CN116421666B

CN116421666B - 一种抗骨质疏松的油脂组合物，其制备方法及应用

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Publication number: CN116421666B
Application number: CN202310373959.9A
Authority: CN
Inventors: 龙祥; 罗银平; 赵申飞; 徐娜; 陈小颖
Original assignee: Yunnan Decaitang Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Yunnan Decaitang Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2023-04-07
Filing date: 2023-04-07
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2043-04-07
Also published as: CN116421666A

Abstract

本发明公开了一种稳定高效抗骨质疏松的油脂组合物，由不饱和脂肪酸含量为70.5％～87.5％的花椒籽油250～280份、棕榈油酸含量为20％～30％的坚果精粹油200～220份、鼠尾草酸含量为10％～20％的脂溶性迷迭香提取物0.1～0.5份、辛癸酸甘油酯20～40份组成。本发明配方组成物质理化性质相似，采用水代法提取纯化制得花椒籽油、CO₂超临界精粹制得坚果精粹油后，通过自乳化技术制得，其制备方法简单，适于工业化生产。本发明所述的油脂组合物具有高稳定性，显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化、显著改善骨密度，具有抗骨质疏松功能，对人体无毒副作用，对骨骼健康有重大意义。

Description

一种抗骨质疏松的油脂组合物，其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及油脂组合物领域，尤其涉及一种抗骨质疏松的油脂组合物，其制备方法及应用。

背景技术

破骨细胞负责骨分解与吸收，成骨细胞负责新骨形成与生长。正常情况下，破骨细胞的骨吸收作用和成骨细胞的骨形成作用处于动态平衡状态，共同维持骨重建的稳态。当破骨细胞数量增加及其骨吸收活性增强时，会打破骨吸收和骨形成之间的动态平衡，这是导致骨质疏松的主要原因。因此，破骨细胞被认为是骨质疏松症新型治疗剂的可行靶标。

骨质疏松症是一种系统性骨骼疾病，其患病率随着年龄的增长而显著增加，全球老年人骨质疏松的患病率约为21.7％。骨质疏松的主要临床表现为疼痛、骨折、脊柱变形，其中，每年全球约有900万例骨质疏松性骨折发生，骨质疏松性骨折的发生风险在女性的范围(40％～50％)远高于男性(13％～22％)。鉴于骨质疏松和骨质疏松性骨折相关并发症的高发，骨质疏松已成为重大公共卫生挑战，并造成巨大的经济负担。目前，临床治疗骨质疏松主要为雌激素替代疗法和双膦酸盐补充剂治疗，但长期使用雌激素和双磷酸盐可能引起乳腺癌和颌骨坏死等潜在并发症，仍需关注其长期使用潜在的药物不良反应。因此，探寻更有效抗骨质疏松的天然健康品，已经成为了一项非常重要的工作。

本发明针对骨质疏松预防和治疗存在的问题和不足，开创性选用特定来源及质量控制的特定组成物质，采用本发明特定比例、特定制备技术方案制成油脂组合物，通过高稳定性、显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化、显著改善骨密度，从而实现稳定高效抗骨质疏松技术效果。其中：花椒籽油源自花椒果皮生产中的主要副产物——花椒籽，对开发利用花椒副产物、实现花椒全产业链开发应用具有重大意义；坚果精粹油源自澳洲坚果油、沙棘果油、猫屎瓜子油中的一种或几种，来源可及性高，对开发应用不饱和脂肪酸、大幅拉升所述油脂附加值提供了一条有效路径。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种抗骨质疏松的油脂组合物，其制备方法及应用。

本发明所述一种抗骨质疏松的油脂组合物及其制备方法，是采用以下技术方案来实现的：

首先，所述组合物按重量份计由不饱和脂肪酸含量为70.5％～87.5％的花椒籽油250～280份、棕榈油酸含量为20％～30％的坚果精粹油200～220份、鼠尾草酸含量为10％～20％的脂溶性迷迭香提取物0.1～0.5份、辛癸酸甘油酯20～40份，于真空度-0.06～-0.2Mpa、温度65℃～75℃、转速45r/min～70r/min下经自乳化制得；所述花椒籽油采用青椒籽、花椒籽中的一种或两种，经水代法提取精制制得；所述坚果精粹油采用澳洲坚果油、沙棘果油、猫屎瓜籽油中的一种或几种，经CO₂超临界精粹制得。

优选地，所述组合物按重量份计由不饱和脂肪酸含量为75.5％～87.5％的花椒籽油260～270份、棕榈油酸含量为23％～27％的坚果精粹油200～210份、鼠尾草酸含量为10％～15％的脂溶性迷迭香提取物0.1～0.3份、辛癸酸甘油酯20～35份，于真空度-0.08～-0.15Mpa、温度68℃～72℃、转速55r/min～65r/min下经自乳化制得。

本发明还提供了所述抗骨质疏松的油脂组合物的应用和用途，是采用以下技术方案来实现的：

首先，本发明提供的油脂组合物具有高稳定性，显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化、显著改善骨密度，具有抗骨质疏松功能，可用于药品、保健食品、功能性普通食品、特殊膳食食品中。

其次，本发明所述油脂组合物，添加或不添加药品、保健食品、功能性普通食品、特殊膳食食品可接受的辅料，进一步制成软胶囊、滴剂、丸剂、凝胶糖果。

本发明所述的油脂组合物具有以下技术效果：

(1)本发明制备的油脂组合物为废物再利用提供了新的解决方案，显著提高了花椒籽的开发利用率；

(2)本发明制备的油脂组合物，相较于组合前各组成物质，显著提高了体系及不饱和脂肪酸的稳定性；

(3)本发明制备的油脂组合物，相较于组合前各组成物质，显著抑制破骨细胞分化，促进成骨细胞形成，改善骨密度，实现高效抗骨质疏松的技术效果。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1为抑制RANKL诱导的破骨细胞分化活性评价试验不同组别样品施用后细胞TRAP染色镜检图。

0为空白对照组显微镜下细胞TRAP染色图；1为样品①施用后的显微镜下细胞TRAP染色图；2为样品②施用后的显微镜下细胞TRAP染色图；3为样品③施用后的显微镜下细胞TRAP染色图；4为样品④施用后的显微镜下细胞TRAP染色图；5为样品⑤施用后的显微镜下细胞TRAP染色图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来对本发明作进一步的说明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围，基于本发明教导所作的任何变化或替换，均属本发明保护范围。

实施例1组合物组成物质制备/准备

(1)花椒籽油

市购青椒籽，采用水代法提取、精制，制备得花椒籽油Ⅰ，经检测：不饱和脂肪酸含量为80.4％；

市购花椒籽，采用水代法提取、精制，制备得花椒籽油Ⅱ，经检测：不饱和脂肪酸含量为82.4％；

(2)坚果精粹油

市购澳洲坚果油，采用CO₂超临界萃取、精制，制备得坚果精粹油Ⅰ，经检测：不饱和脂肪酸含量为84.3％、棕榈油酸含量为25.7％；

市购沙棘果油，采用CO₂超临界萃取、精制，制备得坚果精粹油Ⅱ，经检测：不饱和脂肪酸含量为79.2％、棕榈油酸含量为29.7％；

(3)脂溶性迷迭香提取物

市购脂溶性迷迭香提取物标准产品2份，分别编号Ⅰ、Ⅱ，经检测：Ⅰ号样品鼠尾草酸含量为15％，Ⅱ号样品鼠尾草酸含量为25％；

(4)辛癸酸甘油酯：市购辛癸酸甘油酯食品级标准产品。

实施例2油脂组合物I制备

分别称取260g花椒籽油Ⅰ、200g坚果精粹油Ⅰ、30g辛癸酸甘油酯、0.1g脂溶性迷迭香提取物Ⅰ，于真空度-0.08Mpa、温度68℃、转速55r/min下经自乳化制得490g油脂组合物Ⅰ。

实施例3油脂组合物Ⅱ制备

分别称取5.3kg花椒籽油Ⅰ、4.1kg坚果精粹油Ⅰ、600g辛癸酸甘油酯、2.0g脂溶性迷迭香提取物Ⅰ，于真空度-0.10Mpa、温度70℃、转速60r/min下经自乳化制得10.0kg油脂组合物Ⅱ。

实施例4油脂组合物Ⅲ制备

分别称取270g花椒籽油Ⅱ、210g坚果精粹油Ⅱ、30g辛癸酸甘油酯、0.2g脂溶性迷迭香提取物Ⅰ，于真空度-0.15Mpa、温度72℃、转速65r/min下经自乳化制得510g油脂组合物Ⅲ。

实施例5油脂组合物Ⅳ制备

分别称取280g花椒籽油Ⅱ、220g坚果精粹油Ⅱ、30g辛癸酸甘油酯、0.4g脂溶性迷迭香提取物Ⅱ，于真空度-0.25Mpa、温度60℃、转速80r/min下自乳化制得530g油脂组合物Ⅳ。

实施例6软胶囊制备

取实施3制备的油脂组合物Ⅱ作为软胶囊内容物，以质量比明胶：甘油：水：PEG400为1:0.5:1:0.7制备囊皮，经溶胶、包囊、定型、干燥、抛光工艺制成500mg/粒软胶囊剂。

实施例7滴丸剂制备

取实施例3制备的油脂组合物Ⅱ，以PEG6000为基质、二甲基硅油300为冷凝剂，按质量比基质：油脂组合物Ⅱ为5:1，经熔融、混合、滴制、擦丸、选丸制成200mg/粒的滴丸剂。

实施例8凝胶糖果制备

取实施例3制备的油脂组合物Ⅱ，添加果葡糖浆、麦芽糊精、明胶、卡拉胶，经均质、乳化、冷凝、定型等工艺制成500mg/粒的凝胶糖果。

为了对本发明作进一步的说明，开展加速稳定性试验、抑制RANKL诱导的破骨细胞分化活性评价试验、对去势大鼠的骨密度影响评价试验并对结果进行比较，具体如下：

1、加速稳定性试验

试验样品及分组:选取实施例1制备的花椒籽油I、坚果精粹油I作为对照样品，分别编号①、②组；选取实施例3制备的油脂组合物Ⅱ、实施例5制备的油脂组合物Ⅳ为试验样品，分别编号③、④组。

试验方案设计：为考察本发明特定组成物物质及油脂组合物稳定性情况，本方案选选取植物油脂影响最显著的感官、不饱和脂肪酸含量作为稳定性考察指标开展稳定性试验。具体为：①、②、③、④组样品各100g,按原料药与制剂稳定性试验指导原则(《中国药典》2020版四部9001)，置于洁净密闭的透明玻璃瓶中，于温度为(40±2)℃、相对湿度为(75±5)％的条件下放置3个月，分别于0个月、1个月、2个月和3个月末取样，对各组样品进行感官指标、不饱和脂肪酸含量进行考察，结果见表1。

表1加速稳定性试验结果

试验结果：表1看出，在3个月的加速稳定性试验中，4组样品感官及不饱和脂肪酸含量组间变化差异明显。其中：样品①、样品②感官颜色、性状、气味出现明显变化，不饱和脂肪酸含量分别衰减了63.9％、68.4％；样品③感官颜色、性状、气味无明显变化，不饱和脂肪酸含量衰减了4.3％；样品④感官颜色、性状、气味变化较明显，不饱和脂肪酸含量衰减了30.2％。

试验结论：样品③(本发明制备的油脂组合物)稳定性显著高于样品①、②、④。

2、抑制RANKL诱导的破骨细胞分化活性评价试验

(1)试验材料及试剂

①RAW264.7小鼠单核巨噬细胞：破骨细胞前体细胞，本实验中用于产生由RANKL诱导的破骨细胞；

②核因子-κB受体激活因子配体RANKL(浓度50ng/ml):用于诱导RAW264.7向破骨细胞分化；

③β-雌二醇E2(浓度1×10^-7mol/L):阳性对照药物；

④抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色试剂盒；

⑤2.5％戊二醛、苏木素：用于细胞TRAP染色；

⑥10％胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、α-MEM完全培养基：用于RAW264.7细胞传代、培养、诱导；

⑦磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)；

⑧0.01％二甲亚砜(DMSO)；

⑨48孔细胞培养板。

(2)试验样品及分组

①阳性样品：β-雌二醇E2(浓度1×10^-7mol/L)，编号为①组；

②试样样品：选取实施例1制备的花椒籽油I、坚果精粹油I、实施例5制备的油脂组合物Ⅳ、实施例3制备的油脂组合物Ⅱ作为试验样品，编号依次为②、③、④、⑤组。

(3)试验步骤及方法

①RAW264.7细胞传代、培养

将RAW264.7细胞接种在含10％FBS的DEME培养基中,置于37℃、5％CO₂的细胞孵育箱中,每3天更换培养基,传代、培养3次，备用。

②孔板培养基制备、接种、分组、加样、培育

取48孔细胞培养板，每孔加入200μLα-MEM完全培养基质，每孔按4×10³个/ml密度接种步骤①传代、培养的RAW264.7细胞，孵育24h，每孔加入5μl0.01％DMSO、25ngRANKL后，将孔板均分为空白对照组、阳性对照组①、试验组②③④⑤共计6组，每组8孔。其中，空白对照组不加样品，其余阳性对照组、试验组每孔按“(2)试验样品及分组”取对应样品10μL依次加至板孔中，诱导、孵育96h。

③TRAP染色、镜检

取步骤(2)连续诱导、孵育96h的48孔板，去除每孔培养液，用PBS缓冲液洗1次，用2.5％的戊二醛固定6min,再用TRAP液37℃避光孵育1小时,PBS洗1分钟,然后用苏木素复染3-5分钟,PBS洗3分钟，于光学显微镜下观察，将具有3个以上细胞核的TRAP阳性多核细胞(TRAP+MNCs)计为成熟破骨细胞。

(4)试验结果

光学显微镜下具有3个以上细胞核的TRAP+MNCs(放大倍数，×100)显微图见1。图中编号0为空白对照组，1～5依次为施用阳性对照样品、花椒籽油I、坚果精粹油I、实施例5制备的油脂组合物Ⅳ、实施例3制备的油脂组合物Ⅱ样品后的显微镜下细胞TRAP染色图。

图1显示：与空白对照组比较，阳性对照组①可减少破骨细胞的数量，但效果不明显；与阳性对照组①比较，②、③、④、⑤组抑制由RANKL诱导的破骨细胞的分化的效果都有不同程度地提升，其中，⑤组破骨细胞数量最少，抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化的效果最显著。

试验结论：试验样品⑤(本发明制备的油脂组合物)可显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。

3、对去势大鼠骨密度的影响评价试实验

实验动物：3-4月龄的SD雌性大鼠，体重200-220g，于温度22±4℃、湿度65±5％、昼夜周期12h条件下适应性喂养1周；

实验仪器：Prodigy型DXA骨密度仪、电子天平。

造模：选取50只经适应性喂养的雌性SD大鼠，行双侧卵巢结扎摘除术，术后肌肉注射青霉素(80万单位，0.1mL/只)1次/天，连续6天，保持切口干燥并定期碘伏消毒至伤口完全愈合。

除正常组外，其余大鼠均于术后次晨(7:00－8:00)开始检查阴道上皮角化细胞的变化，1次/天，连续5天。左手抓取大鼠，右手利用无菌棉签进入阴道并轻旋棉签一圈后顺势轻退，迅速将沾阴道分泌物的棉签按同一方向置于滴有适量生理盐水的载玻片上，待其自然风干后滴加甲醇(以覆盖分泌物为适量)，自然风干，进行瑞氏染色，镜下观察阴道上皮角化细胞变化，以证明去势成功。

分组：造模过程中，有5只大鼠因术后意外死亡，其余45只大鼠去势成功。将去势成功的大鼠按照随机分组分为5组，每组9只，依次编号为②、③、④、⑤、⑥。其中：②组为模型组，③、④、⑤、⑥组为试验组；另选10只未行双侧卵巢结扎摘除术得SD雌性大鼠作为正常组、编号①。

剂量设计及喂养：正常组①、模型组②大鼠正常饲养。其余③、④、⑤、⑥组大鼠分别取实施例1制备的花椒籽油Ⅰ、坚果精粹油Ⅰ、实施例5制备的油脂组合物Ⅳ、实施例3制备的组合物Ⅱ样品，按照70kg成人日摄入量1g/d折算大鼠给样剂量0.48mg/d，于每天清晨分别灌胃给样，连续给样30d。

DXA双能射线骨密度测定、评价：去势8周后，各组别大鼠使用7％水合氯醛0.35mL/100g腹腔麻醉后，俯卧位于检测台上，脊柱拉直，进行全身双能射线DXA骨密度测定；大鼠处死后，解剖取出第2腰椎和右侧股骨，剔净软组织后分别进行骨密度测定，结果见表2。

表2各组大鼠全身、股骨、腰椎骨密度g/cm²

表2可知：与正常组①比较，模型组②大鼠各部位骨密度显著降低(P＜0.01)，表明造模成功；试验组③、④、⑤、⑥比较，试验⑥组大鼠各部位骨密度相较于③、④、⑤组显著改善(P＜0.01)。

试验结论：试验组⑥(本发明制备的油脂组合物)可显著改善骨密度。

综上，本发明特定技术方案制备的油脂组合物具有高稳定性，显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化、显著改善骨密度，有效抗骨质疏松。

Claims

1.一种抗骨质疏松的油脂组合物，其特征在于：所述组合物按重量份计由不饱和脂肪酸含量为70.5％～87.5％的花椒籽油250～280份、棕榈油酸含量为20％～30％的坚果精粹油200～220份、鼠尾草酸含量为10％～20％的脂溶性迷迭香提取物0.1～0.5份、辛癸酸甘油酯20～40份，于真空度-0.06～-0.2Mpa、温度65℃～75℃、转速45r/min～70r/min下经自乳化制得；所述花椒籽油采用青椒籽、花椒籽中的一种或两种，经水代法提取精制制得；所述坚果精粹油采用澳洲坚果油、沙棘果油、猫屎瓜籽油中的一种或几种，经CO₂超临界精粹制得；所述油脂组合物可显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化、显著改善骨密度。

2.一种如权利要求1所述的抗骨质疏松的油脂组合物，其特征在于：所述组合物按重量份计由不饱和脂肪酸含量为75.5％～87.5％的花椒籽油260～270份、棕榈油酸含量为23％～27％的坚果精粹油200～210份、鼠尾草酸含量为10％～15％的脂溶性迷迭香提取物0.1～0.3份、辛癸酸甘油酯20～35份，于真空度-0.08～-0.15Mpa、温度68℃～72℃、转速55r/min～65r/min下经自乳化制得。

3.一种如权利要求1-2任一项所述的抗骨质疏松的油脂组合物，其特征在于：所述组合物可用于药品、改善骨密度的保健食品中，添加或不添加药品、保健食品允许的辅料，进一步制成软胶囊、滴剂、丸剂、凝胶糖果。