KR101318296B1

KR101318296B1 - 산초의 정유를 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101318296B1
Application number: KR1020110137063A
Authority: KR
Inventors: 김건희; 장경미
Original assignee: 덕성여자대학교 산학협력단
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-10-15
Also published as: KR20130069982A

Abstract

본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산초의 정유를 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강식품에 관한 것이다. 상기 산초의 정유는 조골세포의 ALP 활성, 콜라겐 합성 및 칼슘 축적을 증가시켜 골형성을 촉진시킴으로써 골다공증을 치료하기 위한 약리학적 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산초의 정유를 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Osteoporosis Comprising Essential Oil of Zanthoxylum schinifolium}

본 발명은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산초의 정유(essential oil)를 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

생물의 뼈조직은 미네랄화된 유기 매트릭스와 골세포로 이루어져 있으며, 조골세포에 의한 조직의 형성과 파골세포에 의한 조직의 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 평형 상태를 유지하고 있다. 골다공증은 조골세포와 파골세포의 평형이 무너져 골 흡수가 골 형성보다 항진되어 유발되는 질병으로서, 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지게 되며, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있는데, 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬의 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 골다공증은 정도의 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없이 나타나는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 골다공증은 크게 3가지 유형으로 나눌 수 있는데, 첫째는 원인불명(idiopathic)의 골다공증, 둘째는 폐경기 이후 여성호르몬 부족에 의해 나타나는 타입 Ⅰ 골다공증, 셋째는 고령화된 노인층의 남녀에게 발견되는 타입 Ⅱ 골다공증이다.

현재 사용되고 있는 골다공증 치료제는 대부분 에스트로겐(estrogen) 계통의 물질로서, 이들은 장기 투여할 경우 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있다. 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없고 약물의 장기 투여가 필수적인 질환이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다. 고대로부터 많은 식물 유래 물질들이 다양한 질환을 치료하기 위한 약물로서 사용되어 왔으며, 전통적인 한방 치료법에는 피토테라피(phytotherapy) 요법이 풍부하다(비특허문헌 1). 이러한 약물은 화학적으로 합성된 약물과 비교하여 부작용이 적고, 장기간 사용에 보다 적합하다.

한편, 운향과(Rutaceae family) 식물 유래의 정유는 신경계통의 문제, 두통, 저혈압, 항-염증성 질환, 궤양 및 위장의 문제를 치료하는 테르페노이드의 풍부한 공급원으로 잘 알려져 있다(비특허문헌 2). 운향과의 일원인 산초(Zanthoxylum schinifolium)는 산기슭 양지에서 흔히 자라며, 우리나라, 일본, 중국, 만주, 일본, 대만 등지에 분포되어 있다. 산초의 약효는 온중, 산한, 제습, 지통, 살충의 효능이 있고, 소화불량, 위내정수, 심복냉통, 구토, 하리, 음부소양증을 치료한다고 알려져 있으며, 최근에는 항-HBV DNA 복제, 항-혈소판 응집 및 모노아민 옥시다아제 억제 활성을 갖는 것으로 보고되었다(비특허문헌 3 및 비특허문헌 4). 그러나, 현재까지 산초를 골다공증의 예방이나 치료에 사용할 수 있음은 알려진 바가 없다.

Ahn MS, Won JS, Han MN. A study on the anti-oxidative and antimicrobial activities of the chopi solvent extract. Korean J. Food Culture 19: 170-176 (2004) Heo J. Dongibogam (publication on Oriental Medicine in Chosun Dynasty) Namsandang, Seoul, Korea. p.1224 (2000) Chen IS, Lin YC, Tsai IL, Teng CM, Ko FN, Ishikawa T, Ishii H. Coumarin and anti-platelet aggregation constituents from Zanthoxylum schinifolium. Phytochemistry 39: 1091-1097 (1995) Chang CT, Doong SL, Tsai IL, Chen IS. Coumarins and anti-HBV constituents from Zanthoxylum schinifolium. Phytochemistry 45: 1419-1422 (1997)

본 발명은 산초의 정유를 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산초의 정유를 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "산초의 정유"는 산초로부터 다양한 추출 방법, 예컨대, 증기 증류, 열수 증류, 유지흡착 추출, 용매 추출, 초임계유체 추출, 압착 등의 방법을 사용하여 얻어지는 천연물로서, 산초의 광합성에 의해 전환된 성분이 생화학적 반응에 의해 1차 대사산물을 생성하고 축합, 산화, 환원 및 고리화 등의 여러 반응에 의해 생성된 에센스(essence)로 정의된다. 산초의 정유는 상기 추출 방법 중에서 증기 증류를 이용하여 추출하는 것이 바람직한데, 상기 증기 증류를 이용하여 산초의 정유를 추출할 경우 다른 방법과 비교하여 추출된 정유의 성분에는 큰 차이가 없으나 정유 추출량이 더 많게 된다.

본 발명에 있어서, "예방"이란 용어는 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, "치료" 및 "개선"이란 용어는 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, "투여"란 용어는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 산초 정유의 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 본 발명의 산초의 정유는 건조된 산초를 분쇄한 후, 정유 추출 용기, 바람직하게는 클레벤저형(Clevenger-type) 장치에 넣고 물을 넣은 다음 용기를 가열하여 증기화시키고, 이를 냉각함으로써 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 산초의 정유는 β-펠란드렌(phellandrene), 시트로넬랄(citronellal), 게라닐 아세테이트(geranyl acetate), β-미르센(myrcene), 시트로넬릴 아세테이트(citronellyl acetate), 시트로넬롤(citronellol), 크립톤(cryptone), 리날룰(linalool), 쿠미놀(cuminol), 노난산(nonanoic acid), α-테르피놀렌(terpinolene), 게라니알(geranial), 피페리톤(piperitone) 등의 화합물을 1종 이상 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 산초의 정유는 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 산초의 정유는 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 산초의 정유에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 연고, 크림제 및 경피제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 함유할 수 있다. 개별 투약량은 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명의 산초의 정유의 인체 투여량, 즉 약학적으로 유효한 양은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 정도 등에 따라 적절히 선택되며, 성인에게 10∼300 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 20∼100 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6회 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 한 구현예에 따르면, 산초로부터 추출된 정유는 조골세포의 성장을 현저하게 증가시킨다는 것을 알 수 있다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 산초의 정유는 조골세포의 알칼린 포스파타아제(ALP) 활성을 증가시키고, 콜라겐 합성을 10% 이상 현저하게 증가시키며, 또한 분화에 있어서의 다른 중요한 공정인 미네랄화에 대해서도 현저한 자극 효과를 나타냄으로써 골형성을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다(표 2 내지 표 4 참조).

또한, 본 발명은 산초의 정유를 유효성분으로 함유하는 골다공증 증상의 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 산초의 정유는 골다공증 증상의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 상기 산초의 정유를 식품 첨가물로 사용할 경우, 산초의 정유를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 산초의 정유가 원료에 대하여 30 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물에는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 산초의 정유 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01∼0.04 g, 바람직하게는 약 0.02∼0.03 g이다.

상기 외에도 산초의 정유는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 산초의 정유는 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 산초의 정유 100 중량부 당 0.01∼0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

산초의 정유는 조골세포의 ALP 활성, 콜라겐 합성 및 칼슘 축적을 증가시켜 골형성을 촉진시킴으로써 골다공증을 치료하기 위한 약리학적 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 조골세포성 MC3T3-E1 세포의 세포 생존율에 대한 산초의 영향을 나타내는 그래프로서, 데이터는 평균±SEM이고, 대조군에 대한 %로서 표현되어 있으며, *는 대조군과 비교하여 p<0.05임을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 산초 정유의 제조

산초는 2007년 3월에 경동시장에서 구입하였으며, 덕성여대 약학대학의 정춘식 교수에 의해 확인되었다. 대조 표본(voucher specimen)(No. LDU2007-051)은 덕성여대 식물자원연구소에 기탁하였다. 산초 정유를 제조하기 위하여, 건조된 산초를 블렌더(NJ-8060SM, NUC Electronics, Seoul, Korea)를 이용하여 10초 동안 분쇄한 후, 1 ㎏의 샘플을 클레벤저형 장치(Hanil Lab Tech Ltd., Incheon, Korea)를 이용하여 3시간 동안 증기 증류 추출에 의해 추출하였다.

그 결과, 산초의 정유의 수율은 2.5%(w/w)(25 g 오일/㎏ 물질, d.w.)였고, 증류된 오일의 색은 연노란색이었다. 얻어진 산초의 정유를 무수 나트륨 설페이트에 대해 밤새 건조하고, 측정한 후, 테스트할 때까지 냉장고 내에 있는 밀봉된 어두운 유리 용기 내에서 -4℃에 보관하였다.

실시예 2. 산초 정유 내 구성물의 분석

HP-5MS 모세관 칼럼(30 m 길이×0.25 ㎜ i.d.×0.25 ㎛ 필름 두께; Aglient Co.)이 장착된 Aglient 6890 GC/5973 질량 선택적 검출기(Aglient Co., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 산초 정유의 구성물을 분석하였다. 이를 위하여, 헬륨을 1.0 ㎖/분의 흐름 속도로 캐리어 가스로 사용하였으며, 칼럼의 온도를 40℃에서 5분 동안 유지한 후, 3℃/분의 속도로 40℃에서 150℃까지 증가시키고, 150℃에서 5분 동안 유지한 후, 7℃/분의 속도로 150℃에서 220℃까지 증가시키고, 220℃에서 5분 동안 유지하도록 프로그램하였다.

휘발성 향미 성분의 질량 스펙트럼을 온라인 컴퓨터 도서관(Wiley 275; Agilent Co.)에 있는 것들과 비교함으로써 그 특성을 분석하였다. 상대적인 머무름 지수(retention index, RI)를 계산함에 있어서 알칸을 기준점(reference point)으로 사용하였다. 상기 RI는 동일한 크로마토그래피 조건 하에서 정유 후에 주입된 n-알칸 시리즈[알칸 표준 용액(04070, 04071), (C₈-C₂₀, C₂₁ _-40), GC에 대한 표준, Fluka, Milwaukee, WI, USA]의 머무름 시간(retention time, RT)을 포함하는 표준법을 이용하여 실험적으로 결정하였다. C₈-C₂₅를 외부 참조로 이용하여 측정한 상기 화합물의 RI를 공개된 데이터와 비교하였다. 몇 가지 화합물들이 문헌에 보고되어 있는 것으로 확인되었다. 데이터는 3번의 실험의 평균값으로 나타내었다.

그 결과, 산초의 정유에는 45가지 탄화수소, 2가지 알코올, 5가지 알데히드, 5가지 케톤, 1가지 에스테르 및 2가지 카르복시산으로 이루어져 있는 60가지 휘발성 향미 화합물이 실험적으로 동정되었다. % 피크 면적으로서 1%보다 높은 농도를 갖는 주된 휘발성 향기 화합물을 표 1에 나타내었다. 동정된 화합물 중에서, 모노테르펜에 속하는 β-펠란드렌이 산초의 정유 내의 가장 풍부한 휘발성 화합물로서 22.54%가 포함되어 있었으며, 이것은 후추 박하 향미를 나타내는 것이다. 두 번째로 풍부한 향기 화합물인 시트로넬랄은 감귤, 오이 및 지방 향미를 갖는 것으로 알려져 있다.

화합물	RT¹⁾	RI	QA	PA	동정 방법²⁾
β-펠란드렌	15.52	1027	96	22.54	RT, MS/RI
시트로넬랄	22.15	1143	98	16.48	RT, MS/RI³⁾
게라닐 아세테이트	32.52	1386	93	11.39	RT, MS/RI⁴⁾
β-미르센	13.28	0988	96	7.73	RT, MS/RI
시트로넬릴 아세테이트	30.74	1354	91	3.07	RT, MS/RI⁵ ⁾
시트로넬롤	25.51	1235	86	2.55	RT, MS/RI³ ⁾
크립톤	23.23	1190	69	2.20	RT, MS/RI
리날룰	18.79	1101	97	2.52	RT, MS/RI
쿠미놀	28.75	1292	97	1.62	RT, MS/RI
노난산	29.19	1298	80	1.41	RT, MS/RI
α-테르피놀렌	18.02	1087	98	1.27	RT, MS/RI
게라니알	28.38	1285	83	1.23	RT, MS/RI⁵ ⁾
피페리톤	26.09	1250	96	1.17	RT, MS

1) RT: 머무름 시간(분); RI: 머무름 지수; PA: 피크 면적 %, MS 총 이온 크로마토그램 내의 피크 면적의 상대적인 백분율의 평균(n=3); QA: MS 데이터의 품질 %(n=3). 데이터는 3회 실험의 평균값이다.

2) 참고문헌(Kondjoyan N, Berdague JL. A Compilation of Relative Retention Indices for the Analysis of Aromatic Compounds. Laboratoire Flaveur, (ed.) Clemont-Ferrand, France. pp. 14-138 (1996); Acree T, Arn H. Flavornet and human odor space Available from: http://www.flavornet.org. Accessed Mar. 29, 2007)에 기반한 동정 방법. MS는 Wiley 질량 스펙트럼 데이터베이스(2001, Hewlett Packard Co., Palo Alto, CA, USA)의 것과 일치하였다; RI는 문헌의 것과 일치하였다.

3) 참고문헌(Dharmawan J, Kasapis S, Curran P, Johnson JR. Characterization of volatile compounds in selected citrus fruits from Asia. Flavour Frag. J. 22: 228-232 (2007))에 기반한 동정.

4) 참고문헌(Kundakovik T, Fokialakis N, Kovacevic N, Chinou I. Essential oil composition of Achillea lingulata and A. umbelleta. Flavour Frag. J. 22: 184-187 (2007))에 기반한 동정.

5) 참고문헌(Wijaya CH, Hadiprodjo IT, Apriyantono A. Identification of volatile compounds and key aroma compounds of Andaliman. Food Sci. Biotechnol. 11: 680-683 (2002))에 기반한 동정.

실시예 3. 산초 정유가 조골세포의 기능에 미치는 영향 확인

<3-1> 조골세포의 성장에 미치는 영향

조골세포는 골격의 골형성 세포로서, 뼈의 세포외 매트릭스의 축적 및 미네랄화를 합성 및 조절한다. 조골세포-유사 세포주인 MC3T3-E1 세포주(RCB1126, C57BL/6 마우스 두개관(calvaria) 유래의 조골세포-유사 세포주)는 조골세포로 분화하는 능력을 유지하고 있는 것으로 보고되어 있으며, 조골세포의 분화에 미치는 피토케미컬의 영향에 대한 매우 유용한 정보를 제공할 수 있다. 상기 MC3T3-E1 세포는 RIKEN 세포 은행(Tsukuba, Japan)으로부터 입수하였고, 5% CO₂ 대기 및 α-변형된 최소 필수 배지(α-MEM; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 내에서 37℃에서 배양하였다. 달리 특정하지 않는 한, 상기 배지는 10% 열-불활성화 소 태아 혈청(FBS), 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하였다.

MTT 테스트를 사용하여 상기 MC3T3-E1 세포의 성장을 측정하였다. 세포를 5×10³ 세포/웰의 밀도로 48-웰 플레이트에 접종하였다. 화합물 처리 2일 후에 살아있는 세포에 의한 MTT 섭취에 기반한 비색 분석을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 간략하게, 테스트된 추출물을 제거한 후, 둘베코 포스페이트 완충 식염수(DPBS)로 세척한 세포에 MTT 용액(0.5 ㎎/㎖)을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 배양하여 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 테트라졸리움 고리를 절단하여 푸른색 포르마잔 결정이 형성되도록 하였다. 2시간 후, 잔류 MTT를 조심스럽게 제거하였고, 상기 결정을 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 20분 동안 인큐베이션하여 용해시켰다. 상기 플레이트를 5분 동안 교반하였고, 분광광도계를 이용하여 570 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, MC3T3-E1 세포는 산초의 정유에 노출된 후 현저하게 성장하였다(p<0.05). 0.4, 2 및 10 ㎍/㎖ 농도의 산초의 정유에 있어서, 세포 성장 레벨은 대조군과 비교하여 108 내지 116% 증가되었다(도 1). 상기 예비 관찰에 근거하여, 세포내 콜라겐 함량, 칼슘 축적 및 ALP 활성을 추가로 측정함으로써, MC3T3-E1 세포에 대한 산초 정유의 분화-유도 활성을 평가하였다.

<3-2> ALP 활성 측정

일반적으로 골 성장이 활발히 이루어질 때에는 ALP의 합성이 증가하게 된다. 이를 확인하기 위하여, 세포가 90% 포화도에 도달하였을 때, 10 mM β-글리세로포스페이트 및 50 ㎍/㎖ 아스코르브산을 함유하는 배양 배지로 세포를 처리하여 시험관내 미네랄화를 개시하였다. 상기 배지는 2-3일마다 교체하였다. 6일 후, 세포를 0.3% 소 혈청 알부민(BSA) 및 단리된 화합물을 함유하는 배지를 이용하여 2일 동안 개별적으로 배양하였다. 수확시, 상기 배지를 제거하였고, 세포 단일층을 PBS를 이용하여 2회 부드럽게 세척하였다. 상기 세포를 0.2% 트리톤 X-100을 이용하여 용해시켰다. 상기 용해물을 14,000×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 투명한 상등액을 사용하여 ALP 활성 분석 키트(Asan Co., Ansan, Korea)를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다.

그 결과, 산초의 정유는 0.4-10 ㎍/㎖의 농도에서 조골세포성 MC3T3-E1 세포에서의 ALP 활성을 증가시켰다(표 2).

산초 정유(㎍/㎖)	유닛/10⁶ 세포	대조군에 대한 %
0	3.144±0.061	100±1.933
0.4	3268±0.013	103.9±0.401
2	3.246±0.098	103.3±3.112
10	3.292±0.017	104.7±0.546

상기에서, 데이터는 평균±SEM이고, 대조군에 대한 %로서 표현되어 있다.

<3-3> 콜라겐 함량의 측정

시리우스 레드계 비색 분석을 이용하여 콜라겐 함량을 측정하였다. 이를 위하여, 배양된 조골세포를 PBS로 세척한 후, Bouins 유체를 이용하여 1시간 동안 고정하였다. 이어서, 상기 고정 유체를 제거하고, 배양 접시를 흐르는 수돗물에 15분 동안 침지시켜 세척하였다. 상기 배양 접시를 공기 중에 건조시켰고, 교반기에서 부드럽게 교반하면서 시리우스 레즈 염료 시약으로 1시간 동안 염색하였다. 이후, 상기 용액을 제거하였고, 배양물을 0.01 N HCl로 세척하여 결합되지 않은 염료를 제거하였다. 염색된 물질을 0.1 N NaOH에 용해시켰고, 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 0.1 N NaOH를 참조하였다.

그 결과, 산초의 정유는 0.4, 2 및 10 ㎍/㎖의 농도에서 콜라겐 합성을 110-116%의 레벨로 현저하게 증가시킨다는 것을 확인하였다(표 3).

산초 정유(㎍/㎖)	㎍	대조군에 대한 %
0	38.324±1.021	100±2.664
0.4	41.966±0.507	109.5±1.324*
2	43.143±1.007	112.6±2.627*
10	44.139±0.537	115.2±1.399*

상기에서, 데이터는 평균±SEM이고, 대조군에 대한 %로서 표현되어 있으며, *는 대조군과 비교하여 p<0.05임을 나타낸다.

<3-4> 칼슘 축적 분석

세포가 90% 포화도에 도달하였을 때, 10 mM β-글리세로포스페이트 및 50 ㎍/㎖ 아스코르브산을 함유하는 배양 배지로 세포를 처리하여 시험관내 미네랄화를 개시하였다. 10일 후, 0.3% BSA와 개별적으로 상기 단리된 화합물을 함유하는 배지로 세포를 2일 동안 배양하였다. 수확시, 상기 세포를 70% 에탄올로 1시간 동안 고정한 후, 40 mM 알리자린 레드 S를 이용하여 10분 동안 부드럽게 교반하면서 염색하였다. 암소에서 15분 동안 일정하게 교반하면서 결합된 염료를 10% 세틸피리디눔 클로라이드 내에 용해시킴으로써 상기 염료를 정량하였다. 상기 용해된 염료의 흡광도를 561 ㎚에서 측정하였다. 모든 생체활성 테스트는 3회 수행하였다. 통계적인 유의성은 ANOVA 및 던넷 t 테스트(p<0.05)에 의해 결정하였고, 그 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 나타내었다.

그 결과, 산초의 정유는 미네랄화에 대한 현저한 자극 효과가 있었다. 특히, 10 ㎍/㎖ 농도의 산초의 정유에서는 대조군과 비교하여 상기 오일로 처리된 후에 대략 120%의 미네랄화 증가가 관찰되었다(표 4).

산초 정유(㎍/㎖)	광학 밀도	대조군에 대한 %
0	0.892±0.005	100±0.553
0.4	1.053±0.008	118.0±0.899*
2	1.013±0.010	113.6±1.140*
10	1.0743±0.016	120.4±1.813*

제조예 1: 산초의 정유을 포함하는 약학적 조성물의 제조

<1-1> 시럽제의 제조

산초의 정유을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 실시예 1에서 제조한 산초의 정유 분말, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

상기 시럽제의 구성 성분은 다음과 같다.

산초의 정유························· 2 g

사카린 ·························· 0.8 g

당···························· 25.4 g

글리세린 ························· 8.0 g

향미료·························· 0.04 g

에탄올 ·························· 4.0 g

소르브산 ························· 0.4 g

증류수··························· 정량

<1-2> 정제의 제조

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

산초의 정유 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 상기 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

산초의 정유························ 250 g

락토오스 ························ 175.9 g

감자전분 ························· 180 g

콜로이드성 규산 ······················ 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ························· 160 g

활석···························· 50 g

스테아르산 마그네슘····················· 5 g

제조예 2: 산초의 정유을 함유하는 건강식품의 제조

<2-1> 식품의 제조

산초의 정유을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

산초의 정유 20∼95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

산초의 정유 0.2∼1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

산초의 정유 0.5∼5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

산초의 정유 0.1∼5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

산초의 정유 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

산초의 정유 5∼10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 산초의 정유을 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 산초의 정유의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

산초의 정유의 건조분말(3 중량%),

영지(0.5 중량%),

지황(0.5 중량%)

<2-2> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

산초의 정유 1∼5%, 설탕 5∼10%, 구연산 0.05∼0.3%, 카라멜 0.005∼0.02%, 비타민 C 0.1∼1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79∼94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85∼98℃에서 20∼180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5∼0.82%를 주입하여 산초의 정유을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 산초의 정유(5%)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채주스의 제조

산초의 정유 5 g을 토마토 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

4. 과일주스의 제조

산초의 정유 1 g을 사과 또는 포도주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims

β-펠란드렌, 시트로넬랄, 게라닐 아세테이트, β-미르센, 시트로넬릴 아세테이트, 시트로넬롤, 크립톤, 리날룰, 쿠미놀, 노난산, α-테르피놀렌, 게라니알 및 피페리톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 함유하는 산초의 정유를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 산초의 정유는 증기 증류, 열수 증류, 유지흡착 추출, 용매 추출, 초임계유체 추출 및 압착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 제조되는 약학적 조성물.
삭제
β-펠란드렌, 시트로넬랄, 게라닐 아세테이트, β-미르센, 시트로넬릴 아세테이트, 시트로넬롤, 크립톤, 리날룰, 쿠미놀, 노난산, α-테르피놀렌, 게라니알 및 피페리톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 함유하는 산초의 정유를 유효성분으로 함유하는 골다공증 증상의 개선용 건강식품.
청구항 4에 있어서,
상기 산초의 정유는 증기 증류, 열수 증류, 유지흡착 추출, 용매 추출, 초임계유체 추출 및 압착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 제조되는 건강식품.
삭제