제의 농도가 감소되고, 항산화 비타민 섭취로 인하여 골밀도를 증가시켰다고 보고하였다. 따라서 항산화 성분을 가진 유효 약용식물의 안전한 천연물 소재를 이용하여 골 손실의 최소화 시켜 골밀도 증가를 통한 골다공증 예방 또는 치료 물질 발굴이 절실하게 요구된다.
본 발명의 목적은 흰 무궁화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하여, 파골 세포의 활성을 억제하는 효과, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 골의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타내는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 데 있다.
이에, 본 발명은 흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 30 ~ 150 ppm일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서,상기 농도 범위는 상기 조성물로 처리한 파골세포의 생존율에 영향을 주지 않는 안정성 수준의 농도로서, 상기 농도범위에서 파골세포의 TRAP 활성은 감소할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 Cal-R의 mRNA 및 TRAP의 mRNA으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 발현을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 상기의 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은 흰 무궁화꽃을 세척하고, 이를 건조 및 분쇄하는 1단계; 상기 분쇄된 흰 무궁화 꽃에 용매를 2 ~ 4배 부피비로 첨가하고 추출하는 2단계; 및 추출물을 냉각 및 여과한 후 농축하여 흰 무궁화꽃 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 흰 무궁화꽃 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 용매는 물 및 C1 ~ C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 2단계에서 추출은 80℃ ~ 100℃에서 1 ~ 5 시간 동안 2회 이상 반복수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 3단계에서 농축은 40℃ ~ 50℃에서 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 흰 무궁화꽃 추출물의 수율이 30 % ~ 35 %일 수 있다.
본 발명에 따르면, 골밀도 및 골함유량 증가 효과 및 골의 미세구조가 치밀해지는 효과를 동시에 볼 수 있는 복합효과를 나타낸다. 특히, 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 30 ~ 150 ㎍/㎖인 경우 세포독성은 나타내지 않으면서도 파골세포의 분화 활성을 현저하게 억제시키는 효과를 나타내어, 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품 또는 건강식품으로 널리 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 흰 무궁화꽃 추출물의 제조방법을 나타낸 도식도이다.
도 2(A)는 흰 무궁화꽃의 이미지이고; (B)는 흰 무궁화꽃의 70% 에탄올 추출물을 나타낸 이미지이다.
도 3(A)는 흰 무궁화꽃 추출물의 저농도 처리시 세포생존율을 나타낸 그래프이고; (B)는 TRAP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4(A)는 대조군, 흰 무궁화꽃 추출물을 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 파골세포의 TRAP 염색의 이미지이고;(B)는 흰 무궁화꽃 추출물의 고농도 처리시 세포생존율을 나타낸 그래프이고; (C)는 TRAP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 흰 무궁화꽃 추출물 처리에 따른 유전인자 평가를 나타낸 이미지이다.
도 2(A)는 흰 무궁화꽃의 이미지이고; (B)는 흰 무궁화꽃의 70% 에탄올 추출물을 나타낸 이미지이다.
도 3(A)는 흰 무궁화꽃 추출물의 저농도 처리시 세포생존율을 나타낸 그래프이고; (B)는 TRAP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4(A)는 대조군, 흰 무궁화꽃 추출물을 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 파골세포의 TRAP 염색의 이미지이고;(B)는 흰 무궁화꽃 추출물의 고농도 처리시 세포생존율을 나타낸 그래프이고; (C)는 TRAP 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 흰 무궁화꽃 추출물 처리에 따른 유전인자 평가를 나타낸 이미지이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
골 형성에 관여하는 조골세포(osteoblast) 감소 혹은 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수 증가로 인하여 골질량 감소가 유발되며 노화, 호르몬 이상(에스트로겐 감소), 대사성 질환 및 골 전이성 암 등과 같은 유전적·생리적·환경적 인자의 변화로 발병되는 골다공증(osteoporosis) 예방 및 개선제로서 흰 무궁화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성 및 건강 기능성 식품에 관한 내용은 공지된 바가 없었다.
이에, 본 발명은 흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 흰 무궁화꽃(Hibiscus syriacus L.)은 아욱과 (Malvaceae)에 속하는 낙엽활엽 관목으로 질은 가볍고 약간 향기가 있으며 꽃이 크고 흰 것이 좋으며, 플라보노이드의 플라본 성분이 흰 무궁화에 다량 함유되어 있고, 전체 플라본의 50%가 사포나린 (saponarin)으로 이루어져 약용으로 이용되어 왔다. 또한, 무궁화 추출물이 염증 유발시킨 대식세포에서 염증 매개 인자를 현저하게 억제하여 항염 효능을 가진다고 보고된 바 있다.
또한, 본 발명에 따르면 흰 무궁화 꽃 (flower of white Hibiscus syriacus, wHS) 추출물은 in vitro 상에서 파골세포의 분화에 영향을 미쳐, 골질환 조절에 응용할 수 있어 골다공증 예방 및 치료제용 조성물을 제공할 수 있다.
이때, 상기 조성물로 처리한 파골세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 안전성 수준 농도에서 TRAP 활성은 감소할 수 있다. 상기 조성물로 처리한 파골세포는 조성물의 농도가 250 ppm 이상인 경우 세포독성을 나타내어 파골세포의 생존율이 현저히 저하될 수 있으나, 상기 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 30 ~ 150 ppm이고, 바람직하게는 40 ~ 120 ppm인 경우에는 상기 조성물로 처리된 파골세포가 세포 안정성을 가져 흰 무궁화꽃 추출물의 미처리군과 유사한 세포생존율을 가진다.
또한, 상기 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 30 ~ 150 ppm이고, 바람직하게는 40 ~ 120 ppm인 경우에 파골세포의 분화 활성을 현저하게 억제할 수 있다. 보다 상세하게는 상기 농도범위는 상기 조성물로 처리한 파골세포의 생존율에 영향을 주지 않는 안정성 수준의 농도로서, 상기 농도범위에서 파골세포의 TRAP 활성이 흰 무궁화꽃 추출물의 미처리군에 비해 50 ~ 70 % 감소할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 Cal-R의 mRNA 및 TRAP의 mRNA으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 발현을 감소시킬 수 있고, 보다 상세하게는 상기 조성물로 처리한 파골세포의 Cal-R 발현양은 상기 조성물로 처리하지 않은 대조군에 비해 50 ~ 55 % 감소할 수 있고, 파골세포의 TRAP 발현양도 대조군에 비해 30 ~ 35 % 감소할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물은 파골 세포의 분화를 효과적으로 억제하므로 골다공증 예방 또는 개선에 효과적이며, 따라서, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 혼합 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 0.04g, 바람직하게는 약 0.02 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 흰 무궁화꽃을 세척하고, 이를 건조 및 분쇄하는 1단계; 상기 분쇄된 흰 무궁화 꽃에 용매를 2 ~ 4배 부피비로 첨가하고 추출하는 2단계; 및 추출물을 냉각 및 여과한 후 농축하여 흰 무궁화꽃 추출물을 제조하는 3단계;를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 흰 무궁화꽃 추출물의 제조방법을 제공한다. 이하, 본 발명을 단계별로 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 골다공증 예방 및 치료용 흰 무궁화꽃 추출물의 제조방법에 있어서, 상기 1단계는 흰 무궁화꽃을 세척하고, 이를 건조 및 분쇄하는 단계로서, 상기 1단계는 자연상태에서 채취된 흰 무궁화꽃에 포함될 수 있는 불순물을 제조하고 추출 수율을 높이기 위하여 수행된다.
상기 2단계는 상기 분쇄된 흰 무궁화 꽃에 용매를 2 ~ 4배 부피비로 첨가하고 추출하는 단계로서, 이때, 상기 흰 무궁화꽃 추출물을 추출하는 방법은 천연 추출물을 추출하는 방법이라면 특별히 한정하지 않으나, 물 및 C1 ~ C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 용매로 추출될 수 있다. 더욱 바람직하게는 물, 에탄올 또는 에탄올로 추출된 것을 사용할 수 있으나 이에 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 2단계에서 추출은 80℃ ~ 100℃에서 1 ~ 5 시간 동안 2회 이상 반복 수행할 수 있고, 바람직하게는 80℃ ~ 90℃에서 3 ~ 5 시간 동안 3회 이상 반복 수행하여 환류추출 할 수 있다.
상기 3단계는 추출물을 냉각 및 여과한 후 농축하여 흰 무궁화꽃 추출물을 제조하는 단계로서, 상기 단계를 통해 흰 무궁화꽃의 추출수율을 향상시킬 수 있다. 이때, 상기 3단계에서 농축은 40℃ ~ 50℃에서 수행할 수 있고, 바람직하게는 약 45℃에서 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 골다공증 예방 및 치료용 흰 무궁화꽃 추출물의 제조방법을 통해 추출되는 흰 무궁화꽃 추출물의 수율은 30 % 이상일 수 있고, 바람직하게는 30 ~ 35 %일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 이때, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위하여 제시되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1. 흰 무궁화 꽃 추출물의 제조
무궁화는 충청남도 금산군 군북면 일대에 식재된 흰 무궁화 꽃을 2014년 8월에 채취하였으며, 상기 흰 무궁화 꽃은 실험 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다.
상기 불순물이 제거된 시료를 동결건조기 (Martin Christ, Osterode. Germany)에서 건조한 후 분쇄하여 70% 에탄올(EtOH)을 시료의 3배 부피로 첨가하여 85℃에서 3시간씩 3번 환류추출 한 후 실온에서 냉각한 뒤 여과지(Filter paper, No. 4)를 이용하여 여과하고, 회전 감압농축기 (Rotavapor RII, Buchi, Switzerland)로 45℃에서 감압농축 한 후 추출물을 동결 건조하여 분말 형태로 초저온 냉동고에 보관하였다. 이때, 최종 수율 (yield)은 32.02 % 이었다. 이를 PBS (Dulbecco's, phosphate buffered saline, Daegu, Korea)에 하기 표 1과 같은 농도로 희석하여 본 발명에 따른 골다공증 치료 및 예방용 조성물을 제조하였다.
| 실시예 | 조성물의 농도 (단위:ppm) |
| 실시예 1 | 1 |
| 실시예 2 | 2.5 |
| 실시예 3 | 5 |
| 실시예 4 | 10 |
| 실시예 5 | 25 |
| 실시예 6 | 50 |
| 실시예 7 | 100 |
| 실시예 8 | 250 |
| 실시예 9 | 500 |
| 실시예 10 | 1000 |
비교예
1. 대조군
상기 흰 무궁화꽃 추출물을 포함하지 않는 PBS (Dulbecco's, phosphate buffered saline, Daegu, Korea) 용액을 준비하였다.
[
실험예
]
이하 하기 실험예에 기재된 모든 실험군은 3개 이상 수행하였으며 정량적 결과는 대조군에 대한 백분율로 평균± 표준편차로 나타냈다. 모든 실험은 3번 이상 반복하여 동일한 실험결과로 사용하였고, two-tailed Student's t test로 통계적 유의성을 분석하여 p<0.05 이하를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예
1. 파골세포 생존율 측정 및 독성평가 1
본 발명에 따른 조성물의 파골세포에 대한 생존 및 간접적 독성평가를 위하여 MTT assay를 시행하였다. 파골세포 분화 유도를 위한 마우스 대식 세포주 RAW264.7 세포를 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA)로부터 구입하였고, 이를 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin-streptomycin (100 U/㎖, 100 ㎍/㎖)이 포함된 DMEM 배지로 5% CO2, 37℃의 배양기(incubator)에서 계대 배양하였다.
상기 RAW264.7 세포는 96-well plate에 1×104 cells/well 농도로 분주하여 DMEM에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin 조건으로 24시간 동안 안정화시켰다. 파골세포 분화 유도를 위하여 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 함유된 α-MEM(Gaithersburg, MD)에 RANKL(PeproTech EC, London, England) 50 ng/㎖을 첨가한 뒤 실시예 1 ~ 5 및 비교예 1의 조성물을 준비하였다.
이때, 상기 비교예 1을 대조군으로 설정하였고, 배양 3일 후 MTT 용액[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich](2 ㎎)에 첨가하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 생성된 formazan crystals을 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich)로 용해하였다. 이후, ELISA reader (BIO-RAD 450, California USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.
또한, 본 발명에 따른 실시예 1 ~ 5 및 비교예 1의 조성물로 처리한 파골세포의 TRAP 활성을 측정하기 위하여 TRAP solution assay를 수행하였다. TRAP 효소는 ATP와 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate)가 존재할 때 높은 활성을 가지고, 골 흡수작용시 분비가 증가되기 때문에 그 활성도 측정하여 파골세포 분화정도를 확인하는 데 이용할 수 있다.
분화제와 시료처리 3일된 세포는 PBS로 수세 후 10 % formalin으로 5분간 고정하고, DW로 다시 수세하였다. 시그마 TRAP 염색 (kit no. 387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 사용 설명에 따라 신선한 TRAP 용액으로 30분간 처리하였다. 염색된 세포는 광학현미경 (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하고, 디지털 영상카메라 (DIXI 3000, Olympus, Tokyo, Japan)로 이미지를 영상화하여 둥근 모양 형태의 파골세포 (round-shaped osteoclast, ROC) 수를 측정하여 TRAP 활성을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.
| 비교예 1 | 실시예 1 | 실시예 2 | 실시예 3 | 실시예 4 | 실시예 5 | |
| 농도 | 0 | 1 | 2.5 | 5 | 10 | 25 |
| 세포생존율 | 100 | 97.990 | 99.601 | 106.755 | 103.769 | 95.211 |
| TRAP 활성 | 100 | 95.953 | 91.624 | 101.511 | 97.772 | 87.807 |
표 2 및 도 3에 따르면, 실시예 1 ~ 5는 비교예 1과 유사한 세포생존율을 나타내었고, TRAP 활성도 유의미한 변화를 나타내지는 않는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 0 ~ 30 ㎍/ml의 저농도로 포함되는 경우 파골세포의 분화 억제에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
실험예
2.
TRAP
염색을 통한
양성파골세포
분화 관찰 2
상기 실시예 6 ~ 10 및 비교예 1의 조성물에 대하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 세포생존율을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다. 이때, 실시예 6, 실시예 7 및 비교예 1의 TRAP 염색 이미지를 도 4의 A에 나타내었고, TRAP 활성은 표 4에 나타내었다.
| 비교예 1 | 실시예 6 | 실시예 7 | 실시예 8 | 실시예 9 | 실시예 10 | |
| 농도 | 0 | 50 | 100 | 250 | 500 | 1000 |
| 세포생존율(%) | 100 | 103.728 | 100.236 | 71.732 | 45.588 | 39.972 |
| 비교예 1 | 실시예 6 | 실시예 7 | |
| 농도 | 0 | 50 | 100 |
| TRAP활성(%) | 100 | 47.276 | 39.738 |
표 3 및 도 4에 따르면, 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 50 및 100 ㎍/ml인 경우, 세포 생존율이 대조군인 비교예 1과 유사하여 흰 무궁화꽃 추출물이 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있으나, 농도가 250 ~ 1000 ㎍/ml인 경우 세포생존율이 유의하게 감소하여 세포 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 50 및 100 ㎍/ml인 경우, 흰 무궁화 꽃 추출물의 TRAP 활성도는 대조군에 비교하여 50 ㎍/ml에서 47.276 %이고, 100 ㎍/ml에서 39.738 %로 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 흰 무궁화꽃 추출물의 농도가 50 및 100 ㎍/ml를 포함하는 범위인 30 ~ 150 ㎍/㎖인 경우, 바람직하게는 40 ~ 120 ㎍/ml인 경우 상기 흰 무궁화꽃 추출물로 처리한 파골세포의 생존율이 미처리 군에 비해 0.1 ~ 5% 향상되고, TRAP 활성이 미처리군에 비해 50 ~ 70 % 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예
3.
역전사중합효소연쇄반응
(
RT
-
PCR
) 분석
본 발명에 따른 실시예 7 및 비교예 1의 조성물로 처리한 파골세포의 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor, Cal-R)와 TRAP의 발현을 관찰하기 위하여 TRIzol을 사용하여 total RNA를 추출하고, iScript cDNA synthesis kit으로 cDNA를 합성하였다. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 Emerald Taq을 이용하여 초기 번성과정을 95℃에서 10분간 시행한 후, 95℃ 1분, 51 ∼ 58℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 총 25 ∼ 32 주기를 시행한 후, 최종 증폭과정을 72℃에서 10분간 시행하였다. 이때 사용한 PCR primer 순서는 하기 표 5와 같다. 반응이 끝난 시료는 2 % 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동하고 Et-Br로 염색하여 UV 상에서 관찰하고 densitometric analysis를 이용하여 수치화하였고, 그 결과를 하기 도 5 및 표 6에 나타내었다.
| 유전자 | 염기서열(5' -> 3') | 어닐링 온도(℃) | 염기서열의 크기(bp) |
| Cal-R |
F-ACCGACGAGCAACGCCTACGC | 58 | 490 |
| R-GCCTTCACAGCCTTACAGGTAC | |||
| TRAP |
F-AAATCACTCTTTAAGACCAG | 51 |
317 |
| R-TTATTGAATAGCAGTGACAG | |||
| GAPDH |
F-AACTTTGGCATTGTGGAAG | 53 |
223 |
| R-ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| 비교예 1 | 실시예 7 | |
| 농도 | 0 | 100 |
| Cal-R(%) | 100 | 46.689 |
| TRAP(%) | 100 | 71.981 |
파골세포는 다양한 사이토카인, 호르몬 및 유전인자 조절 등으로 시작, 분화, 다핵화 그리고 성숙화 등 복잡한 과정에 의해 형성되는데, 풍부한 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor, Cal-R)와 TRAP이 존재하며 실제적으로 골 흡수작용을 하는 산 생성이 활발하고, acting ring을 형성하여 골 기질을 흡수한다고 알려져 있다.
이에, 표 6 및 도 5에 따르면, 성숙 파골세포의 골 기질 흡수단계에서 흰 무궁화 꽃추출물에 의한 Cal-R와 TRAP의 mRNA 발현양 변화를 분석한 결과, 실시예 7의 흰 무궁화 꽃 처리군의 Cal-R 발현양은 대조군에 비해 46.69%로 현저하게 감소되었고, TRAP 발현양 역시 대조군에 비해 71.98%로 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, RANKL에 의한 TRAP 효소활성의 억제와 마찬가지로 Cal-R와 TRAP의 mRNA 발현도 흰 무궁화꽃 추출물에 의해서 유의하게 억제된다는 것을 알 수 있었다. 따라서 이를 통해 상기 농도범위의 흰 무궁화꽃 추출물을 포함하는 조성물은 최종적으로 골 기질 흡수를 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (10)
- 흰 무궁화꽃 추출물 30 ~ 150ppm의 농도를 유효성분으로 포함하며, 상기 농도범위에서 파골세포의 TRAP 활성이 감소되는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 흰 무궁화꽃 추출물을 포함하는 조성물은 Cal-R의 mRNA 및 TRAP의 mRNA으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제 1 항 또는 제 4 항의 흰 무궁화꽃 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강기능식품.
- 흰 무궁화꽃을 세척하고, 이를 건조 및 분쇄하는 1단계;
상기 분쇄된 흰 무궁화 꽃에 용매를 2 ~ 4배 부피비로 첨가하고 80℃ ~ 100℃에서 1 ~ 5 시간 동안 2회 이상 수행하여 추출하는 2단계; 및
추출물을 냉각 및 여과한 후 40℃ ~ 50℃에서 농축하여 흰 무궁화꽃 추출물을 제조하는 3단계;
를 포함하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 흰 무궁화꽃 추출물의 제조방법.
- 제 6 항에 있어서,
상기 용매는 물 및 C1 ~ C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 흰 무궁화꽃 추출물의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 6 항에 있어서,
상기 흰 무궁화꽃 추출물의 수율이 30 % ~ 35 %인 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료를 위한 흰 무궁화꽃 추출물의 제조방법.
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| KR1020150077339A KR101749974B1 (ko) | 2015-06-01 | 2015-06-01 | 흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020150077339A KR101749974B1 (ko) | 2015-06-01 | 2015-06-01 | 흰 무궁화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물 |
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